牛FATP1基因5'側(cè)翼啟動子克隆及序列分析

龔婷 許厚強 陳偉 趙佳福 駱衡 陳祥 張勇

（1. 貴州大學 高原山地動物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點實驗室，貴陽 550025；2. 貴州大學 貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴陽 550025）

脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白1（Fatty acid transporter protein，F(xiàn)ATP1），全稱長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白1，又名SLC27a1（Solute carrier family 27 member 1），是脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白家族（Fatty acid transport family proteins，F(xiàn)ATPs）的一員。脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白家族目前已發(fā)現(xiàn)了6個亞型，即FATP1-FATP6［1］。不同亞型的FATP均含有311個高度保守的氨基酸信號序列和一段一磷酸腺苷（AMP）結(jié)合序列。大量研究證實FATPs的主要生理功能是促進長鏈和極長鏈脂肪酸進入細胞內(nèi)，并根據(jù)代謝需要較快地協(xié)調(diào)游離脂肪酸的攝取，從而間接影響脂質(zhì)分布與沉積，對動物肉質(zhì)的改良有著非常重要的意義［2］。

FATP1是該家族中發(fā)現(xiàn)最早的基因，主要分布在脂肪組織和肌肉組織中，其表達具有組織特異性［3］。該基因1994年首次在小鼠3T3-L1脂肪細胞中發(fā)現(xiàn)，并證實其參與長鏈脂肪酸的合成和脂肪代謝［4］。進一步研究表明，F(xiàn)ATP1基因引導(dǎo)外源性脂肪酸進入細胞，參與脂肪酸的攝入和酯化［5］。而且該基因在參與脂肪代謝的同時也參與能量代謝。2009年，Sebastian等［6］證 實，F(xiàn)ATP1基 因 與 線粒體相關(guān)且對肌肉細胞線粒體脂肪酸氧化起作用。Wiczer 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ATP1基因有調(diào)控三羧酸循環(huán)活性及線粒體代謝的功能。同年，Guitart 等［8］通過亞細胞成分免疫印跡和FATP1-GFP融合蛋白的免疫細胞學發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ATP1定位于線粒體中，并能提高丙酮酸脫氫酶的活性。Mitchell 等［9］轉(zhuǎn)染FATP1 siRNA與HEK293細胞，發(fā)現(xiàn)FATP1能夠調(diào)控心臟磷脂的重新合成。綜上所述，F(xiàn)ATP1基因是影響脂肪酸轉(zhuǎn)運代謝和能量代謝的關(guān)鍵因子。

目前對于牛FATP1基因的表達和分子機理方面的研究還不是很多，啟動子作為真核生物基因表達調(diào)控的順式作用元件，含有基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要信息，決定基因表達的強度及特異性［10］。因此，本研究從牛FATP1基因的啟動子入手，通過設(shè)計特異性引物進行PCR擴增牛FATP1基因2 164 bp的啟動子序列，將其產(chǎn)物與pMD19-T載體連接后，獲得含F(xiàn)ATP1基因啟動子序列的亞克隆載體，以期對后續(xù)研究牛FATP1基因特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

克隆所需載體pMD19-T vector、限制性內(nèi)切酶Kpn I、限制性內(nèi)切酶Xho I、T4 DNA ligase、質(zhì)粒DNA抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DL10000 Marker、DL2000 Marker均購自于TaKaRa（中國，大連）有限公司。其它的化學試劑均為國產(chǎn)分析純級別，而整個試驗采用Milli-Q超純水系統(tǒng)制成的超純水作為試驗用水。

本次研究所用關(guān)嶺牛血樣采于2011年12月17日貴州省安順市西秀區(qū)幺鋪鎮(zhèn)屠宰場。用作感受態(tài)的大腸桿菌JM109為本實驗室保存菌種。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中收錄的牛FATP1基因的mRNA （NM_001033625.2）與已經(jīng)公布的牛基因組Blast比對，下載獲得相應(yīng)的啟動子序列并利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物。上游引物5'-GGGGTACCGCATCCCCACTCAACTAATAC-3'，下游引物5'-CCGCTCGAGCCACAG AGTCCTTTATTTGC-3'，帶下劃線的序列為引入的兩個帶保護堿基的酶切位點Kpn I和Xho I位點。用這對引物擴增2 164 bp （-1969-+194 bp）的5'側(cè)翼序列，以轉(zhuǎn)錄起始點為0，以上為負，以下為正。引物合成由上海捷瑞生物工程有限公司（中國，上海）完成。

1.2.2 PCR擴增 從血液中提取關(guān)嶺牛的基因組DNA，以關(guān)嶺牛的基因組DNA為模板進行擴增。PCR總反應(yīng)體系為25 μL，其中模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O補至25 μL。擴增條件：94℃預(yù)變性 4 min；94℃變性40 s、64℃退火50 s、72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，用1.0%瓊脂糖凝電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.2.3 擴增產(chǎn)物的克隆及測序 用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，再將其與pMD19-T載體16℃連接過夜后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109中，然后涂布于含有氨芐青霉素的LB瓊脂糖平板上培養(yǎng)16 h，挑取單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃ 200 r/min，培養(yǎng)12 h后提取質(zhì)粒，進行酶切和PCR雙重鑒定。選取陽性克隆進行測序，測序于TaKaRa（中國，大連）有限公司完成。將測定的結(jié)果與NCBI登錄的牛FATP1基因啟動子序列（NM_214286.1） 進行比對分析，以確定克隆結(jié)果。

1.2.4 啟動子的序列分析及預(yù)測 利用網(wǎng)站W(wǎng)eb Promote Scan Service （Bioinformatics and Molecular Analysis Section，Dan Prestridge）和Neural Network Promoter Prediction （Berkeley Drosophila Genome Project，M.G. Reese）預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始位點［11］；使用在線分析軟件TFSEARCH （Parallel Application TRC Laboratory，RWCP，Japan）和PROMO （Algorithms and Data Structures for Information，Retrival，Dom enec Farre）預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點；應(yīng)用VISTA （Genomics Division of Lawrence Berkeley National Laboratory and US Department of Energy Joint Genome Institute，Pachter Lior）軟件進物種間序列比對，再用DNASTAR （DNSSTAR Software Company，F(xiàn)rederick Blattner）中 Megalign 程序進行進化樹構(gòu)建［12］。同時收集相關(guān)啟子轉(zhuǎn)錄調(diào)控位點研究的文獻，綜合多方面信息判定牛FATP1基因5'側(cè)翼區(qū)最具可能性的啟動子序列。

2 結(jié)果

2.1 牛FATP1基因5'側(cè)翼啟動子序列的擴增

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，出現(xiàn)單一的目的條帶，片段大小為2 164 bp與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。

2.2 陽性克隆的雙酶切和PCR檢測

將氨芐抗性篩選的陽性克隆子雙酶切，經(jīng)電泳檢測后，出現(xiàn)兩條明顯條帶，T載體為2 692 bp，目的片段為2 164 bp（圖2），片段大小與預(yù)期相一致。克隆載體PCR檢測結(jié)果（圖3），出現(xiàn)單一的目的條帶，與預(yù)期相符初步判定T載體克隆成功，可以送予生物公司測序。

2.3 啟動子測序結(jié)果Blast比對

利用NCBI網(wǎng)站上提供的Blast Sequences將測序結(jié)果（圖4）和?；蚪M進行對比分析（圖5），結(jié)果表明兩序列100%一致，說明牛FATP1基因5'端2 164 bp大小片段的克隆載體已構(gòu)建成功，可進行后續(xù)試驗。

圖1 目的條帶PCR擴增圖

圖2 promoter-T載體雙酶切驗證

圖3 promoter-T載體PCR驗證

圖4 啟動子克隆載體的測序結(jié)果

2.4 牛FATP1啟動子序列分析

2.4.1 啟動子轉(zhuǎn)錄起始點預(yù)測 利用軟件Promoter Scan和Neural Network Promoter Prediction對牛FATP1基因2 164 bp 5'側(cè)翼啟動子序列進行生物信息學分析（圖6）發(fā)現(xiàn)，分別在-1 912 bp、-1 412 bp、-1 132 bp、-211 bp位置預(yù)測到轉(zhuǎn)錄起始點（Transcription start sites，TSS），且發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在類似的TATA-box和多個CAAT-box與GC-box。

圖5 啟動子克隆測序結(jié)果的blast比對

2.4.2 啟動子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預(yù)測 利用網(wǎng)站TESS （Transcriptional factor search system）和在線生物軟件Promo （ALGGEN）與TFSEARCH （Parallel Application TRC Laboratory，RWCP，Japan）對牛FATP1基因5'側(cè)翼區(qū)序列進行綜合分析，預(yù)測潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在2 164 bp （-1 969 bp-+164 bp）范圍內(nèi)存在豐富的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，如甾醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白（Sterol regulatory elementbinding protein，SREBP ） 、CCAAT增強子結(jié)合蛋白β（Enhancer binding protein β，C/EBP-β） 、糖皮質(zhì)激素受體α（Glucocorticoid receptor α，GR-α）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（Peroxisomal proliferatoractivated receptor alpha，PAR-α） 、激活增強子結(jié)合蛋白2α（Activating enhancer binding protein 2 alpha，AP-2αA） 、特異性轉(zhuǎn)化因子（Transformation-specific，c-Ets-1）、B細胞特異性激活蛋白（B-cell lineage specific activator，Pax-5）、TATA結(jié)合蛋白（TATAbinding protein，TBP）、垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子1（Pituitary specific transcription factor 1，POU1F1） 等40個轉(zhuǎn)錄因子，詳見表1。

表1 牛FATP1基因啟動子區(qū)域潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測

圖7 不同物種FATP1基因5'側(cè)翼區(qū)的序列比對

2.4.3 不同物種FATP1基因5'側(cè)翼區(qū)序列比對和進化樹構(gòu)建 對不同物種FATP1基因5'側(cè)翼區(qū)序列進行序列比對，結(jié)果如圖7所示。不同物種FATP1基因的轉(zhuǎn)錄起始點上游-263 bp- -174 bp區(qū)域保守性較強，同源序列主要集中在轉(zhuǎn)錄起始點上游-578 bp--93 bp區(qū)域，其中牛與人、大鼠、小鼠、狗同源性分別為74.1%、71.1%、72.0%、62.8%，在該區(qū)域中未發(fā)現(xiàn)與斑馬魚的同源序列。利用DNASTAR中的Megalign程序進行進化樹構(gòu)建，結(jié)果如圖8所示，其中小鼠和褐家鼠聚為一類，再與牛聚為一類，再與人聚為一類，然后與豬聚為一類，再與狗聚為一類，最后與斑馬魚聚合。該進化樹真實反應(yīng)了物種間序列保守性和進化關(guān)系。

3 討論

基因啟動子區(qū)域在基因的表達調(diào)控過程中發(fā)揮著重要的作用，各種轉(zhuǎn)錄因子能夠識別基因5'調(diào)控區(qū)的特異位點并與之作用，調(diào)控基因的表達。目前關(guān)于FATP1基因表達調(diào)控研究表明，F(xiàn)ATP1主要受過氧化物酶體增生物激活受體（PPARs）、激素（研究較多的是胰島素）、細胞因子等多種物質(zhì)調(diào)控，與其他調(diào)節(jié)因子共同調(diào)節(jié)長鏈脂肪酸的轉(zhuǎn)運，維持機體穩(wěn)態(tài)［13］。很多研究都指出在小鼠的肝臟和腫瘤細胞中過氧化物增殖酶體及其受體（PPAR）對FATP1起到一個正調(diào)控的作用［14，15］。該基因上游區(qū)域-474 bp- -458 bp存在功能性過氧化物酶體增生物激活受體（PPARs）反應(yīng)元件且能被PPARα和PPARγ激活物上調(diào)［16］。有關(guān)研究表明，胰島素在脂肪細胞中負向調(diào)控FATP1的表達［17，19］。胰島素對FATP1調(diào)控快速、可逆，主要通過定位于-1 353 bp和-1 347 bp的順式磷酸烯醇丙酮酸羧基酶類似元件［20］，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控成熟脂肪細胞中FATP1基因的表達。因此，研究該基因的轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)合位點間的相互作用是認識轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的關(guān)鍵所在。

圖8 FATP1基因啟動子區(qū)域系統(tǒng)進化樹

本研究利用啟動子在線分析軟件研究了牛FATP1基因5'側(cè)翼區(qū)的各種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的分布情況，找到了4個轉(zhuǎn)錄起始位點和40個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。一些多次出現(xiàn)且分值較高的轉(zhuǎn)錄因子包括AP-2αA、C/EBP-β、C/EBP-α、GR-α、RXR-α和Pax-5等，可能對調(diào)節(jié)FATP1基因的調(diào)控起著至關(guān)重要的作用。近年來，有關(guān)AP-2α在調(diào)控脂肪細胞成熟和脂肪因子分泌的研究表明，AP-2α表達的下調(diào)，是啟動脂肪細胞分化的重要環(huán)節(jié)之一。AP-2α可與脂肪細胞分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活因子C/EBP-α基因結(jié)合，調(diào)控C/EBP-α基因轉(zhuǎn)錄活性，C/EBP-α基因表達增加顯著促進前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化［21］。RXR-α作為配體激活型轉(zhuǎn)錄因子，能與PPARγ形成二聚體促進小鼠前脂肪細胞分化［22］。最近研究表明，RXR-α具有促進豬前體脂細胞分化和抑制豬前體脂肪細胞凋亡的作用［23］。而Pax-5對B淋巴細胞的定向分化發(fā)育起著重要作用，它通過調(diào)節(jié)組蛋白的甲基化、乙?；揎?，調(diào)控B淋巴細胞特異性基因表達，從而實現(xiàn)B細胞定向分化發(fā)育［24］。所以這些多次出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的區(qū)域更有可能是啟動子區(qū)。同時還有一些單次出現(xiàn)，且分數(shù)較高的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，包括PPAR-α （-360 bp- -349 bp）、NFI/CTF （-190 bp- -182 bp）、NF-kappaB1 （-275 bp- -267 bp）等，它們參與調(diào)節(jié)基因的復(fù)制和表達，對動物的生長調(diào)控起著重要作用［25，26］。所以研究基因的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點對于啟動子的定位意義重大。

4 結(jié)論

牛與人、小鼠、大鼠、狗的FATP1基因5'側(cè)翼區(qū)同源性分別為74.1%、71.1%、72.0%、62.8%。并且牛與人、小鼠和大鼠在FATP1基因5'側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)錄起始點上游-263 bp- -174 bp區(qū)域保守性較強，同源序列主要集中在轉(zhuǎn)錄起始點上游-578 bp- -93 bp區(qū)域。在FATP1基因5'側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)錄起始點上游-263 bp- -174 bp區(qū)域，牛與人、小鼠、大鼠有共同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和翻譯方面具有共同的作用，所以可能是啟動子的核心區(qū)域。

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