辣椒制品中羅丹明B的基質(zhì)固相分散提取條件優(yōu)化

韋 娜 ， 王 煜 ， 張孝芳 ， 馮敘橋 ， 齊小花 ， 鄒明強(qiáng) *

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 裝備技術(shù)研究所，北京 100123；2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110161；3.國(guó)家認(rèn)可中心，北京 100062）

羅丹明B（Rhodamine B），又稱(chēng)四乙基羅丹明，堿性玫瑰精，玫瑰紅B，俗稱(chēng)花粉紅，是一種具有鮮桃紅色的人工合成的染料，屬于咕噸系列的衍生物[1]?？s寫(xiě)為RhB，分子式為C28H31ClN2O3，相對(duì)分子質(zhì)量為479.017 5，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。羅丹明B易溶于水和乙醇等有機(jī)溶劑，呈玫瑰紅色溶液，稀釋后有強(qiáng)烈的熒光產(chǎn)生，微溶于鹽酸和氫氧化鈉溶液。因其顏色鮮亮，價(jià)格便宜，許多不法商販將其加入到辣椒面和辣椒油等辣椒制品中以達(dá)到顏色的效果。中國(guó)衛(wèi)生部將羅丹明B列入《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》中，禁止在食品中使用[2]。

圖1 羅丹明B的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of rhodamine B

目前，檢測(cè)辣椒制品中羅丹明B的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)尚未出臺(tái)，而只有一些地方標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，檢測(cè)羅丹明B所采用的樣品前處理方式也多為液液萃取或固相萃取[4-5]，所需的有機(jī)溶劑種類(lèi)多、調(diào)配復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)所需耗材多、成本高。本實(shí)驗(yàn)中采用改進(jìn)后的基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)，針對(duì)具有代表性的3種辣椒制品即辣椒面、辣椒油和辣椒醬進(jìn)行正交試驗(yàn)，選用分散劑種類(lèi)、分散劑與樣品質(zhì)量比、洗脫劑組成及洗脫劑用量作為優(yōu)化因素[6-9]，確定前處理過(guò)程中的最佳條件，利用高效液相色譜法進(jìn)行羅丹明B測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品與試劑

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)羅丹明B，Sigma公司產(chǎn)品，純度99.5%；乙腈，國(guó)藥北京化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，色譜純；甲醇，國(guó)藥北京化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，色譜純；甲酸，國(guó)藥北京化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，分析純；C18填料，國(guó)藥北京化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；弗羅里硅土，國(guó)藥北京化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；中性氧化鋁，國(guó)藥北京化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；硅膠，國(guó)藥北京化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

BS224S電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司制造；MS1渦旋振蕩器，德國(guó)IKA公司制造；KQ-2500E超聲清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司制造；3K30型離心機(jī)，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司制造；MTN-2800D氮吹儀，天津安特賽恩斯儀器有限公司制造；玻璃研缽和杵，北京市宏捷成生物科技有限公司提供。

1.3 提取工藝

對(duì)傳統(tǒng)的基質(zhì)固相分散萃取技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，將1 g加有羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品的辣椒制品置于玻璃研缽中，混合均勻，加入分散劑，用研棒充分研磨，研磨后移入試管中，加入洗脫劑，振搖均勻，超聲10 min進(jìn)行充分洗脫，取提取液于45℃下氮吹濃縮至干，用乙腈將其復(fù)溶定容至1 mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

配制羅丹明B的標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度為0.01 μg/mL、 0.05 μg/mL、 0.2 μg/mL、 1 μg/mL、 5 μg/mL 和10 μg/mL，以相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.5 羅丹明B含量的測(cè)定條件

采用高效液相色譜法測(cè)定溶液中羅丹明B的含量。色譜柱：SB C18 4.6 mm×50 mm，1.8 μm；檢測(cè)波長(zhǎng)550 nm；柱溫 35℃；進(jìn)樣量 10 μL；體積流量1.0 mL/min；流動(dòng)相：乙腈/質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%甲酸溶液（體積比 65∶35）。

1.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇分散劑種類(lèi)、分散劑與樣品質(zhì)量比、洗脫劑組成及洗脫劑用量作為研究因素，其中分散劑與洗脫劑的選用原則主要是相似相溶原理，在盡可能提取出樣品中目標(biāo)物的同時(shí)盡量保留樣品中其他成分，避免這些成分對(duì)目標(biāo)物檢測(cè)產(chǎn)生干擾。實(shí)驗(yàn)最終以提取液中的羅丹明B萃取率為考察指標(biāo)，通過(guò)L16（45）正交試驗(yàn)，選出最佳的辣椒制品中羅丹明B的提取條件，因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal design

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

根據(jù)溶液中羅丹明B濃度與峰面積相對(duì)應(yīng)的關(guān)系，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖2所示，得出的回歸方程為：y=116.252 4x+0.660 1，在 0.01～10 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

圖2 羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2 Rhodamine B standard curve

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)中考察了4個(gè)因素和4個(gè)水平，選擇L16（45）正交表，其中一列為空列。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及各個(gè)辣椒制品的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2—4。

由表2、表3和表4中對(duì)羅丹明B提取率的R值進(jìn)行的分析，可以得出影響羅丹明B提取率的因素大小關(guān)系為：D>A>B>C，洗脫劑的選擇影響作用最大，分散劑的選擇影響作用次之，洗脫劑的用量影響作用最小。根據(jù)各表中K值比較，確定辣椒面最佳的提取工藝條件為D3A4B3C2，即洗脫劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的乙腈水溶液，分散劑硅膠，分散劑與樣品質(zhì)量比例1∶1，洗脫劑體積20 mL；辣椒油最佳的提取工藝條件為D4A3B1C2，洗脫劑為體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇水溶液，分散劑中性氧化鋁，分散劑與樣品質(zhì)量比例2∶1，洗脫劑體積20 mL；辣椒醬最佳提取工藝條件為D3A3B2C4，洗脫劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的乙腈水溶液，分散劑為中性氧化鋁，分散劑與樣品質(zhì)量比例3∶1，洗脫劑體積5 mL。前兩種辣椒制品的最佳洗脫劑體積均為考察范圍內(nèi)的最大值20 mL，通過(guò)進(jìn)一步研究，增加洗脫劑體積對(duì)羅丹明B的萃取沒(méi)有更大貢獻(xiàn)，所以考慮到實(shí)驗(yàn)成本及環(huán)保，最終選擇20 mL最宜。

表5、表6和表7更深入地分析了4個(gè)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度，從3個(gè)表中可以看出，洗脫劑和分散劑的選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響顯著，其次分散劑與樣品質(zhì)量比例的影響較前兩者弱，洗脫劑的用量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最不顯著，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響顯著性依次為：因素D （洗脫劑組成）>因素A（分散劑種類(lèi)）>因素B（分散劑與樣品質(zhì)量比例）>因素C（洗脫劑用量），此方差分析結(jié)果與極差分析結(jié)果一致。

2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證與討論

通過(guò)對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果的極差與方差分析確定的辣椒面的最佳組合為A4B3C2D3，即分散劑硅膠，分散劑與樣品質(zhì)量比例1∶1，洗脫劑用量20 mL，洗脫劑選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的乙腈水溶液；辣椒油的最佳組合為A3B1C2D4，即分散劑為中性氧化鋁，分散劑與樣品質(zhì)量比例2∶1，洗脫劑用量20 mL，洗脫劑為體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇水溶液；辣椒醬的最佳組合是A3B2C4D3，即分散劑為中性氧化鋁，分散劑與樣品質(zhì)量比例3∶1，洗脫劑用量5 mL，洗脫劑用質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%的乙腈水溶液。將這3種代表性的辣椒制品的空白樣中分別添加質(zhì)量濃度為100 μg/mL的羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量濃度分別為 0.2 μg/mL、1 μg/mL 和 5 μg/mL， 按照分別的前處理最優(yōu)條件對(duì)每個(gè)樣品的每一質(zhì)量濃度進(jìn)行5次檢測(cè)，最后取平均值，經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算得到各溶液中羅丹明B的濃度。經(jīng)計(jì)算目標(biāo)物回收率在80.6%～100.8%（見(jiàn)表8），可以達(dá)到痕量分析的要求。

表2 辣椒面樣品正交實(shí)驗(yàn)表及結(jié)果Table 2 Orthogonal results of Chili Powder

表3 辣椒油樣品正交實(shí)驗(yàn)表及結(jié)果Table 3 Orthogonal results of Pepper Oil

續(xù)表3

表4 辣椒醬樣品正交實(shí)驗(yàn)表及結(jié)果Table 4 Orthogonal results of Chili Paste

續(xù)表4

表5 辣椒面樣品正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 5 Orthogonal analysis of variance of Chili Powder

表6 辣椒油樣品正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 6 Orthogonal analysis of variance of Pepper Oil

表7 辣椒醬樣品正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 7 Orthogonal analysis of variance of Chili Paste

表8 辣椒樣品中羅丹明B回收率Table8 Recovery of Rhodamine B in Chili sample

3 結(jié)語(yǔ)

利用改進(jìn)后的基質(zhì)固相分散技術(shù)的正交試驗(yàn)，進(jìn)行辣椒制品中羅丹明B的提取工藝的研究，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差和方差分析，得到最優(yōu)提取工藝條件，如表9所示。

表9 辣椒樣品中羅丹明B最優(yōu)提取條件Table 9 Optimal extraction conditions of Rhodamine B in Chili sample

同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，確定在各自的最優(yōu)條件下，3種辣椒產(chǎn)品中羅丹明B的最高提取率分別為：辣椒面100.8%，辣椒油99.7%，辣椒醬98.3%。

實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，有機(jī)溶劑種類(lèi)少，只用到了乙腈和甲醇，改進(jìn)后省去了固相萃取小柱，避免了在液液萃取或固相萃取過(guò)程中，可能由于所用有機(jī)溶劑復(fù)雜，或萃取小柱批次不同而導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，或目標(biāo)物殘留在柱上等會(huì)影響目標(biāo)物回收率的情況產(chǎn)生，并且節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本。

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