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    香蕉泛素結(jié)合酶基因MaUCE2在非生物脅迫下的表達(dá)分析

    2013-12-23 05:12:24王安邦金志強(qiáng)劉菊華賈彩紅張建斌苗紅霞徐碧玉
    生物技術(shù)通報(bào) 2013年5期
    關(guān)鍵詞:泛素擬南芥香蕉

    王安邦 金志強(qiáng) 劉菊華 賈彩紅 張建斌 苗紅霞 徐碧玉,

    (1. 海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院,???571101;2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院??趯?shí)驗(yàn)站 香蕉研究所,???571101;3. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所,???571101)

    植物固著生長(zhǎng)的特性使其在生長(zhǎng)發(fā)育過程中不可避免地與外界環(huán)境有著密切的關(guān)聯(lián)[1]。當(dāng)面臨逆境脅迫時(shí),植物必須能夠應(yīng)對(duì)這些逆境才能存活[2-4]。逆境脅迫下,細(xì)胞產(chǎn)生各種異常的或受損的蛋白質(zhì),這些異常蛋白如果在細(xì)胞內(nèi)積累過多,會(huì)影響細(xì)胞的各種代謝,從而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性[5]。泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)是目前已知的最重要、有高度選擇性的蛋白質(zhì)降解途徑[6],它通過調(diào)節(jié)功能蛋白質(zhì)的周轉(zhuǎn)(turnover)或降解不正常蛋白,實(shí)現(xiàn)對(duì)多種代謝過程的調(diào)節(jié)[7]。該途徑的關(guān)鍵酶主要包括泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme,E1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2)和泛素-蛋白連接 酶(ubiquitin-protein ligating enzyme,E3)[8]。其中E2是種類豐富的酶系,更是連接E1和E3的橋梁[9],對(duì)泛素化修飾的特異性和精確時(shí)空性起關(guān)鍵作用[10]。

    植物E2蛋白基因(LeUBC1)首次從番茄cDNA文庫中分離,并且受熱激和重金屬誘導(dǎo)表達(dá)增強(qiáng)[11],說明E2蛋白基因在發(fā)生脅迫時(shí)可能參與細(xì)胞異常蛋白的降解過程。徐晨曦等[12]從檉柳中獲得E2基因,轉(zhuǎn)入煙草中異源表達(dá)發(fā)現(xiàn)該基因能明顯提高煙草的耐旱性。Cui等[13]發(fā)現(xiàn)擬南芥泛素結(jié)合酶UBC32定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,參與異常蛋白質(zhì)降解過程,可以提高擬南芥的耐鹽性。從馬鈴薯[14]和大豆中[15]也克隆到E2基因,轉(zhuǎn)入擬南芥后可提高擬南芥的抗鹽性和耐旱性。近年來,對(duì)E2基因功能研究盡管也取得了一定進(jìn)展,但相對(duì)緩慢[16],而且關(guān)于香蕉泛素結(jié)合酶基因與植物的抗逆性關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。

    香蕉喜高溫,怕低溫,生長(zhǎng)期對(duì)水分需求量大,因而溫度和水分是香蕉分布的主要限制因子。然而,由于全球異常氣候的增多,香蕉處于高溫、低溫、干旱、鹽堿、風(fēng)害等逆境的時(shí)間也增多,這嚴(yán)重影響了香蕉產(chǎn)量并制約著香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[17],因此香蕉抗逆性研究顯得尤為重要。

    李羽佳等[18]從香蕉根系均一化全長(zhǎng)cDNA 文庫中克隆了一個(gè)香蕉泛素結(jié)合酶基因,命名為MaUCE2,經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因有典型的保守催化結(jié)構(gòu)域,內(nèi)含有一個(gè)高度保守的半胱氨酸(cysteine)酶活性位點(diǎn)[7,16]。為了進(jìn)一步研究該基因與非生物脅迫的關(guān)系,本研究利用實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)技術(shù)探究MaUCE2基因在干旱、鹽、低溫等非生物脅迫下的表達(dá)特性,旨在為研究E2基因生物學(xué)功能及其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    供試材料為巴西蕉(Musa acuminata L. AAA group,‘Brazilian’),采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)熱帶生物技術(shù)研究所香蕉種植園。

    1.2 方法

    1.2.1 香蕉MaUCE2熒光定量表達(dá)分析 采用李燕強(qiáng)等[19]改良的CTAB法提取香蕉總RNA。每個(gè)樣品取1 μL檢測(cè)RNA質(zhì)量和濃度后,利用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa公司)合成cDNA鏈。

    選用NCBI上已登錄的香蕉MaActin 片段為內(nèi)參,引物序列根據(jù)已登錄序列進(jìn)行設(shè)計(jì),MaActin 1(5'-CGAGGCTCAATCAAAGA-3')和MaActin 2(5'-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3')。MaUCE2 引物序列為MaUCE2-1(5'-CAAGACCGACAGAGCCAAGT-3')和MaUCE2-2 (5'-CCTTAGGTGGTTTGAATGG-3')。使用儀器為Mx3000P(Stratagene,USA),PCR反應(yīng)體系為25 μL,PCR 產(chǎn)物的長(zhǎng)度為232 bp。熒光定量PCR 的反應(yīng)程序如下:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性7 s,55℃退火15 s,72℃延伸20 s,循環(huán)40次。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3 次。

    1.2.2 MaUCE2在不同外源脅迫下的表達(dá)特性分析

    1.2.2.1 香蕉植株的干旱脅迫處理 參照張麗麗等[20]香蕉干旱處理的方法,選取長(zhǎng)勢(shì)一致、生長(zhǎng)健壯的香蕉組培苗,分為4組,每組3株,測(cè)定每組各盆中土壤水分含量并保持一致。第1組不做任何處理,作為對(duì)照,使土壤相對(duì)含水量保持在75%-80%;第2組低度失水干旱脅迫,使土壤相對(duì)含水量保持在55%-60%;第3組中度失水干旱脅迫,使土壤相對(duì)含水量保持在45%-50%;第4組高度失水干旱脅迫,使土壤相對(duì)含水量保持在30%-35%。每組香蕉組培苗置于人工恒溫氣候箱中培養(yǎng),測(cè)定各盆中土壤水分含量,當(dāng)達(dá)到脅迫程度后,立即取每株組培苗根部液氮速凍,提取RNA。

    1.2.2.2 香蕉植株的鹽脅迫處理 選取長(zhǎng)勢(shì)一致、生長(zhǎng)健壯的香蕉組培苗進(jìn)行水培養(yǎng),在培養(yǎng)液(1/2Hoagland培養(yǎng)液)中加入200 mmol/L NaCl進(jìn)行鹽脅迫處理。分別于0、2、4、6和8 h分別觀察和取樣,將株苗根部立即用液氮速凍,提取RNA。

    1.2.2.3 香蕉植株的低溫脅迫處理 選取長(zhǎng)勢(shì)一致、生長(zhǎng)健壯的香蕉組培苗,分為5組,每組3株,置于人工恒溫氣候箱中培養(yǎng)。第1組溫度設(shè)為28℃,作為對(duì)照,第2組到第5組分別置于15℃、10℃、7℃、5℃溫度下2 h進(jìn)行低溫脅迫,當(dāng)達(dá)到脅迫時(shí)間后,液氮速凍,提取RNA。

    2 結(jié)果

    如圖1所示,通過實(shí)時(shí)定量PCR分析發(fā)現(xiàn),干旱處理可以誘導(dǎo)MaUCE2的表達(dá),其表達(dá)量隨著干旱程度的加重而逐步上升。在高度干旱脅迫下處理下MaUCE2的表達(dá)量最高,為2.32,分別為低度干旱脅迫和中度干旱脅迫時(shí)期誘導(dǎo)的表達(dá)量的2.11倍和1.25倍。

    圖1 不同程度水分脅迫下MaUCE2的表達(dá)

    如圖2所示,高鹽脅迫處理下的MaUCE2的表達(dá)量隨NaCl處理時(shí)間的增加而略有升高,在脅迫6 h時(shí)最高,為1.26。處理2 h、4 h和8 h誘導(dǎo)MaUCE2的表達(dá)量分別為1.11、1.13和0.98,與對(duì)照差異不大。

    圖2 NaCl脅迫不同時(shí)間下MaUCE2的表達(dá)

    如圖3所示,低溫脅迫可以誘導(dǎo)MaUCE2的表達(dá),其表達(dá)量隨著溫度的降低而逐步升高,當(dāng)溫度降低到5℃時(shí),MaUCE2的表達(dá)量最高,為4.08。溫度為15℃和10℃時(shí)誘導(dǎo)MaUCE2的表達(dá)量為1.26和1.18,與對(duì)照差異不大。

    圖3 不同程度低溫脅迫下MaUCE2的表達(dá)

    3 討論

    逆境脅迫下,細(xì)胞產(chǎn)生各種異常的或受損的蛋白質(zhì),這些異常蛋白如果在細(xì)胞內(nèi)積累過多,會(huì)影響細(xì)胞的各種代謝,從而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性,而這些異常蛋白絕大部分是通過泛素-蛋白酶體途徑被降解,因此,泛素-蛋白酶體途徑中關(guān)鍵酶的大量表達(dá)與植物抗逆性的獲得有著密切的關(guān)系,而泛素結(jié)合酶E2在E1和E3之間穿梭往返運(yùn)行,具有結(jié)合并轉(zhuǎn)移泛素到靶蛋白的作用,對(duì)泛素化修飾的特異性和精確時(shí)空性起關(guān)鍵作用。

    干旱脅迫是導(dǎo)致導(dǎo)致作物減產(chǎn)的最主要原因[1,21],因此,有關(guān)植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫反應(yīng)的研究顯得極為迫切和重要。本研究結(jié)果顯示干旱脅迫后MaUCE2表達(dá)量顯著提高,說明干旱處理可以誘導(dǎo)MaUCE2的表達(dá)。該結(jié)果與前人[12,14,15]研究結(jié)果相一致,而且本研究發(fā)現(xiàn)MaUCE2的表達(dá)量在高度干旱脅迫下表達(dá)量最高,這可能與高度干旱脅迫下細(xì)胞異常蛋白迅速增加有關(guān)。

    Zhou等[15]克隆了馬鈴薯泛素結(jié)合酶基因GmUBC2,異源表達(dá)發(fā)現(xiàn)該基因能明顯提高擬南芥的耐鹽性。在鹽脅迫下該基因在擬南芥根中表達(dá)與對(duì)照差異不明顯。本研究結(jié)果顯示鹽脅迫后MaUCE2表達(dá)量略有上升,最高時(shí)是對(duì)照的1.26倍,然后基本恢復(fù)到正常水平,與對(duì)照差異也不明顯。

    低溫脅迫下,MaUCE2表達(dá)量在溫度為15℃、10℃時(shí)上升不明顯,而溫度低到7℃和5℃時(shí)該基因表達(dá)量迅速上升,在5℃時(shí)表達(dá)量最大,是對(duì)照的4.08倍。這可以與植物適宜生長(zhǎng)溫度的范圍有關(guān),有研究表明當(dāng)溫度小于8℃時(shí)香蕉苗開始受到寒害[22],因此當(dāng)溫度低于8℃后細(xì)胞產(chǎn)生各種異常的或受損的蛋白質(zhì)增多,導(dǎo)致MaUCE2表達(dá)量迅速增高。

    目前大多數(shù)植物的泛素結(jié)合酶蛋白功能的研究還處于起步階段,因此從不同植物中克隆及研究泛素結(jié)合酶功能顯得尤為重要。本研究初步驗(yàn)證了香蕉泛素結(jié)合酶基因MaUCE2在植物抗逆過程中可能起著重要作用,但MaUCE2在植物抗逆過程中具體的功能和機(jī)制尚需深入研究。

    4 結(jié)論

    在鹽、低溫和干旱脅迫下,香蕉泛素結(jié)合酶基因MaUCE2表達(dá)量發(fā)生明顯變化,表明香蕉中的泛素結(jié)合酶基因具有響應(yīng)非生物脅迫能力,可能在香蕉適應(yīng)逆境中發(fā)揮重要作用。

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