細(xì)胞凋亡檢測方法的研究進(jìn)展

摘要：本文綜述了細(xì)胞凋亡的各種檢測方法的原理及應(yīng)用范圍，并分析了各自的優(yōu)點(diǎn)及局限性。應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞凋亡檢測方法進(jìn)行綜合檢測，得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞凋亡；檢測方法；分析評(píng)價(jià)

細(xì)胞凋亡（apoptosis）是細(xì)胞在一定的生理或病理狀態(tài)下，遵循自身的程序，自己結(jié)束自己生命的過程。細(xì)胞凋亡不受到外部損傷因素直接導(dǎo)致的被動(dòng)改變而屬機(jī)體自身的生理活動(dòng)，是由基因控制的、高度有序的細(xì)胞主動(dòng)死亡過程，即程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death，PCD）[1]。它貫穿從受精、發(fā)育、成熟、衰老的整個(gè)生命過程，近年來一直是生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域各專業(yè)的研究熱點(diǎn)。隨著研究細(xì)胞凋亡的方法不斷涌現(xiàn)和深入，分析手段日趨完善和成熟?，F(xiàn)將細(xì)胞凋亡檢測方法歸納如下。

1 形態(tài)學(xué)檢測

細(xì)胞凋亡是形態(tài)學(xué)名稱，其特征性改變包括細(xì)胞漿固縮、體積縮小、細(xì)胞皺縮以及細(xì)胞核致密等。一般認(rèn)為形態(tài)學(xué)變化是判斷有無細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)[2]。根據(jù)凋亡細(xì)胞固有形態(tài)特征，人們?cè)O(shè)計(jì)了多種不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法，常用的有：普通顯微鏡觀察、熒光顯微鏡觀察、共聚焦激光掃描顯微鏡觀察、透射電子顯微鏡規(guī)察。普通光學(xué)顯微鏡只可以觀察到細(xì)胞凋亡的大體形態(tài)胞膜起泡現(xiàn)象和凋亡小體。但凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化大多發(fā)生在超微結(jié)構(gòu)，因此用光鏡觀察難以令人滿意。通過電鏡可以觀察到有典型的凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，其特征是細(xì)胞核體積縮小，染色質(zhì)濃縮致密，并沿核膜分布形成新月體狀，細(xì)胞膜微絨毛消失，但細(xì)胞漿內(nèi)的各種細(xì)胞器基本正常。凋亡細(xì)胞的典型形態(tài)改變?cè)谕干潆婄R下能夠得到最佳的體現(xiàn)，為凋亡細(xì)胞判定提供了最可靠的依據(jù)。電鏡檢測細(xì)胞凋亡的缺點(diǎn)是：只能定性，不能定量；樣本制作處理過程復(fù)雜，設(shè)備相對(duì)昂貴，對(duì)檢查者的技術(shù)水平要求較高[3-4]。

2 DNA片段化檢測

2.1 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測法 細(xì)胞凋亡時(shí)，DNA在內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的作用下.在核小體間被切割成180～200 bp整數(shù)倍的單核苷酸片段。DNA裂解是標(biāo)志細(xì)胞最終走向死亡的不可逆的重要過程。正?；罴?xì)胞的DNA凝膠電泳為一條區(qū)帶；而當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)，由于DNA被裂解成單核小體和寡聚核小體，電泳時(shí)呈現(xiàn)特征性的\"階梯狀\"（1adder）條帶；而壞死細(xì)胞的DNA斷裂為無特征的雜亂片斷，利用此特征，既可確定細(xì)胞的凋亡，又可與壞死細(xì)胞區(qū)別。因此DNA凝膠電泳一度被認(rèn)為是判定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)之一[5]。這種檢測方法簡便宜行，成本低。但缺乏定位性特征，靈敏性不高，但在作群體細(xì)胞凋亡分析時(shí)具有一定意義。本方法被廣泛應(yīng)用于作群體細(xì)胞凋亡分析中[6]。

2.2 EILSA法分析組蛋白 細(xì)胞凋亡的發(fā)生，是由于鈣-鎂依賴性核酸酶進(jìn)入核小體間切割DNA，產(chǎn)生180bp～200bp或其倍數(shù)的核小體片段。而核小體由于與組蛋白H2A、H2B、H3和H4形成緊密復(fù)合物而不被核酸內(nèi)切酶切割。采用雙抗體夾心酶免疫法，應(yīng)用小鼠抗DNA和抗組蛋白的單克隆抗體，與核小體片段形成夾心結(jié)構(gòu)，可特異性檢測細(xì)胞溶解物中的核小體片段。此法具有需要設(shè)備簡單.敏感性高，所需細(xì)胞個(gè)數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)。其缺點(diǎn)是不能精確測定凋亡發(fā)生絕對(duì)量和提供細(xì)胞的組織學(xué)定位。試驗(yàn)過程中如果裂解細(xì)胞的時(shí)間過長可能導(dǎo)致細(xì)胞核中的DNA片段也被計(jì)算在內(nèi)，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)果偏高，因此不同的細(xì)胞系需要經(jīng)過數(shù)次摸索才能確定最佳檢測條件[7]。

2.3 DNA片段原位標(biāo)記法

2.3.1.原位缺口轉(zhuǎn)移（in situ nick-translation，ISNT）技術(shù) 細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，核酸內(nèi)切酶在DNA分子中導(dǎo)入切口，DNA多聚酶在切口部位表達(dá)外切酶活性，使核苷酸自5'向3'方向切去；同時(shí)以切口部位末端核苷酸的3'一OH為引物，利用DNA多聚酶I的聚合活性將未標(biāo)記的核苷酸用標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行置換，切口沿DNA分子移動(dòng)，同時(shí)水解5'末端，以修復(fù)DNA原位切口平移技術(shù)將標(biāo)記的核苷酸引入凋亡細(xì)胞的DNA，據(jù)此可檢測凋亡細(xì)胞。

3 流式細(xì)胞儀檢測法

流式細(xì)胞儀（FCM）是將流體噴射技術(shù)、激光光學(xué)技術(shù)、電子技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)等集為一體，用于細(xì)胞定量分析和進(jìn)行細(xì)胞分類研究的工具。此方法系通過熒光素如PI、hoechst 等親DNA的特性，分析懸浮細(xì)胞中DNA 含量的直方圖來判斷細(xì)胞凋亡。①PI 染色法：凋亡細(xì)胞經(jīng)PI 染色、流式細(xì)胞儀檢測，在正常細(xì)胞G1期的峰前增加1個(gè)特異性亞二倍體峰（sub-G1峰）俗稱\"凋亡峰\"。通過FCM測定DNA的含量還可以研究凋亡細(xì)胞的周期特異性。此方法的優(yōu)點(diǎn)是可定量檢測，靈敏度高。缺點(diǎn)是不能觀察S期和G2期凋亡的細(xì)胞，不能區(qū)別壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。②Hoechst-PI法：此法可克服PI 法的不足。hoechst被活細(xì)胞攝取后與DNA結(jié)合呈藍(lán)色熒光；PI使壞死細(xì)胞呈紅色熒光。因此，在直方圖上可根據(jù)紅藍(lán)兩種熒光判斷3種細(xì)胞：正常細(xì)胞呈弱藍(lán)、弱紅光；凋亡細(xì)胞呈強(qiáng)藍(lán)、弱紅光；壞死細(xì)胞呈弱藍(lán)、強(qiáng)紅光[9]。③Annexin V/PI法：在細(xì)胞凋亡早期位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（Ps）遷移至細(xì)胞膜外側(cè)。PS發(fā)生的變化即外露早于DNA斷裂，早于染色質(zhì)凝集及凋亡小體的形成，外露后成為免疫系統(tǒng)識(shí)別的標(biāo)志，能與高親和力的鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白Annexin V結(jié)合，將Annexin V進(jìn)行熒光素（FITC、PE、ECFP）標(biāo)記可以檢測細(xì)胞凋亡，是最敏感的指標(biāo)之一，但壞死細(xì)胞Ps亦暴露于外表使Annexin V結(jié)合陽性，因此使用Annexin V這一參數(shù)不能區(qū)分壞死或凋亡，必須同時(shí)結(jié)合PI進(jìn)行凋亡細(xì)胞雙染后用流式細(xì)胞儀即可將凋亡細(xì)胞以及壞死細(xì)胞區(qū)分開來。結(jié)果判斷正?；罴?xì)胞Anmxin-V、PI均低染；凋亡細(xì)胞Anmedn-V高染、PI低染；壞死細(xì)胞Anmxin-V、PI均高染。利用Annexin V/PI法，是目前檢測細(xì)胞凋亡最理想的方法。

4 細(xì)胞凋亡相關(guān)物質(zhì)的檢測

4.1 酶學(xué)檢測

4.1.1 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspases-3）活性檢測 細(xì)胞凋亡過程中有許多蛋白酶參與并相互協(xié)調(diào)以促進(jìn)凋亡的發(fā)生。在凋亡的起始和執(zhí)行過程中起關(guān)鍵作用的是半胱胺酸天冬氨酸酶（Caspases）。大多數(shù)凋亡都涉及Caspase-3的活化，它是關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行分子.Caspase-3正常以酶原的形式存在于胞漿中，在凋亡早期階段被激活它通過分解去除DNA酶的一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)亞基而問接使之活化，實(shí)現(xiàn)了DNA的片段化，最終發(fā)生細(xì)胞凋亡。常采用熒光分光光度計(jì)檢測其活性。因活化的Caspase-3能夠特異切割DIE2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵，故設(shè)計(jì)出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac_DEVDAMC。短肽被水解后釋放出的AMC能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC熒光強(qiáng)度大小，可測定Caspase-3活性，從而反映Caspase-3的活化度，以判斷細(xì)胞凋亡程度[10]。

4.1.2 乙酰膽堿酯酶 乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）是主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)的一種水解酶，其經(jīng)典功能是水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿從而終止神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞[11]。張學(xué)軍等[12 ]發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿在細(xì)胞凋亡追蹤起重要作用，他們以人肺成纖維細(xì)胞株、NIH/3T3小鼠、HEL、PC-3和牛肉皮細(xì)胞等為材料，用衰老凋亡或化療藥物誘導(dǎo)法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，綜合流式細(xì)胞術(shù)、DNA電泳、形態(tài)學(xué)及TUNEL等方法檢測凋亡細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)各類細(xì)胞在正常狀態(tài)下無AchE活性反應(yīng)。一旦發(fā)生凋亡，均具有AchE活性反應(yīng)，從而建立了這一檢測凋亡細(xì)胞的新方法[13]。酶學(xué)檢測簡單、快速、方便，適合大量培養(yǎng)細(xì)胞的凋亡檢測，但不能定量和定位。

4.2 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因水平的檢測 在細(xì)胞凋亡時(shí)有些基因表達(dá)異常，檢測這些特異基因的表達(dá)水平也成為檢測細(xì)胞凋亡的一種常用方法。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)as蛋白結(jié)合受體后形成死亡介導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（DISC），能誘導(dǎo)癌細(xì)胞中的細(xì)胞毒性T細(xì)胞等靶細(xì)胞調(diào)亡[14]。Bcl-2和Bcl-XL作為抗凋亡的調(diào)節(jié)物，它們的表達(dá)水平比例決定細(xì)胞是凋亡還是存活[15]。現(xiàn)多采用Northern雜交和RT-PCR對(duì)它們進(jìn)行檢測，隨著近年來熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展，用定量PCR來檢測基因表達(dá)水平較前者更快更準(zhǔn)確。

總之，目前檢測細(xì)胞凋亡的方法很多，但都有其自身的優(yōu)點(diǎn)和局限性。應(yīng)充分了解各種檢測方法的原理及應(yīng)用范圍，根據(jù)標(biāo)本綜合選擇幾種適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行檢測，常可得到較準(zhǔn)確結(jié)果。在進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測的時(shí)候，要幾種方法進(jìn)行檢測，避免使用單一方法。例如：電鏡觀察仍是確定凋亡的最具權(quán)威的標(biāo)準(zhǔn).因此在凋亡定量控測之前應(yīng)先行電鏡觀察定性；PI染色流式細(xì)胞檢測法漏檢率及錯(cuò)檢率均高.不適于凋亡定量觀察.但其方法簡便、價(jià)廉，適用于大批標(biāo)本的篩選預(yù)試驗(yàn)；TUNEL法是目前最常用的凋亡檢測技術(shù).為避免壞死細(xì)胞的影響，應(yīng)先用熒光鏡檢以保證TUNEL染色細(xì)胞不存在壞死細(xì)胞，否則應(yīng)另選其它檢測方法。

綜上所述，只有幾種不同的檢測方法進(jìn)行綜合檢測得到的結(jié)果，才能真正的反映細(xì)胞發(fā)生凋亡的情況，進(jìn)而準(zhǔn)確的對(duì)其凋亡進(jìn)行定性和定量判定。相信伴隨著人類對(duì)凋亡機(jī)制更加深入的了解，操作簡單、敏感性高、成本低廉的細(xì)胞凋亡檢測方法會(huì)越來越多，也將對(duì)基礎(chǔ)細(xì)胞生物學(xué)，生物醫(yī)學(xué)及臨床某些疾病的診斷及治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

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