ACECM取向支架——軟骨組織工程的新時代

摘要：關(guān)節(jié)軟骨是無血管結(jié)構(gòu)并且受傷的軟骨不能自我修復，從而導致關(guān)節(jié)疼痛和關(guān)節(jié)失穩(wěn)，并最終導致關(guān)節(jié)置換。因此，研究者把軟骨組織的再生和修復工程作為一種很有前途的方法。在本文中，我們回顧了的正常結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)節(jié)軟骨，軟骨損傷的修復方法，軟骨組織工程的臨床技術(shù)的歷史。最后，我們得出的結(jié)論是ACECM取向支架移植技術(shù)可能會取代基質(zhì)誘導的自體軟骨細胞移植（MACI），越來越多的患者會從這項技術(shù)中受益。

關(guān)鍵詞：ACECM取向支架；ACI；CACI；MACI

關(guān)節(jié)軟骨作為一個具有高度特異性的組織，當處于正常狀態(tài)時，其表面較為光滑且呈現(xiàn)乳白色，邊緣整齊[1-4]。據(jù)影像學觀察可見，關(guān)節(jié)軟骨常分為固有層與表層，而成人關(guān)節(jié)軟骨除了的固有層還可進行劃分，主要分為表層、移行層、輻射層及軟骨基質(zhì)鈣化層四層，其次為骨組織。有相關(guān)學者認為軟骨下骨板為一種處于鈣化層與軟骨下的骨組織，在人體中起到支撐作用的同時，還可幫助完成營養(yǎng)在骨髓腔與軟骨之間的交換工作。而軟骨基質(zhì)的組成成分不僅包括蛋白多及膠原纖維，更需要的大量的水分，除此之外，軟骨基質(zhì)中還包含了無機鹽、脂肪等物質(zhì)的存在。

由于軟骨組織的特殊性，其組織構(gòu)成明顯區(qū)別于其他的骨組織。即軟骨組織內(nèi)不存在血管、神經(jīng)及淋巴管。而幼年及成年以后關(guān)節(jié)軟骨獲得營養(yǎng)的途徑也大不相同，即幼年時期的關(guān)節(jié)軟骨可由軟骨下通路獲得部分營養(yǎng)，但在成年之后，于軟骨下獲取營養(yǎng)的通路再也無法發(fā)揮其作用，而是關(guān)節(jié)腔內(nèi)的滑液通過關(guān)節(jié)活動產(chǎn)生的壓力變化壓迫其余軟骨基質(zhì)之間進行交換[5]。因此，軟骨軟骨的自我修復能力較差。軟骨損傷修復的方法有很多，典型的非細胞移植修復方法主要以下3種。

1鉆孔微骨折法

鉆孔微骨折法是通過克氏針或微骨折尖錐在軟骨損傷區(qū)鉆孔至軟骨下骨， 使軟骨下骨的骨髓細胞、軟骨源性和骨源性細胞滲透到損傷區(qū)產(chǎn)生纖維軟骨予以修復。由于這種方法操作簡單， 對于小面積軟骨損傷治療結(jié)果比較滿意， 因此在臨床上被廣泛應用。Kreuz等[6]研究表明， 微骨折是一種短期療效較好的治療關(guān)節(jié)軟骨損傷的微創(chuàng)技術(shù)， 但從術(shù)后18個月開始， 療效明顯退化[7-8]，術(shù)后采用組織學進行觀察，結(jié)果顯示，微骨折修復因以I型膠原為主的纖維軟骨組織，其生物強度較弱，不能正常滿足患者的生理需求，導致應用透明軟骨修復軟骨缺損的效果較差，無法達到令人滿意的程度。因此，纖維軟骨不能滿足長時間關(guān)節(jié)軟骨的需要。

2自體骨軟骨移植

自體骨軟骨移植主要原理是用自體非承重部位骨軟骨填塞軟骨受損面以達到彌補受損平面的目的，此移植過程不僅能通過關(guān)節(jié)切開來完成，還可借助關(guān)節(jié)鏡以達到治愈目的兩種。自體骨軟骨移植的優(yōu)勢在于通過移植可以使透明軟骨而不是纖維軟骨修復骨軟骨缺損。因為非負重面軟骨來源有限，自體骨軟骨移植主要應用于小到中等的全厚骨軟骨缺損病例（直徑2.5 mm內(nèi)） 中并且軟骨下骨深度最好不超過6 mm。自體骨軟骨移植修復關(guān)節(jié)軟骨缺損療效確切[9]。有報道采用多個軟骨片移植技術(shù)修復大面積軟骨缺損， 稱為\"馬賽克鑲嵌成型術(shù)\"， 軟骨鑲嵌式移植術(shù)作為治療軟骨缺損的新方法之一[10]。自體骨-軟骨移植與其他方法相比， 具有取材方便、植入穩(wěn)定、愈合成活率高及關(guān)節(jié)軟骨修復能力強等優(yōu)點，自體骨軟骨移植不存在移植物成活及排斥反應的問題，但受到材料來源的限制和大移植塊形合度不能滿足，仍不能廣泛應 用[11]。

3同種異體骨軟骨移植

同種異體骨軟骨移植同樣可作為一項治療骨軟骨缺損的方法，主要是指選擇合適的供體以獲得合適的移植物，來進行骨軟骨異體移植。此種方法的臨床優(yōu)勢較為顯著，表現(xiàn)為一次性的將大面積的骨軟骨缺損進行修復。同種異體骨軟骨移植可獲得與損傷區(qū)完全匹配的骨軟骨， 具有與損傷區(qū)軟骨相似的生物學特性， 在組織的面積匹配上有更加廣泛的選擇， 避免了供區(qū)繼發(fā)損傷[12]。異體軟骨移植供體材料獲得相對容易，且可制成所需要的大小及形狀，因此，具有較為廣泛的應用范圍。但據(jù)大量研究表明，此種方法可在一定程度上誘發(fā)傳染的出現(xiàn)，危險性較高[13]。而誘發(fā)高傳染風險的原因主要與軟骨內(nèi)缺乏免疫細胞有關(guān)。另外，由于胞外基質(zhì)在外將軟骨細胞包繞，完整的基質(zhì)可限制免疫反應對周圍正常關(guān)節(jié)軟骨的作用，故軟骨移植引發(fā)的排異反應相對較輕。但是，移植物滅菌，來源受限和費用昂貴也限制了異體骨軟骨移植的應 用[14]。隨著復雜關(guān)節(jié)損傷發(fā)生率及致殘率顯著增加，上述軟骨損傷的修復方法是修復關(guān)節(jié)病損的常用臨床方法之一，但由于其在復雜的關(guān)節(jié)損傷修復中有極大的限制及其致殘率明顯的增加，已經(jīng)不能很好的滿足臨床需求。然而組織工程技術(shù)制備具有成軟骨活性的人工軟骨， 為軟骨缺損的完全修復帶來了契機。

4關(guān)節(jié)軟骨組織工程典型的三代技術(shù)

關(guān)節(jié)軟骨組織工程[15]是旨在針對關(guān)節(jié)軟骨組織再生的熱點項目。20世紀90年代初的軟骨組織工程推出以來，該技術(shù)已應用于臨床治療超過20年，它經(jīng)歷了典型的三代技術(shù)。

4.1第一代的細胞治療軟骨缺損的技術(shù)是自體軟骨細胞移植（ACI）技術(shù)，它是由Peterson在1989年[16]首先應用并由瑞典團隊在1994年[17]報道。的ACI的主要特征[18-21]是兩個步驟的外科手術(shù)。的第一個步驟是，從關(guān)節(jié)非承重位點的收集軟骨，然后通過6 w的細胞體外擴增來收獲軟骨細胞。第二個步驟是再植體外擴增的自體軟骨細胞到擴大在軟骨缺損部位（這個缺損部位由自體骨膜縫合和纖維蛋白膠密封，并注射自體軟骨細胞的懸浮液在其內(nèi)）。ACI導致顯著的改善關(guān)節(jié)功能，減少癥狀，并生成透明狀軟骨組織。但是該技術(shù)較復雜需要較長時間的術(shù)后康復鍛煉，關(guān)節(jié)切開損傷嚴重，同時可伴有關(guān)節(jié)纖維化的或僵硬等情況的發(fā)生，并發(fā)癥發(fā)生率較高。據(jù)相關(guān)調(diào)查資料顯示，術(shù)后3～7個月有10%～25%的患者發(fā)生骨膜肥大等情況，需再次手術(shù)進行治療，甚至有作者報道有42%的再次手術(shù)發(fā)生率，細胞培養(yǎng)技術(shù)的復雜性也限制該技術(shù)使用并且細胞培養(yǎng)基混合物也不能保證細胞分布均勻和防止細胞流失[21-22]。這些軟骨組織已被證明是纖維軟骨的，并且它們是不能再生的天然的軟骨結(jié)構(gòu)及其不具有相關(guān)的生物力學特性。

4.2第二代細胞療法是膠原蛋白覆蓋的自體培養(yǎng)軟骨細胞移植（CACI）[23-28]，本技術(shù)還采用了懸浮培養(yǎng)的軟骨細胞，并得到類似ACI的臨床癥狀明顯改善。但CACI有2個優(yōu)點，即縫合物在是Ⅰ/Ⅲ型膠原膜而不是自體骨膜，且在植入關(guān)節(jié)軟骨缺損前軟骨細胞已經(jīng)接種在膠原生物膜（基質(zhì)誘導ACI）上。這樣大大減少了并發(fā)癥少。然而，這種技術(shù)仍然需要在軟骨缺損處的縫合技術(shù)。

4.3第三代細胞療法是基質(zhì)誘導的自體軟骨細胞移植（MACI○R[29-33]。MACI○R是Matrix-induced Autologolus Chondrocytes Implantation的英文縮寫，即基質(zhì)誘導的自體軟骨細胞移植技術(shù)，用于修復創(chuàng)傷或剝脫性軟骨炎導致的關(guān)節(jié)軟骨缺損，以修復膝關(guān)節(jié)為主，修復對象主要為15～55歲的患者。MACI○R移植物由美國健贊公司負責培養(yǎng)，其將擴增后的自體軟骨細胞（超過1000萬個）種植在純化可以吸收的豬的衍生I/III型膠原膜上（ACI-MaixTM， 4 cm×5 cm大?。?，每平方厘米種植有500000～1000000個具有活性的軟骨細胞。軟骨細胞根據(jù)標準流程由細胞外基質(zhì)的活檢標本中分離，體外擴大培養(yǎng)約4 w（15～20百萬個細胞），并接種到可吸收的純化I型/ III型膠原蛋白膜上。 MACI植入物由外科醫(yī)生植入軟骨缺損。MACI○R從活檢取樣到移植過程分為以下4個步驟。

4.3.1活檢取樣 從健康非負重部位獲得少量軟骨組織（大約200 mg）?；顧z取樣前應準備好健贊公司專用的活檢運輸套裝盒。

4.3.2細胞培養(yǎng) 從活檢軟骨中分離軟骨細胞并進行體外擴增。所有細胞培養(yǎng)過程都應該在符合GMP標準的實驗室進行。活檢細胞可以被冷藏保存，直到移植確定時間，即可進行下一步操作，把擴增的細胞種植在ACI-MaixTM。

4.3.3細胞種植 將培養(yǎng)后的自體軟骨細胞種植到膠原膜上。成品包裝運輸前2～4 d將軟骨細胞種植到ACI-MaixTM上。種植細胞時應標記膜的細胞面，以利于手術(shù)時細胞面向下移植。

4.3.4手術(shù)植入 將種植了軟骨細胞的膠原膜移植到患者的軟骨缺損部位。成品準備時間盡可能接近手術(shù)時間，并且裝有MACI○R移植物的圓盒應一直放在密封的運輸箱中，維持6℃～30℃，直到移植。手術(shù)時清除軟骨缺損處所有纖維軟骨和軟骨殘留物直到暴露軟骨下層，缺損周圍應為正常健康厚度的軟骨，且保證缺損處無血跡；制作合適缺損大小的模板；采用無菌操作將MACI○R從原包裝盒取出；根據(jù)模板將MACI○R剪成正好適合缺損的大小和形狀；將修剪好的MACI○R膜片反轉(zhuǎn)，將細胞面向下；將一薄層纖維蛋白粘合劑涂在缺損底部，將MACI○R膜片植入缺損處，確保細胞面向下，正對軟骨下骨，輕壓膜片使之固定。

第三代細胞療法仍然采用了可生物降解的I/III型膠原膜。然而，在MACI○R，自體軟骨細胞的直接\"種植\"到I/III型膠原膜的表面上，并用纖維蛋白膠粘帖到軟骨缺損處，而不是注射軟骨細胞到膠原膜下的軟骨缺損處。同時，在手術(shù)過程中，此膜通過貼附于損傷區(qū)域，以達到顯著的治愈目的，且避免了另外選取骨膜的情況出現(xiàn)，從而從根本上減少了相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。而據(jù)大量研究表明，MACI還具有以下優(yōu)點：①手術(shù)簡單創(chuàng)口?。篗ACI與傳統(tǒng)ACI相比，避免采用人工挖取自體骨膜瓣，為患者縮短了治療時間，同時減輕的痛苦。所借助的手段是采用MACI膜片代替骨膜瓣，具有創(chuàng)口小，對周圍組織損傷范圍小，手術(shù)時間較短（通常短于30 min）等優(yōu)點[34]；②手術(shù)過程中具有較高的成功率[35-36]：由于采用自體骨膜瓣對術(shù)后創(chuàng)口封蓋，傳統(tǒng)ACI在第一次手術(shù)后易形成手術(shù)處骨膜肥大，影響了患者的預后，常需進行第二次手術(shù)以達到臨床治愈目的。而在MACI操作過程中，所采用MACI膜可直接于缺損處貼合，因此，在一般情況下無需進行第二次手術(shù)；③恢復時間短： MACI采用膜片對軟骨細胞進行附著固定，較為牢固，加速了新細胞的生長和繁殖，而患者在恢復期中出現(xiàn)手術(shù)部位二次損傷的風險也大大降低；④修復效果好：對大量患者術(shù)后跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)，較之傳統(tǒng) ACI，MACI術(shù)后生成的軟骨與周圍軟骨相似度較高。MACI○R過程克服了縫合技術(shù)的缺點并且獲得了良好的臨床結(jié)果[34，36]。然而，大多數(shù)這些細胞載體材料研究缺乏固有軟骨支架的類似結(jié)構(gòu)的和他們明顯不同的生理，生化的成分。因此，這些材料不能在細胞密度和增殖率明顯顯示優(yōu)越性[37]。有一項研究表明，細胞種植在4種不同的膠原膜， 細胞增殖率在II型膠原膜最高[38]。在研究細胞凋亡的實驗中，細胞接種于Ⅰ/Ⅲ型膠原膜細胞凋亡率超過II膠原膜[39]。

以上三代組織工程技術(shù)可促進關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復， 可不同程度減輕患者的癥狀， 但大部分的修復組織為透明軟骨， 缺乏關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)成分、機械特性和耐久性， 最終發(fā)生退變。繼而，第四代軟骨組織工程的出現(xiàn)為軟骨損傷帶來了新的契機，因為其彌補了以上三代技術(shù)的不足。第四代細胞療法是關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)（ACECM）取向支架誘導的自體軟骨細胞移植。天然軟骨組織的細胞外基質(zhì)具有與功能相適應的獨特的結(jié)構(gòu)特性：膠原纖維在軟骨的表面呈平行排列，深部為排列成柱狀的拱形結(jié)構(gòu)，其獨特的結(jié)構(gòu)使其具有良好的修復能力及其可以承受壓縮應力的特點。軟骨細胞外基質(zhì)材料基本保留了天然關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)的成分，能為種子細胞提供一個有利的生化環(huán)境，利于種子細胞的識別、黏附、增殖及分化[40]。在取向支架上軟骨細胞能均勻廣泛的分布在支架內(nèi)部，且隨著支架的孔道取向性而排列呈柱狀結(jié)構(gòu)，類似于天然軟骨組織的柱狀結(jié)構(gòu)。取向支架為一類較理想的軟骨組織工程支架，具有定向取向的孔道結(jié)構(gòu)，類似于天然關(guān)節(jié)軟骨的柱狀排列結(jié)構(gòu)，各類特性均可滿足軟骨組織工程的需要，具有較高的應用價值。在自體骨髓基質(zhì)干細胞復合關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)源性取向支架修復羊膝關(guān)節(jié)負重區(qū)軟骨缺損的實驗中， 自體骨髓基質(zhì)細胞復合關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)源性取向支架組修復的羊膝關(guān)節(jié)全層軟骨缺損效果良好。且大部分接近正常軟骨組織。此外， 在部分人體應用中（尚未發(fā)表）， 長期隨訪效果良好。

5結(jié)論

總之，根據(jù)理想軟骨組織工程的要求， ACECM取向支架已經(jīng)成為第四代的軟骨缺損修復產(chǎn)品，帶領(lǐng)軟骨組織工程修復軟骨損傷進入了一個新時代，越來越多的患者會從此項技術(shù)中受益。

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編輯/張燕