纖維素降解固氮芽孢桿菌的篩選和鑒定

陶樹興，郭 賢，梁 健，柴 霞，張娟妮，魏園媛，馮曉磊

（陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062）

化肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最基礎(chǔ)而且是最重要的物質(zhì)投入，是提高土壤肥力和作物單位面積產(chǎn)量的重要措施.據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（UAO）統(tǒng)計，化肥在對農(nóng)作物增產(chǎn)的總份額中約占40%～60%［1］.近年來隨著化肥的長期使用和使用量的增加，其增產(chǎn)效應(yīng)并未相應(yīng)增加，且大量使用化肥所帶來的土壤板結(jié)、肥力退化、污染環(huán)境等負(fù)效應(yīng)也日益明顯［2］.農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，需要提倡使用有機(jī)肥和其他新型肥料［3－4］.生物固氮是固氮微生物將大氣中的氮還原成氨的過程，將固氮微生物菌劑施入土壤，可提高土壤氮素含量，促進(jìn)作物生長.微生物肥料起作用的是活的微生物，其效率取決于菌種的特性和產(chǎn)品中活菌的數(shù)量.我國微生物菌劑國家標(biāo)準(zhǔn)對活菌數(shù)和保質(zhì)期有明確規(guī)定.國內(nèi)現(xiàn)已進(jìn)行產(chǎn)品登記的自生固氮菌肥料，生產(chǎn)菌種一般都使用圓褐固氮菌（Azotobacterchrooccum），該菌株不產(chǎn)生芽孢，易失活，產(chǎn)品保存期短.芽孢桿菌具有容易培養(yǎng)、抗逆性強(qiáng)、存活期長等優(yōu)點，篩選能固氮的芽孢桿菌作為生物固氮菌劑的菌種已受到重視［5－6］.固氮微生物將氮氣還原成氨要消耗大量的三磷酸腺苷（ATP），對自生固氮菌來說，ATP主要來源于糖類物質(zhì)的生物氧化［7］.由于圓褐固氮菌等自生固氮微生物不能降解纖維素，土壤中單糖、淀粉等糖類的含量有限，使固氮微生物的生長和固氮效率受到限制，直接影響固氮菌劑作用的發(fā)揮.作物的殘留物和施入土壤的有機(jī)肥含有大量的纖維素，能為利用纖維素的固氮微生物提供所需的碳源和能源，篩選兼具固氮能力與纖維素降解能力的芽孢桿菌，作為生產(chǎn)固氮菌肥料的菌種和進(jìn)一步研究的實驗菌株，為固氮微生物的研究和應(yīng)用提供了另一種思路.

1 材料和方法

1.1 對照菌株

圓褐固氮菌（Azotobacterchrooccum）10098，由中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心提供.

1.2 培養(yǎng)基

纖維素?zé)o氮培養(yǎng)基（g/L）:微晶纖維素20，磷酸氫二鉀0.4，硫酸鎂0.4，氯化鈉0.4，硫酸鈣0.4，碳酸鈣10，硫酸錳0.02，硫酸亞鐵0.02，1%鉬酸鈉溶液1mL/L，1%硼酸溶液1mL/L，固體培養(yǎng)基加瓊脂20g，pH 值為7.2～7.4，121℃高壓蒸汽滅菌30min.測定固氮效率時用葡萄糖代替微晶纖維素，113℃高壓蒸汽滅菌30min.

1.3 固氮芽孢桿菌的分離與純化

1.3.1 土壤樣品的采集 從陜西省長安、三原、戶縣、銅川、勉縣、南鄭、洛川、延安，山西省晉城、大同、交城，山東省煙臺，湖北省武漢等地的小麥、玉米、果樹、蔬菜等根際，共采集土壤樣品24份，樣品用滅菌牛皮紙袋包裝.

1.3.2 富集培養(yǎng) 稱5g土樣放入滅菌過的裝有玻璃珠和45mL無菌水的三角瓶中，然后在160 r/min、28℃振蕩30min.取上述土壤懸液各5mL分別轉(zhuǎn)入微晶纖維素?zé)o氮液體培養(yǎng)基中，在160 r/min、28℃振蕩培養(yǎng)4d.重復(fù)上述操作一次，完成第二次富集培養(yǎng).

1.3.3 固氮芽孢桿菌的分離純化 吸取5mL增殖培養(yǎng)后的菌液接入45mL含玻璃珠的無菌水中，160r/min振蕩30min得10－1菌懸液，置80℃水浴10min，依次做10倍系列稀釋至10－6.每個稀釋度取0.1mL菌懸液涂布在微晶纖維素?zé)o氮固體培養(yǎng)基分離平板上，28℃培養(yǎng)4d，選取不同特征且直徑較大的菌落再用平板劃線法進(jìn)行分離純化.

1.4 菌株生長量的測定

將2mL菌液接入48mL液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3d，用顯微鏡直接計數(shù)選出生長速度快的菌株，再用平板菌落計數(shù)測定液體培養(yǎng)物的生長量［8］.

1.5 纖維素酶活性測定

將培養(yǎng)3d的發(fā)酵液于4 500r/min離心15 min，上清液即為粗酶液，以pH值為7.2的磷酸緩沖液配制微晶纖維素，經(jīng)160r/min振蕩24h濕磨，將濕磨過的底物與粗酶液混合，在32℃保溫30 min（依據(jù)反應(yīng)初速度確定），用DNS法測定還原糖的生成量［9］，纖維素酶活力單位（U）定義為32℃，pH值為7.2條件下反應(yīng)30min，每毫升酶液每秒鐘產(chǎn)生的葡萄糖的mol數(shù)表示.

1.6 固氮效率的測定

將2mL菌液接入48mL葡萄糖無氮液體培養(yǎng)基中，28℃、160r/min振蕩培養(yǎng)3d.用DNS法測定剩余葡萄糖的含量［9］，微量凱氏定氮法測定含氮量［10］.固氮效率以每消耗1g葡萄糖所固定的氮量（mg）表示.

1.7 黃瓜盆栽試驗

選取大小一致的津優(yōu)40號黃瓜種子用無菌水浸泡18h后播種于育苗杯中，每杯播1粒種子，待真葉長到兩葉一心時進(jìn)行移栽.移栽塑料花盆直徑25cm，高17cm，每盆裝耕作土壤1 500g，每盆移栽1株，每個處理重復(fù)3盆，置溫室內(nèi)培養(yǎng).黃瓜幼苗移栽1d后進(jìn)行處理，每盆澆50mL不同液體，生長期間每隔10d按同法澆施一次，20d和30d后分別拍照，收獲植株，測定植株高度、生物量、含氮量等.

盆栽試驗共設(shè)8個處理:（1）無菌水對照（CK1）；（2）纖維素?zé)o氮液體培養(yǎng)基對照（CK2）；（3）化學(xué)氮肥對照（CK3），成分為（g/L）:尿素 0.12g，Na2HPO4·12H2O 0.15g，MgSO4·7H2O 0.12 g，檸檬酸鐵0.005g，CaCl2·2H2O 0.1g，KH2PO40.1g，Gibson微量元素液1mL，H2O 1000mL，pH6.5～7.0.Gibson微量元素液成分:H3BO32.86 g，ZnSO4·7H2O 0.22g，GuSO4·5H2O 0.08g，MnSO4·4H2O 2.03g，Na2Mo4·2H2O 1.26g，H2O 1000mL；（4）陽性對照菌株圓褐固氮菌10098菌液（CK4）；（5）固氮芽孢桿菌 AX31菌液；（6）固氮芽孢桿菌BX31菌液；（7）固氮芽孢桿菌CX21菌液；（8）固氮芽孢桿菌DX23菌液.

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計分析軟件完成.

1.9 菌種鑒定

1.9.1 形態(tài)學(xué)觀察 將固氮芽孢桿菌涂布于以微晶纖維素為碳源的無氮培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48～72 h，觀察記錄菌落形狀、大小、顏色、邊緣、表面光滑度等.用常規(guī)制片法和染色法觀察細(xì)胞的形狀、大小、兩端形狀、細(xì)胞排列方式、莢膜、芽孢及位置等.

1.9.2 生理生化測定 參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［11］和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》［12］.

1.9.3 16SrDNA序列分析與系統(tǒng)學(xué)分析 16S rDNA基因序列分析由上海生工生物工程有限公司完成；基因比對采用美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST在線完成，系統(tǒng)學(xué)分析建樹采用軟件MEGA 4完成.

2 結(jié)果分析

2.1 利用纖維素的固氮芽孢桿菌的篩選

2.1.1 利用纖維素的固氮芽孢桿菌的分離 從24個土壤樣品中共分離到42株利用微晶纖維素的固氮芽孢桿菌菌株，其中編號為AX31、BX31、CX21和DX23的4株生長較快，在微晶纖維素?zé)o氮液體培養(yǎng)基中，28℃160r/min振蕩培養(yǎng)72h菌數(shù)可達(dá)到1×109個/mL（cfu）以上.

2.1.2 4株固氮芽孢桿菌的纖維素酶活性和固氮效率 4株利用纖維素的固氮芽孢桿菌的纖維素酶活性和固氮效率見表1，以圓褐固氮菌10098作為對照菌株，表中數(shù)據(jù)為3個重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差.

表1 4株固氮芽孢桿菌的纖維素酶活性和固氮效率＊Tab.1 Cellulase activity and N fixation efficiency of 4nitrogen-fixing bacilli

通過方差分析及LSD法多重比較顯示，4株固氮芽孢桿菌中，菌株CX21的纖維素酶活性顯著高于AX31、BX31和DX23（P＜0.01）.菌株 DX23纖維素酶活性較低，菌株AX31和BX31纖維素酶活性差異不顯著（P＞0.05）.菌株CX21的固氮效率最高，與其他3個菌株之間差異極顯著（P＜0.01），其固氮效率與對照菌株10098相當(dāng).

2.1.3 4株固氮芽孢桿菌對黃瓜生長的影響 澆施利用纖維素的固氮芽孢桿菌CX21的菌液后，黃瓜植株長勢明顯比對照CK1、CK2和AX31、BX31、DX23好，植株高，葉片大.植物生物產(chǎn)量和全氮含量與化學(xué)氮肥處理CK3和對照菌株10098相當(dāng)，差異不顯著（P＞0.05）（表2）.

2.2 固氮芽孢桿菌CX21的鑒定

從菌體生長、纖維素酶活性、固氮效率和黃瓜盆栽試驗結(jié)果可以確定，固氮芽孢桿菌CX21是一株有潛在應(yīng)用價值的固氮芽孢桿菌菌株.

表2 固氮芽孢桿菌對黃瓜生長和植株總含氮量的影響Tab.2 The effect of nitrogen-fixing bacilli on cucumber plant′s growth and total nitrogen content

2.2.1 固氮芽孢桿菌CX21的形態(tài)學(xué)觀察 固氮芽孢桿菌菌株CX21在無氮培養(yǎng)基平板上菌落圓形，邊緣整齊，無色透明，光滑有光澤，呈半粒水珠狀，粘稠有彈性，挑起時可拉成絲（圖1a）.菌體桿狀，大小為0.79～1.3μm×2.5～5.2μm，革蘭氏染色為陽性（圖1b）；菌體外有很肥厚的莢膜（圖1c）；培養(yǎng)3d后菌體內(nèi)形成芽孢，芽孢位于菌體中央，橢圓形，直徑不大于菌體寬度（圖1d）.

2.2.2 固氮芽孢桿菌CX21的生理生化特征 固氮芽孢桿菌CX21能利用葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露醇等為碳源，不能利用木糖、核糖；最適培養(yǎng)溫度為28～30℃，NaCl濃度高于1.0%時生長受抑制；接觸酶反應(yīng)為陽性，液化明膠，水解淀粉，使石蕊褪色，牛奶胨化；氧化酶試驗、V-P反應(yīng)、卵磷脂酶、硝酸鹽還原、甲基紅、檸檬酸鹽利用均為陰性.

圖1 菌株CX21形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Morphological characteristics of strain CX21

2.2.3 固氮芽孢桿菌CX21的16SrDNA序列分析 測序得到的固氮芽孢桿菌CX21的16SrDNA序列的長度為1 460bp，將序列經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST在線比對，結(jié)果顯示固氮芽孢桿菌CX21與Paenibacillusmucilaginosu（登陸號JF810844.1）的同源性達(dá)到99%以上.從GenBank中調(diào)取與CX21同源性較高的10株菌株的16SrDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖2），結(jié)果顯示CX21在進(jìn)化樹中與Paenibacillusmucilaginosu的同源關(guān)系最近.根據(jù)固氮芽孢桿菌CX21的形態(tài)特征、生理生化特性和16SrDNA序列分析，參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和相關(guān)膠質(zhì)類芽孢桿菌的研究［13－15］，將篩選到的利用纖維素的固氮芽孢桿菌菌株CX21鑒定為膠質(zhì)類芽孢桿菌Paenibacillusmucilaginosus.

圖2 固氮芽孢桿菌CX21系統(tǒng)學(xué)分析Fig.2 Phylogenetic tree of nitrogen-fixing bacillus CX21

3 討論

微生物肥料起作用的是活的微生物，其效率取決于菌種的特性和產(chǎn)品中活菌的數(shù)量.圓褐固氮菌是國內(nèi)外生產(chǎn)生物固氮菌劑常用的菌種，由于該菌株不產(chǎn)生芽孢，易失活，產(chǎn)品保存期短，篩選具有固氮能力的芽孢桿菌因而受到重視.早年發(fā)現(xiàn)的固氮芽孢桿菌菌株主要是類芽孢桿菌屬的Paenibacilluspolymyxa、P.macerans和P.azotofixans［16－18］；之后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了P.peoriae、P.graminis、P.odorifer、P.brasilensis、P.zanthoxyli和P.forsythiae［19－23］.近年來我國學(xué)者也相繼發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬（Bacillus）中具有固氮能力的新菌種［5－6］，這些菌株一般都是以蔗糖、葡萄糖、甘露醇或淀粉作為碳源分離獲得［6］，僅少數(shù)菌株在菌種鑒定時表明可分解纖維素.我們在菌種分離篩選時以微晶纖維素為碳源，分離到多株能固氮的芽孢桿菌，豐富了固氮菌資源及其篩選策略.我們獲得的固氮芽孢桿菌菌株CX21，生長較快，固氮能力較強(qiáng)，黃瓜盆栽試驗結(jié)果與對照菌株圓褐固氮菌10098和施用無機(jī)氮肥的結(jié)果相當(dāng).在大田環(huán)境中，單糖和淀粉含量比較低，而作物的殘留物和施入的有機(jī)肥含有大量纖維素，利用纖維素的固氮芽孢桿菌具有更強(qiáng)的競爭適應(yīng)優(yōu)勢.

對固氮微生物固氮能力的研究有微量凱氏定氮法、乙炔還原法測定固氮酶活性、15N示蹤法和盆栽試驗等.目前的研究中，乙炔還原法和15N示蹤法在同一研究中還存在結(jié)果不對應(yīng)等問題，與盆栽試驗結(jié)果并不總是正相關(guān)［6］.我們以菌株生長速率、固氮效率和盆栽試驗結(jié)果進(jìn)行評定，微量凱氏定氮法雖較麻煩，但結(jié)果與盆栽試驗結(jié)果較吻合.

氨的分泌和氨對固氮酶的阻遏效應(yīng)是影響自生固氮微生物增加土壤肥力的限制因素［7］，獲得能將固氮產(chǎn)生的氨分泌到細(xì)胞外的菌株及抗氨效應(yīng)的菌株是利用自生固氮微生物提高土壤肥力需要攻克的難題.就利用纖維素的固氮芽孢桿菌而言，纖維素酶的合成與調(diào)節(jié)、生物固氮的調(diào)節(jié)以及氨的分泌等，也是需要研究的重要課題.

4 結(jié)論

用微晶纖維素?zé)o氮培養(yǎng)基從不同地區(qū)不同植物根際的24個土壤樣品中分離到42株固氮芽孢桿菌，其中固氮芽孢桿菌CX21纖維素酶活性和固氮效率較高.黃瓜盆栽試驗結(jié)果表明，澆施固氮芽孢桿菌CX21菌液，植株高度、植物生物產(chǎn)量和全氮含量同化學(xué)氮肥對照和對照菌株圓褐固氮菌10098的效果相當(dāng)，無顯著差異（P＞0.05）.根據(jù)固氮芽孢桿菌CX21的形態(tài)特征、生理生化特性和16SrDNA序列分析，將篩選到的利用纖維素的固氮芽孢桿菌菌株CX21鑒定為膠質(zhì)類芽孢桿菌Paenibacillus mucilaginosus.

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