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    液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測人血漿及脂蛋白唾液酸的含量

    2014-12-26 01:58:06郭守東楊娜娜闞玉杰李富裕李方圓秦樹存
    色譜 2014年11期
    關鍵詞:唾液酸健康人脂蛋白

    郭守東, 桑 慧, 楊娜娜, 闞玉杰, 李富裕, 李 煜, 李方圓, 秦樹存

    (山東省高校動脈粥樣硬化重點實驗室,泰山醫(yī)學院,山東 泰安271000)

    脂蛋白自身結(jié)構的改變是影響其生物學功能的主要原因之一,脂蛋白因自身結(jié)構改變而失去原有功能的現(xiàn)象在多種疾病中普遍存在[1,2]。脂蛋白的糖基化修飾是最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一,對于維持脂蛋白的功能至關重要。唾液酸是蛋白質(zhì)糖基化過程中最后添加到糖鏈末端的9 碳糖,通過糖苷鍵連接于糖鏈的非還原末端。唾液酸化修飾主要是指N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid,NANA)化修飾,廣泛存在于生物體內(nèi)[3]。脂蛋白上的唾液酸大多數(shù)聚集在載脂蛋白部分,位于寡糖鏈的非還原末端,每個脂蛋白顆粒上平均含有12 ~14 個唾液酸。這些唾液酸所提供的負電荷對于防止脂蛋白之間及其與內(nèi)皮細胞表面的非正常吸附具有重要的意義。研究表明,去唾液酸化與動脈粥樣硬化等心血管病變的發(fā)生和發(fā)展密切相關[4-7]。因此唾液酸的精確測定是研究脂蛋白糖基化修飾與脂蛋白功能的重要技術手段之一。

    測定唾液酸的方法主要包括高效液相色譜法[8,9]、氣相色譜法[10]、毛細管區(qū)帶電泳法[11]和化學比色法等?;瘜W比色法操作簡單,但靈敏度欠佳,不適用于微量生物樣本的測定。唾液酸的紫外吸收十分微弱,在采用高效液相色譜法和氣相色譜法進行檢測時,需要衍生處理,費時費力。本文建立了一種液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)快速測定血漿及脂蛋白唾液酸的方法,并對糖尿病患者與健康人血漿及脂蛋白唾液酸含量進行了對比分析。

    1 實驗部分

    1.1 儀器、試劑與材料

    Waters Symmetry C18 分析柱(100 mm ×2.1 mm,3.5 μm)(美國Waters 公司);3K30 型高速冷凍離心機(德國Sigma 公司);Optima L-80XP 型超速離心機(美國Beckman 公司);LC-MS/MS 由HPLC 系統(tǒng)(LC-20AD、DGU-20A3 脫氣機和SIL-20AC 自動進樣器,日本島津公司)、串聯(lián)質(zhì)譜儀(4000 QTRAP,美國AB SCIEX 公司)和氮氣發(fā)生器(ABN2ZA,英國PEAK 公司)組成。

    NANA(純度為99%)及甲醇、甲酸、醋酸、甲酸銨、槲皮素(純度≥95%)購于Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司;蛋白測定試劑盒購于美國Invitrogen公司;去離子水由Millipore 純水機制備;其他化學試劑為國產(chǎn)分析純。

    人血漿樣本由泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院提供。

    1.2 樣本制備

    19 例健康人(41 ~59 歲,平均年齡50.7 歲)和17 例Ⅱ型糖尿病患者(42 ~60 歲,平均年齡51.6歲)的血漿樣本采集于空腹12 h 之后的早餐前??鼓航?jīng)1 000 g 離心力離心15 min 后獲得血漿。將新鮮血漿移入離心管,調(diào)密度d 至1.006 g/mL,充N2,封口。于10 ℃下以40 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心24 h,取上層液體,獲得極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL);下層液體調(diào)節(jié)密度d 至1.063 g/mL,于10 ℃下以40 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心48 h,獲得低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL);剩余液體調(diào)密度d 至1.21 g/mL,于10℃下以40 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心48 h,得到高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)。脂蛋白經(jīng)透析,充N2,封口備用。

    取20 μg 蛋白樣本,加入pH =2 的醋酸溶液200 μL,80 ℃下水解,不同時間點取樣,考察水解時間對唾液酸降解的影響,確定最佳水解時間。

    1.3 LC-MS/MS 分析

    本研究采用的色譜柱為Waters C18 分析柱(Waters Symmetry,100 mm × 2.1 mm,3.5 μm),同 時 配 備Waters 保 護 柱(10 mm × 2.1 mm,3.5 μm)。流動相為含有4 mmol/L 甲酸銨和0.1% (v/v)甲酸的5% (v/v)甲醇溶液,線性洗脫。進樣體積為5.0 μL,流動相流速為0.3 mL/min。質(zhì)譜采用電噴霧離子源(ESI)的多反應監(jiān)測(MRM)模式,溫度500 ℃,霧化氣、輔助氣和氣簾氣的壓力分別設定為380、380 和140 kPa,其中碰撞氣設在中等檔,在正、負離子模式下的噴霧電壓(ion-spray voltage)分別為4 500 V和-4 500 V。NANA 的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。數(shù)據(jù)使用AB SCIEX 軟件V1.6 進行分析。

    表1 NANA 的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of NANA

    1.4 標準溶液的配制

    用去離子水配制500 μg/mL的NANA 儲備液,分裝后于-20 ℃保存。通過標準樣品添加回收率試驗進行方法學驗證。

    1.5 雙氧水對脂蛋白去唾液酸化的影響

    實驗組采用終濃度為10 μmol/L的H2O2分別處理質(zhì)量濃度均為10 μg/mL的HDL 和LDL;對照組另外添加終濃度為10 μmol/L的槲皮素對脂蛋白進行保護。37 ℃下孵育6 h 后終止,采用LC-MS/MS 檢測兩組脂蛋白上的唾液酸含量。

    1.6 統(tǒng)計學分析

    采用SPSS17.0 進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”的形式表示。組間比較采用t 檢驗,P≤0.05 則具有顯著性差異。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 質(zhì)譜條件

    NANA 是哺乳動物體內(nèi)唾液酸的主要存在形式。本研究分別在正、負離子模式下對NANA 的質(zhì)譜分析條件進行了優(yōu)化。最終確定NANA 在正、負離子模式下的監(jiān)測離子對分別為m/z 310.0/274.0和m/z 308.1/86.7。在正、負離子模式下,NANA的典型質(zhì)譜碎片如圖1 所示。經(jīng)比對分析,NANA在負離子模式下檢測結(jié)果所得S/N 比值最佳,因此本文均采用該條件進行脂蛋白唾液酸含量分析。

    圖1 NANA 在(a)正、(b)負離子模式下的二級質(zhì)譜圖Fig.1 MS/MS spectra of NANA in (a)ESI +and (b)ESI-mode

    2.2 醋酸水解血漿及脂蛋白唾液酸時間的考察

    實驗中,采用易揮發(fā)的醋酸對血漿和HDL 中的NANA 進行溫和水解。以脂蛋白為例,相同色譜條件下所得峰面積對水解時間作圖,如圖2 所示,水解時間在2 h 后,唾液酸并無顯著增加。確定最佳的水解條件為pH =2 的醋酸在80 ℃下水解2 h。

    2.3 方法學驗證

    在負離子模式下,NANA 的檢出限(S/N =3)和定量限(S/N =10)分別為7.4 和24.5 pg。采用NANA 標準溶液添加法制作的標準曲線為y =347.34x +5 037.6(R2=0.998 1);其中y 為峰面積,x 為相應進樣的質(zhì)量濃度(ng/mL)。在2.5 ~80 ng/mL 范圍內(nèi)呈良好的線性關系。加標回收率為98.59% ±3.4%(n =6);日內(nèi)和日間精密度分別為2.16%(n =6)和4.34%(n =6)。

    2.4 脂蛋白唾液酸含量的測定

    水解后的血漿或脂蛋白樣品加入4 倍體積的甲醇,經(jīng)20 000 g 的離心力離心20 min,取上清液。上清液經(jīng)0.22 μm 過濾器過濾后直接進行LC-MS/MS 分析。17 例糖尿病患者和19 例健康人血漿中平均唾液酸含量分別為(548.3 ±88.9)mg/L 和(415.3 ±55.5)mg/L;糖尿病患者的VLDL、LDL 和HDL 唾液酸的含量依次為(4.91 ±0.19)、(6.95 ±0.28)和(3.61 ±0.22)μg/mg ;健康人VLDL、LDL和HDL 唾液酸的含量依次為(2.90 ±0.27)、(7.03±0.04)和(2.40 ±0.09)μg/mg。糖尿病患者血漿中唾液酸含量、VLDL 唾液酸含量和HDL 唾液酸含量均顯著高于健康人(P <0.01);而糖尿病患者LDL 唾液酸含量與健康人相比無顯著差異。

    2.5 脂蛋白去唾液酸化的測定

    氧化應激可導致糖尿病患者體內(nèi)LDL 的去唾液酸化[12]。為探討糖尿病患者體內(nèi)脂蛋白在氧化應激狀態(tài)下發(fā)生去唾液酸化的難易,本文采用H2O2處理脂蛋白,同時設立天然抗氧化劑槲皮素保護組。實驗結(jié)果表明,采用H2O2處理LDL 后,其唾液酸含量與對照組相比下降了18.2% (P <0.01);加入槲皮素可顯著降低H2O2引起的LDL去唾液酸化(P <0.05)(見圖3)。而采用相同濃度的H2O2處理HDL,雖然HDL 發(fā)生了部分去唾液酸化,但與對照組相比,差異不顯著(見圖3)。這可能是因為HDL 中存在對氧磷酶、載脂蛋白apoA-Ⅰ等具有抗氧化功能的蛋白[13],從而有效降低了H2O2對HDL 造成的氧化損傷。

    圖3 H2O2 引起的糖尿病患者脂蛋白去唾液酸化及槲皮素的保護作用Fig.3 Desialylation of lipoprotein from diabetics induced by H2O2 and the protective effect of Quercetin.

    研究結(jié)果顯示:H2O2可致脂蛋白去唾液酸化,而加入天然抗氧化劑槲皮素保護后,脂蛋白去唾液酸化程度降低;更為重要的是,在同等氧化應激狀態(tài)下,LDL 較HDL 更容易發(fā)生去唾液酸化。糖尿病患者的LDL 比健康人的LDL 含有更多的脂肪酸,因而更易于被氧化[14]。此外,NANA 在氧自由基的作用下,自身脫去1 位的羧基,產(chǎn)生1 分子CO2[15,16],這可能是糖尿病患者的LDL 中NANA 并未顯著增高的原因之一。脂蛋白上大約50% 的負電荷是由唾液酸提供的,而糖尿病患者脂蛋白唾液酸含量較健康人發(fā)生了顯著改變,處于寡糖鏈末端的唾液酸改變會影響脂蛋白的正常生理功能[17,18]。

    3 結(jié)論

    除比色法、高效液相色譜法、氣相色譜法和毛細管區(qū)帶電泳法之外,國內(nèi)也有報道采用LC-MS/MS測定食品中唾液酸的方法[19,20]。本文報道的方法較之以前方法有以下優(yōu)勢:采用揮發(fā)性的醋酸在密封條件下對樣本進行處理,而非采用硫酸、磷酸或鹽酸等揮發(fā)性較小的酸,可有效保護質(zhì)譜儀;樣品經(jīng)水解、離心和過濾后直接進行LC-MS/MS 分析,無需對樣品做進一步預處理。該法既可避免前處理過程中唾液酸的丟失,提高回收率,又節(jié)省時間和費用,可廣泛應用于血漿脂蛋白唾液酸含量分析。此外,糖尿病患者血漿的VLDL 和HDL 中唾液酸含量顯著高于健康人,而LDL 唾液酸含量并未發(fā)生顯著改變,這可能是由于糖尿病患者LDL 含有過多的脂肪酸而易于被氧化有關[14],其具體分子機制尚需進一步闡明。

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