奶牛α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆表達(dá)

姚 晶 ， 張陽(yáng)旸 ， 吳正鈞 ， 任 婧 *

（1.乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，光明乳業(yè)股份有限公司 技術(shù)中心，上海 200436；2.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306）

α -1，3- 巖 藻 糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 （alpha-（1，3）-fucosyltransferase，F(xiàn)T）參與Lewis糖鏈合成最后一步的巖藻糖化反應(yīng)，F(xiàn)T有6類，包括FT-Ⅲ、FT-Ⅳ、FT-Ⅴ、FT-Ⅵ、FT-Ⅶ和FT-Ⅸ，其主要功能是催化GDP-巖藻糖的巖藻糖基轉(zhuǎn)移至糖鏈中N-乙酰氨基乳糖單位的N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）上。Lewis是一組存在于細(xì)胞表面糖脂和糖蛋白糖鏈（主要在O-糖鏈，也可在N-糖鏈）上的糖類抗原[1-3]。唾液酸化Lewis（Slex）則是一種細(xì)胞粘附分子——選擇素（selectin）的共同糖配體，選擇素主要參與了細(xì)胞粘附和遷移，這與細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、組織正常功能的維持、炎癥的發(fā)生及腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移等多種生理過(guò)程密切相關(guān)，但其中的作用機(jī)制，如Slex的表達(dá)與癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡之間的關(guān)系等，并不十分清楚[4-5]。FT是Slex合成過(guò)程中必不可少的糖基轉(zhuǎn)移酶，催化合成反應(yīng)的最后一步，調(diào)節(jié)和控制著Slex的表達(dá)。由于FT與免疫應(yīng)答反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移等體內(nèi)生理活動(dòng)密切相關(guān)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于FT的研究多集中在FT的酶活、表達(dá)量、參與合成產(chǎn)生的Slex的結(jié)構(gòu)與體內(nèi)這些生理活動(dòng)的關(guān)系，以及FT基因的調(diào)控作用等方面[6-9]。為了研究FT基因的作用，相關(guān)學(xué)者已經(jīng)成功克隆了人、鼠、兔等的FT基因，并分別在人表皮癌細(xì)胞系A(chǔ)431、小鼠脾細(xì)胞、原核表達(dá)系統(tǒng)pET30中成功表達(dá)；而牛的FT相關(guān)基因的克隆表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道[10-12]。作者通過(guò)對(duì)牛的其中一種FT基因開(kāi)展相關(guān)的分子生物學(xué)研究，為進(jìn)一步理解其在體內(nèi)的生理功能和作用機(jī)理，及相關(guān)疾病新型藥劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌Escherichia coli DH5α，為光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室保存，基因型：supE44ΔlacU169（φ80 lacZΔM15）hsdR recA1 endA1 gurA1 thi-1 relA1。畢赤酵母 GS115，為 Invitrogen公司產(chǎn)品，由復(fù)旦大學(xué)惠贈(zèng)。

質(zhì)粒pMD19-T，為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品。畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K，為 Invitrogen公司產(chǎn)品，由上海生物工程有限公司惠贈(zèng)。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 限制性內(nèi)切酶NotⅠ-HF、AvrⅡ、BalⅡ、Sac I-HF ，NEB 公司產(chǎn)品；T4 DNA 連接酶、溴酚藍(lán)指示劑（6x buffer）、X-Gal、硫酸卡納霉素、氨芐青霉素、血液組織細(xì)胞基因組提取試劑盒、蛋白loading buffer、標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，天根公司產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶，probest DNA聚合酶，Wide range DNA Marker，DL2000 DNA Marker，TAKARA公司產(chǎn)品；其余常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2.2 主要儀器設(shè)備 TC-25/H型PCR儀，杭州博日科技有限公司制造；EPS-300A型數(shù)顯雙穩(wěn)電泳儀，上海天能科技有限公司制造；412951型凝膠成像儀，BIO-RAD公司制造。

1.3 FT基因片段的生物信息學(xué)分析

1.3.1 基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析 根據(jù)NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）上公布的FTⅨ的蛋白質(zhì)序列（獲取 號(hào) ：NP_777160.1）， 登 錄 http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html，在線對(duì)其相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸組成、等電點(diǎn)及疏水性等基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析[13]。

1.3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)預(yù)測(cè)分析 利用網(wǎng)站工具軟件PROF 軟件（http：//www.predictprotein.org/）和 HNN軟件（http：//npsa-pbil.ibcp.fr）預(yù)測(cè) FT 的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利 用 網(wǎng) 站 工 具 軟 件 Scan Prosite （http：//www.predictprotein.org/）對(duì)FT進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。利用網(wǎng)站工具軟件 SWISS-MODEL 軟件（http：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行建模，預(yù)測(cè)該酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果用蛋白質(zhì)三維圖象軟件java 2.0查看[14-16]。

1.3.3 蛋白質(zhì)序列的同源性分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 將氨基酸序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，利用網(wǎng)站工具軟件BLAST軟件（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行同源性比對(duì)分析。進(jìn)而利用Clustal W軟件進(jìn)行多序列同源性比對(duì)和聚類分析，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)使用MEGA 5.0軟件的鄰接歸并法（NJ法）構(gòu)建[17]。 供試物種為：家犬（Canis lupus familiaris，NP_001005380.1），大熊貓（Ailuropoda melanoleuca，XP_002927989.1），黑 猩猩（Pan troglodytes，NP_001 008978.1）， 家 兔 （Oryctolagus cuniculus，XP_002714 636.1），家鼠（Mus musculus，NP_034373.1），馬（Equus caballus，XP_001503875.1），褐鼠（Rattus norvegicus，NP_445917.1），鴨嘴獸 （Ornithorhynchus anatinus，XP_001506677.1），短尾猊（Monodelphis domestica，XP_001367612.1），紅原雞（Gallus gallus，NP_00107 2970.1），火雞（Meleagris gallopavo，XP_003204387.1），安樂(lè)蜥（Anolis carolinensis，XP_003225370.1）。 還有人（Homo sapiens，CAB41890.1）。

1.4 FT基因片段的擴(kuò)增

由于奶牛的FT基因不含有內(nèi)含子，因此可以直接從基因組DNA直接擴(kuò)增獲得。從荷斯坦奶牛靜脈采血5 mL，分裝置至含有抗凝劑的1.5 mL的離心管中，液氮速凍，后置于-80℃的超低溫冰箱貯存。用血液、組織、細(xì)胞基因組DNA抽提試劑盒抽提基因組，并電泳檢測(cè)，保存基因組DNA于TE緩沖液中備用，主要操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

參考 GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)荷斯坦奶牛 α-1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅸ（alpha-（1，3）-fucosyltransferase，F(xiàn)TⅨ）編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)引物：

P1：ACTGAGCCTAGGATGACCTCAGCATCCAA AGG；P2：AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTAATTCCAA AACCATTTCTCTAAATTACC，進(jìn)行 PCR，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并對(duì)目的DNA回收純化。

1.5 重組質(zhì)粒pMD19-FT的構(gòu)建

將上述PCR產(chǎn)物溶液于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%瓊脂糖凝膠上電泳后，以Marker為參照估算擴(kuò)增產(chǎn)物的物質(zhì)的量。在與T載體連接前，首先進(jìn)行一個(gè)加A反應(yīng)。然后將目的基因片段和載體pMD19-T按摩爾比1∶3～1∶10進(jìn)行連接反應(yīng)并轉(zhuǎn)化。對(duì)轉(zhuǎn)化的重組子進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選出目的重組子，并對(duì)重組子進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定。將PCR鑒定與雙酶切鑒定均為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子送至Invitrogen公司進(jìn)一步測(cè)序鑒定。送至Invitrogen公司測(cè)序，測(cè)序引物為M13（+）、M13（-），對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。

1.6 表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-FT的構(gòu)建

制備具有雙黏性末端的重組質(zhì)粒pMD19-FT以及pPIC9K質(zhì)粒片段，按一定比例加入到含有T4連接酶緩沖液和T4連接酶的體系中，16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化。并按上述方法進(jìn)行重組子的篩選及鑒定，測(cè)序引物為α-factor/3’AOX，并根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)目的基因的序列及位置進(jìn)行驗(yàn)證。

1.7 重組酵母GS115-FT轉(zhuǎn)化子制備及誘導(dǎo)表達(dá)

抽提鑒定正確的重組質(zhì)粒pPIC9K-FT，電轉(zhuǎn)化至P.pastoris GS115感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)化電壓1.5 kV，電擊時(shí)間5 ms。電擊結(jié)束后取900 μL山梨醇溶液混勻菌體并移至1.5 mL離心管中，30℃靜置培養(yǎng)1h。取200 μL轉(zhuǎn)化液涂布至MD平板，30℃培養(yǎng)2～3 d至出現(xiàn)His+轉(zhuǎn)化子。

待轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)至肉眼可見(jiàn)時(shí)，將轉(zhuǎn)化子菌落編號(hào)并一一對(duì)應(yīng)地點(diǎn)在含有G418硫酸鹽質(zhì)量濃度為2 mg/mL的MD和MM平板上，30℃培養(yǎng)2～3 d，篩選在MD、MM平板上都正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子His+Mut+。隨機(jī)挑取5個(gè)His+Mut+轉(zhuǎn)化子，用Lysis buffer for microorganism to direct PCR試劑進(jìn)行菌落PCR，PCR 引物為 α-factor/3’AOX。

取鑒定His+Mut+轉(zhuǎn)化子接種至100 mL的BMGY培養(yǎng)基中，30℃ 250 r/min，培養(yǎng)至OD600=2.0～6.0。3 000 g離心5 min收集菌體，用BMMY培養(yǎng)基重懸并稀釋至OD600=1.0，分別進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)24、48、72 h，以 1%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。蛋白質(zhì)樣品15 000 r/min離心2 min收集上清液，取1 mL置液氮中速凍并保存于-80℃。添加甲醇至 V（上清）∶V（甲醇）=1∶1，4 ℃靜置 1 h，12 000 r/min 離心 5 min，沉淀復(fù)溶于 100 μL ddH2O，質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%SDS-PAGE檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 FT基因的生物信息學(xué)分析

2.1.1 FT基因基本理化性質(zhì) FT cDNA為1 101 bp，有1個(gè)ORF（堿基序列9-1088），不含有內(nèi)含子。通過(guò)其序列的在線分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T的化學(xué)式為C1930H2885N489O535S15，原子總數(shù)為5 854，相對(duì)分子質(zhì)量為41 978.9，包括359個(gè)氨基酸殘基，等電點(diǎn)理論值為7.61，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為34，正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)為35，不穩(wěn)定系數(shù)為45.20，故認(rèn)為該蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。脂肪系數(shù)為80.33，親水性評(píng)估為-0.275。依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)和分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律，可見(jiàn)該酶為親水性蛋白質(zhì)。該酶的氨基酸組成如表1所示，其中相對(duì)含量比較多的氨基酸為Ser（31個(gè)，占8.6%），含量比較少的氨基酸是Tyr（6個(gè)，占1.7%）。其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的半衰期預(yù)測(cè)值為30 h，在酵母菌中則＞20 h，在大腸桿菌中為＞10 h。

2.1.2 FT基因的蛋白質(zhì)組學(xué)分析 通過(guò)PROF和HNN軟件對(duì)FT進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，結(jié)果如表2所示。從預(yù)測(cè)的結(jié)果可以看出，兩種方法所得出的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，包含的α螺旋基本一致，而β折疊、自由卷曲則有一定差別。利用ScanPROSITE對(duì)FT的功能域分析發(fā)現(xiàn)，它有3個(gè)N糖基化位點(diǎn)，1個(gè)cAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，6個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)以及2個(gè)N豆蔻?；稽c(diǎn)，如表3所示。利用SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)的FT的三維結(jié)構(gòu)如圖1所示。

表1 FT的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of alpha-（1，3）-fucosyltransferase Ⅸ

表2 FT二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Table 2 Predicted secondary structure of alpha-（1，3）-fucosyltransferaseⅨ

表3 FT蛋白功能域分析Table 3 Predicted protein function of alpha-（1，3） -fucosyltransferaseⅨ

2.1.3 蛋白序列同源性分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建將蛋白質(zhì)序列在NCBI上進(jìn)行BLAST，通過(guò)多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)和供試物種的同源度都非常高。通過(guò)MEGA 5.0建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖2所示，可以看出，供試的14個(gè)物種的FT被聚成2大類：紅原雞、火雞和安樂(lè)蜥的FT為一類。其中雉科的紅原雞、火雞為一支。褐鼠、家鼠等其他11個(gè)哺乳動(dòng)物的FT聚為另一類。其中，短尾猊的FT自為一支，其他10個(gè)的FT聚為一支。在此10個(gè)物種的FT中，鴨嘴獸的FT為一分支，其他9種聚為另一分支。這9個(gè)物種FT又分為2個(gè)分支：褐鼠、家鼠、黑猩猩和家兔，以及人的FT聚為一個(gè)分支，其中家兔又自成一分支，褐鼠和家鼠聚為一組，黑猩猩和人聚為一組，兩兩組成另一個(gè)分支；大熊貓、家犬、馬和牛的FT聚為另一分支，其中大熊貓自成一支，馬和牛的FT組成的小分支和家犬聚為另外一分支。

圖1 SWISS-MODEL預(yù)測(cè)的FT三維結(jié)構(gòu)Fig.1 Predicted 3D structure of alpha-（1，3） -fucosyltransferaseⅨby SWISS-MODEL

圖2 FT的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of alpha-（1，3）-fucosyltransferaseⅨ

2.2 荷斯坦奶?；蚪MDNA的提取和目的基因的擴(kuò)增

為得到奶牛α-1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的相關(guān)基因，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅸ基因設(shè)計(jì)PCR引物，并結(jié)合表達(dá)載體引入相關(guān)酶切位點(diǎn)。用血液、組織、細(xì)胞基因組DNA抽提試劑盒按照試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提基因組，并進(jìn)行電泳檢測(cè)，如圖3所示，可以看出，基因組DNA條帶清晰、整齊，說(shuō)明該試劑盒提取的基因組DNA純度較高，品質(zhì)較好。保存基因組DNA于TE緩沖液中，作為擴(kuò)增目的基因的模板備用。

圖3 基因組DNA電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis result of genomic DNA

將上步抽提的基因組DNA作為模板，加入到50 μL PCR體系中進(jìn)行PCR反應(yīng)，電泳檢測(cè)在約1.1 kb處出現(xiàn)目的條帶，如圖4所示。

圖4 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoresis result of PCR product

2.3 重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆篩選及鑒定

上步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收試劑盒純化后，進(jìn)行加A反應(yīng)。按照載體與插入片段摩爾比約為1∶3～1∶10，進(jìn)行T載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coil DH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用藍(lán)白斑篩選轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)，平板上可明顯觀察到藍(lán)白斑。對(duì)平板上正常生長(zhǎng)的白色菌斑隨機(jī)挑取5個(gè)，進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖5所示，發(fā)現(xiàn)①號(hào)、②號(hào)菌落為陽(yáng)性克隆。繼而將②號(hào)菌落進(jìn)行雙酶切鑒定，可以得到較好的酶切結(jié)果（圖6）。將②號(hào)菌保種后送樣測(cè)序分析。將測(cè)序結(jié)果與NCBI公布的FT基因比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物發(fā)生了一個(gè)堿基突變。通過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在同一位點(diǎn)均發(fā)生相同的堿基突變，由于本實(shí)驗(yàn)中PCR模板為中國(guó)荷斯坦乳牛，而genebank中公布的序列來(lái)源為美國(guó)乳牛，推測(cè)這個(gè)位點(diǎn)的突變屬于個(gè)體差異。至此，構(gòu)建出重組質(zhì)粒并命名為pMD19-FT。

圖5 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.5 PCR analysis of the DH5α

圖6 ②號(hào)菌質(zhì)粒的雙酶切圖Fig.6 Restriction endonuclease of pMD19-FT

2.4 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將含有FT編碼區(qū)序列的重組質(zhì)粒pMD19-FT和表達(dá)載體pPIC9K雙酶切后，取適量于16℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化到E.coil DH5α。用通用引物α-factor與3’AOX對(duì)挑取的菌落進(jìn)行PCR鑒定，如圖7所示，①號(hào)菌、②號(hào)菌可能為陽(yáng)性克隆。

將①號(hào)菌質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果為陽(yáng)性，證明目的基因FT已正確連接到表達(dá)載體pPIC9K中，說(shuō)明已成功構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K-FT。

圖7 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.7 PCR analysis of the DH5α

2.5 重組酵母的篩選鑒定及其誘導(dǎo)表達(dá)

大量制備pPIC9K-FT，用限制性內(nèi)切酶Sac IHF將其線性化并濃縮至0.5～1.0 μg/μL。將線性化質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至宿主菌P.pastoris GS115中，篩選有G418抗性的His+Mut+轉(zhuǎn)化子，并進(jìn)行PCR鑒定。挑選在MD、MM平板上長(zhǎng)得最快的G418抗性的His+Mut+轉(zhuǎn)化子，經(jīng)G418終質(zhì)量濃度為2 mg/mL的BMGY培養(yǎng)至OD600=2.0～6.0時(shí)，收集菌體用G418終質(zhì)量濃度為2 mg/mL的BMMY稀釋至OD600=1.0，再進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。并對(duì)目的基因蛋白質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果如圖8所示。在約45.0 kDa處，有一條明顯的蛋白質(zhì)條帶，其相對(duì)分子質(zhì)量與預(yù)測(cè)值相符，而此處陰性對(duì)照無(wú)此條帶，因此可以判斷此條帶為目的基因FT可以在宿主菌P.pastoris GS115中成功表達(dá)，并可以分泌至胞外，而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，目的蛋白質(zhì)含量也不斷積累。

3 結(jié)語(yǔ)

依據(jù)NCBI上的相關(guān)序列，對(duì)奶牛FT基因進(jìn)行了生物信息學(xué)的分析，通過(guò)在線預(yù)測(cè)可知，目的蛋白質(zhì)FT為一種可溶性穩(wěn)定蛋白質(zhì)，具有糖基化、磷酸化、酰胺化等多個(gè)功能位點(diǎn)。利用蛋白質(zhì)分析軟件SWISS-MODEL對(duì)其三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了建模預(yù)測(cè)。通過(guò)對(duì)FT基因的生物信息學(xué)分析，對(duì)主要理化性質(zhì)及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，這對(duì)其克隆表達(dá)、分離純化等后續(xù)相關(guān)工作的開(kāi)展具有一定的指導(dǎo)意義。將FT編碼區(qū)序列連接到重組質(zhì)粒pMD19-T載體上并轉(zhuǎn)化至E.coil DH5α中，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定、雙酶切鑒定及測(cè)序鑒定，證明了此段克隆基因的正確性。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建了真核表達(dá)系統(tǒng)P.pastoris GS115-FT，并對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行了目的檢測(cè)，結(jié)果顯示目的蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量大小與預(yù)測(cè)值相符，且能夠成功分泌到胞外并隨之累積，證實(shí)了之前生物信息學(xué)分析的部分結(jié)果是可靠的。但是，有蛋白質(zhì)的產(chǎn)生并不代表蛋白質(zhì)就是有活性的。如果在表達(dá)過(guò)程中，重組蛋白質(zhì)由于糖基化等后修飾需要或者經(jīng)過(guò)折疊等導(dǎo)致了酶學(xué)性質(zhì)的變化或者喪失，對(duì)其今后的開(kāi)發(fā)利用都會(huì)產(chǎn)生巨大的影響。因此，后續(xù)的工作將重點(diǎn)研究所表達(dá)重組蛋白質(zhì)的酶學(xué)性質(zhì)，進(jìn)一步證實(shí)其中一個(gè)點(diǎn)突變來(lái)源于個(gè)體差異的推測(cè)，及其他生物信息學(xué)的分析結(jié)果的可靠性。在證實(shí)重組蛋白質(zhì)相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)后，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件，以期在發(fā)酵周期內(nèi)獲得最大的生物量，為后續(xù)的開(kāi)發(fā)利用創(chuàng)造條件。

圖8 GS115-GT不同時(shí)間的SDS-PAGE圖譜Fig.8 SDS-PAGE analysis of expression by GS115-FT

作者利用分子生物學(xué)技術(shù)成功克隆了奶牛的FT基因，并在真核系統(tǒng)中可溶性表達(dá)，這為FT的大量制備提供了可能，為后續(xù)的科研工作，如酶學(xué)性質(zhì)、Slex的生物合成及相關(guān)生理、病理機(jī)理等方面的深入研究打下了良好的基礎(chǔ)。

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