離子色譜法測定三磷酸腺苷二鈉制劑中主成分及有關(guān)物質(zhì)的含量

山廣志 ， 宗艷平， 王 曉， 盧靜華

（1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京100050；2. 煙臺東誠藥業(yè)集團股份有限公司，山東 煙臺264006；3. 遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧 錦州121000）

三磷酸腺苷（ATP）作為一種輔酶，有改善機體代謝的作用，參與體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)、糖、核酸以及核苷酸的代謝，能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞、肌肉收縮以及血流量等［1］，同時又是體內(nèi)能量的主要來源。三磷酸腺苷二鈉（adenosine disodium triphosphate，ATP-Na2）的制劑形式主要有注射劑和片劑兩種，臨床上用于進(jìn)行性心肌萎縮、心肌疾患、心功能不全［2］、腦出血后遺癥及肝炎［3］等疾病的輔助治療。

ATP 中的高能磷酸鍵不穩(wěn)定，目前已知主要降解產(chǎn)物為一磷酸腺苷（AMP）和二磷酸腺苷（ADP）二鈉鹽。國家標(biāo)準(zhǔn)中ATP-Na2及有關(guān)物質(zhì)的含量測定方法為重量比法［4-7］，采用紫外E 值法計算總核苷酸量，再利用HPLC 計算ATP、ADP、AMP 面積比，進(jìn)而折算三者含量?？偤塑账崃康臏y定極易受輔料和包衣材料的干擾［8］。有文獻(xiàn)采用紙電泳法［9］和毛細(xì)管區(qū)帶電泳法［10］檢測ATP-Na2，前者經(jīng)紙電泳法分離后，再用紫外分光光度法測定，整個實驗操作過程較繁瑣，結(jié)果重現(xiàn)性差；后者的緩沖液配制較為復(fù)雜（需精確的pH 值）。近年來有文獻(xiàn)［11-13］采用離子對試劑的方法利用HPLC 紫外檢測對ATP-Na2及有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測。上述方法均基于樣品的紫外吸收，采用特定波長對主成分及ADP、AMP 進(jìn)行檢測，檢出成分缺乏全面性，難以全面而真實地反映制劑的組成和成分。

離子色譜法（IC）具有流動相簡單，靈敏度高，環(huán)保無污染等特點，采用在線淋洗液發(fā)生器后，大大簡化了流動相配制操作，并增強了方法重現(xiàn)性，適用于陰離子藥物的分離與檢測［14-18］。本文采用KOH溶液梯度洗脫建立了ATP-Na2注射液含量測定和有關(guān)物質(zhì)檢查的方法，經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法重復(fù)性好，專屬性和耐用性強，適用于ATP-Na2的質(zhì)量分析和控制。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Thermo Dionex ICS-5000＋型離子色譜儀（電導(dǎo)檢測器，Dionex AERS?500 4-mm 抑制器，淋洗液自動發(fā)生器（EGC-500），Chromeleon 7.2 色譜工作站）（ThermoFisher 公司，美國）；天平（XP205，METTLER TOLEDO 公司，瑞士）；Milli-Q 超純水器（Integral 10，Merck Millipore 公司，德國）；水相針式過濾器（聚醚砜，批號9G020320，上海安普科學(xué)儀器有限公司，中國）。

ATP-Na2對照品:批號MKBQ5248V，HPLC純度99.5%，水分2.6%；ADP-Na2對照品:批號SLBB1854V，HPLC 純度99%，水分7%；AMP-Na2對照品:批號WXBB0607V，HPLC 純度99%，水分17%（Sigma 公司）。水為超純水（電阻率大于18.2 MΩ·cm）。

ATP-Na2注射液，批號1309152、13021342，規(guī)格為2 mL／20 mg；ATP-Na2片，批 號131101、130832，規(guī)格20 mg／片，均為市售制劑。

1.2 溶液制備

對照品溶液:精密稱取ATP-Na2、ADP-Na2、AMP-Na2對照品適量，分別用超純水制成每1.0 mL 中約含1.0 mg 的對照品溶液，搖勻，即得。

供試品溶液:取供試品適量，加超純水定量稀釋成每1 mL 中約含1.0 mg 的溶液，搖勻，即得。

有關(guān)物質(zhì)檢查對照溶液:將供試品溶液稀釋100 倍作為有關(guān)物質(zhì)檢查對照溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱:分析柱Thermo Dionex IonPacTMAS11-HC（250 mm×4 mm）；保護柱Thermo Dionex Ion-PacTMAG11-HC（50 mm×4 mm）；淋洗條件:帶連續(xù)再生陰離子捕獲柱（CR-TC）裝置的淋洗液自動發(fā)生器（EGC-500）產(chǎn)生KOH，梯度淋洗程序見表1；流速:1.0 mL／min；柱溫:30 ℃；進(jìn)樣量:10 μL；檢測方式:抑制性電導(dǎo)檢測，采用自循環(huán)模式的陰離子電解再生抑制器，抑制電流223 mA。

表1 梯度淋洗程序Table 1 Gradient elution program

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測器的選擇

方法建立過程中考察了相同樣品濃度下紫外（UV）、積分安培（ED）和電導(dǎo)（CD）檢測器的使用情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 種檢測器在有關(guān)物質(zhì)檢測方面有較大差異:IC-UV 由于采用特定波長檢測，與離子對HPLC-UV 條件下的結(jié)果相似，僅能檢出AMP、ADP、ATP 和部分未知雜質(zhì)，對產(chǎn)品中可能存在的其他離子無響應(yīng)，且UV 并非IC 的標(biāo)準(zhǔn)檢測器，故未采用UV 檢測器；積分安培檢測器常用于分析解離度低，電導(dǎo)檢測器難于檢測或根本無法檢測的pK＞7 的離子［19］，并且ED 的樣品承載量較小，試驗中發(fā)現(xiàn)1.0 g／L 質(zhì)量濃度下ATP 峰會因過載出現(xiàn)分叉，而降低濃度后部分微量雜質(zhì)峰難以檢測，導(dǎo)致檢測范圍狹窄，且對部分成分無響應(yīng)。本品解離度較好，用電導(dǎo)檢測器能夠獲得較好的檢測效果，故未采用ED 進(jìn)行檢測。

2.2 響應(yīng)因子的測定

電導(dǎo)檢測器的響應(yīng)信號與待測成分帶電情況（電荷數(shù)）、摩爾質(zhì)量、解離度等均相關(guān)［19］，為了減少對照品的使用，本方法測定了ATP-Na2與其主要降解產(chǎn)物AMP-Na2和ADP-Na2之間的響應(yīng)因子，結(jié)果見表2。可以看出在該色譜條件下ADP-Na2相對ATP-Na2的響應(yīng)因子為0.747 1，AMP-Na2相對ATP-Na2的響應(yīng)因子為0.481 7，因此對已知主要降解雜質(zhì)AMP 和ADP 采用加校正因子的主成分自身對照法較為合適。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗

理論塔板數(shù)按ATP 計不低于50 000，ATP 與其相鄰色譜峰之間的分離度均大于2.0，供試品溶液稀釋1 000 倍仍可檢出ATP。

2.3.2 專屬性試驗

圖1 ATP-Na2 的離子色譜圖Fig.1 Ion chromatograms of ATP-Na2

表2 ADP-Na2、AMP-Na2 相對ATP-Na2 的響應(yīng)因子Table 2 Response factors of ADP-Na2 and AMP-Na2 relative to ATP-Na2

取供試品（批號1309152）適量（約相當(dāng)于ATP-Na210.0 mg），分別加入30% （質(zhì)量分?jǐn)?shù)）過氧化氫溶液1.0 mL、1 mol／L 鹽酸溶液1.0 mL、1 mol／L 氫氧化鈉溶液1.0 mL，室溫放置1 h 后中和；另取樣品分別置于100 ℃烘箱中加熱1 h 和強光下照射24 h。上述樣品分別加水稀釋至10 mL，進(jìn)樣檢測。結(jié)果表明，在該色譜條件下，本品經(jīng)強酸、強堿、氧化、高溫和光照破壞后，雜質(zhì)峰面積增加，同時主峰后存在未知雜質(zhì)峰；所有雜質(zhì)峰均能與主峰完全分離，表明本方法專屬性良好。

2.3.3 線性關(guān)系

精密稱取ATP-Na2對照品45.7 mg，逐級稀釋至質(zhì)量濃度分別為1.83、0.914、0.366、0.183、0.073 1、0.014 6、0.003 66、0.000 146 g／L 的系列對照品溶液；精密稱取ADP-Na2對照品37.8 mg，逐級稀釋至質(zhì)量濃度 分 別 為1.51、0.756、0.302、0.060 5、0.012 1、0.002 42、0.000 484 g／L 的系列對照品溶液；精密稱取AMP-Na2對照品40.2 mg，逐級稀釋至質(zhì)量濃度分 別 為0.804、0.402、0.161、0.032 2、0.006 43、0.001 29、0.000 426 g／L 的系列對照 品 溶液。在1.3 節(jié)色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖。以樣品質(zhì)量濃度（C，g／L）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，分別擬合回歸方程并計算相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表3，本色譜條件下ATP-Na2、ADP-Na2和AMP-Na2的線性良好。

2.3.4 定量限及檢出限

定義S／N ＝3 時的質(zhì)量濃度為檢出限（LOD），S／N ＝10 時的質(zhì)量濃度為定量限（LOQ），ATPNa2、ADP-Na2、AMP-Na2的檢出限和定量限結(jié)果見表3。

表3 待測離子的線性關(guān)系及LOQ 和LODTable 3 Linear relationships，LOQs and LODs of the ions

2.3.5 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗

取1.0 g／L 的ATP-Na2對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，其峰面積的RSD 為0.57%，表明本方法精密度良好。

取批號為1309152 的樣品，平行制備6 份1.0 g／L 的 溶 液，進(jìn) 樣檢 測，ATP-Na2平均 含 量 為105.6%，RSD 為0.32%，表明本方法重復(fù)性良好。

取ATP-Na2、ADP-Na2、AMP-Na2對照品溶液，在室溫下放置0、3、6、9、12、24 h 后分別進(jìn)樣，結(jié)果峰面積的RSD 分別為1.3%、1.4%、2.5% （n ＝6），表明對照品溶液在室溫條件下24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 回收率試驗

精密量取1.0 mL（10 g／L）的供試品（批號1309152）9 份，分別置于25 mL 的容量瓶中，加入精密稱取的ATP-Na2對照品約10.0、15.0、20.0 mg各3 份，用超純水稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度約為0.8、1.0、1.2 g／L 的溶液，分別進(jìn)樣，結(jié)果見表4。

2.3.7 方法耐用性

取供試品（批號1309152）在不同流速（±10%）、柱溫（±5 ℃）等色譜條件下測定，各條件下主峰的理論塔板數(shù)均大于50 000，主峰與相鄰雜質(zhì)峰分離度大于3.8，主成分平均含量為105.4%，RSD 為0.51%（n ＝6），表明本方法耐用性良好。

表4 注射液中ATP-Na2 的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Recoveries and RSDs of ATP-Na2 in injection

2.3.8 樣品測定

取4 批市售樣品，按1.2 節(jié)下方法制備供試品溶液和有關(guān)物質(zhì)檢查對照溶液。按1.3 節(jié)條件進(jìn)樣測定，按外標(biāo)法計算主成分含量，按加校正因子的主成分自身對照法計算ADP-Na2和AMP-Na2含量，結(jié)果見表5。

表5 注射液及片劑中ATP-Na2 及其有關(guān)物質(zhì)含量的測定結(jié)果Table 5 Contents of ATP-Na2 and related substances in injections and tablets

3 結(jié)論

本文建立了測定ATP-Na2注射液中主成分及有關(guān)物質(zhì)含量的離子色譜法，采用外標(biāo)法進(jìn)行含量測定，利用加校正因子的主成分自身對照法進(jìn)行已知降解產(chǎn)物ADP-Na2和AMP-Na2的定量，方法簡便易行，綠色無污染。方法學(xué)驗證結(jié)果顯示該方法重現(xiàn)性好，靈敏度能夠滿足ATP 制劑中雜質(zhì)的檢測要求，結(jié)果準(zhǔn)確。

本方法顯示了較強的分離能力，除了能夠?qū)χ鞒煞旨捌潆s質(zhì)進(jìn)行檢測以外，還能夠完成對部分輔料的檢測，能全面和有效地反映和控制三磷酸腺苷產(chǎn)品的質(zhì)量，可為生產(chǎn)企業(yè)開展質(zhì)量控制提供依據(jù)和借鑒。

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