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      微生態(tài)制劑對仔豬生長性能及腸道菌群的影響

      2014-12-25 02:27:58商志偉
      關(guān)鍵詞:蠟樣鼠李糖益生菌

      王 娜 , 商志偉 , 趙 敏

      (1.東北林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江民族職業(yè)學(xué)院 學(xué)生工作部,黑龍江 哈爾濱150066;3.黑龍江民族職業(yè)學(xué)院 食品工程系,黑龍江 哈爾濱 150066)

      近年來,關(guān)于動物腸道微生態(tài)的研究日益受到人們重視。一方面,人們試圖從腸道微生態(tài)角度尋求作為動物促生長劑——抗生素的替代品[1];另一方面,動物腸道被認(rèn)為是人腸道研究的理想模型[2]。而能夠調(diào)控動物腸道微生物平衡、增殖有益菌、抑制有害菌,從而提高動物健康水平的微生態(tài)制劑(probiotics)[3]正日益受到人們的關(guān)注。有研究報道,合理利用微生態(tài)制劑,可以有效地減少仔豬斷奶應(yīng)激的發(fā)生,仔豬飼喂微生態(tài)制劑后,其可有效定植在仔豬腸道內(nèi)[4],能提高動物腸道中的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性[5],并能夠調(diào)節(jié)腸道菌群,使在仔豬腸道中對宿主健康起有益作用的細菌數(shù)量大幅提高[6],還可以有效抑制致病菌的生長,維持腸道正常的生態(tài)平衡[7-8],預(yù)防和治療仔豬腹瀉[9]。此外,其無殘留、無毒副作用等特點,可改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境,使養(yǎng)殖生產(chǎn)良性發(fā)展,取得更好的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益[10]。動物腸道環(huán)境不斷變化,并且受多種因素影響,在益生菌的配制方面,一般認(rèn)為混合菌制劑有益于微生物間的互補,效果較好。Collado等[11]將幾種不同乳酸菌進行了復(fù)配,并對其腸道抑菌效果進行了試驗。結(jié)果表明,混合菌株的效果好于單獨菌株。Sanders等[12]研究不同益生菌屬、種和菌株對宿主的益生作用,也發(fā)現(xiàn)復(fù)合的菌株或菌種比單一菌株更有效。

      在本研究中,作者首次將蠟樣芽孢桿菌、戊糖乳桿菌和鼠李糖乳桿菌等進行混合,通過飼喂斷奶仔豬,研究其對仔豬生長性能的影響,再進一步研究微生態(tài)制劑在仔豬腸道定植情況及其對腸道菌群的影響,旨在深入了解微生態(tài)制劑對斷奶仔豬生長可能的調(diào)控機制,為菌種的合理搭配和復(fù)合微生物制劑的生產(chǎn)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 微生態(tài)制劑

      蠟樣芽孢桿菌,由作者所在試驗室從健康斷奶仔豬糞便中分離并鑒定,現(xiàn)存于東北林業(yè)大學(xué)微生物實驗室;鼠李糖乳桿菌(CICC6159)、戊糖乳桿菌(CICC 21809),購置于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

      戊糖乳桿菌培養(yǎng)基配方為:1 g/dL乳糖+廢糖蜜,0.5 g/dL棉粕粉,0.3 g/dL磷酸二氫鈉+磷酸氫二鈉;蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)基為:0.5 g/dL蔗糖+0.5 g/dL廢糖蜜,1 g/dL棉粕粉,0.3 g/dL氯化鈉;鼠李糖乳桿菌培養(yǎng)基配方為:1 g/dL乳糖+廢糖蜜,0.5 g/dL棉粕粉,0.3 g/dL磷酸二氫鈉+磷酸氫二鈉。

      分別發(fā)酵戊糖乳桿菌、蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌,將發(fā)酵液以8 000 g離心10 min得菌泥,向菌泥中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%葡萄糖溶液作為保護劑,再拌入適量滅菌干燥的稻殼粉(3種益生菌活菌數(shù)≧1×1010cfu/g),低溫干燥,得活菌制劑,檢測 3種活菌制劑活菌數(shù)(活菌數(shù)≧1×109cfu/g)后備用,將制備好的3種菌制劑以1∶1∶1體積比例混合即得混合微生態(tài)制劑。

      1.2 飼養(yǎng)管理及動物試驗

      試驗于大慶市泰康縣康泰公司種豬場進行,選用 28 日齡,初始平均體質(zhì)量為(8.20±0.22)kg 的“杜長 大”三元雜交健康(無腹瀉)斷奶仔豬24頭,仔豬隨機分為兩組(對照組和試驗組),每組4個重復(fù),每個重復(fù)3頭仔豬。以玉米-豆粕型日糧,營養(yǎng)需要參照英瑞斯企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(表1),飼料為粉料。對照組飼喂正常粉料,試驗組采用粉料拌食質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%混合微生態(tài)菌制劑(飼料活菌數(shù)≧1×109cfu/kg)為日糧。試驗期為63 d(試驗組飼喂微生態(tài)制劑56 d+飼喂正常粉料 7 d),每日 8∶00、13∶00、19∶00 喂食,自由飲水;每次飼喂直至料槽剩余少許飼料為止,準(zhǔn)確記錄每日每個重復(fù)組仔豬日供料量、剩余料量和損失料量,每7 d對兩組仔豬逐只空腹稱質(zhì)量。試驗期間,每日8∶00定時觀察仔豬糞便情況(是否存在糞質(zhì)稀薄,水分增加,或含未消化食物或膿血、黏液)。記錄腹瀉頭數(shù)及次數(shù),計算腹瀉率。腹瀉率=(總腹瀉次數(shù)/(總頭數(shù)×試驗天數(shù)))×100%。

      表1 基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平Table 1 Basic diet formula and nutrition levels

      1.3 糞便收集

      試驗期間,每7 d一次于晨8∶00對各重復(fù)組仔豬逐只直腸取便少許 (約10 g),立刻放入無菌管中,于-80℃冰箱保存,備用。

      1.4 糞樣中pH值測定

      分別取不同時間點備用糞樣2 g,加入l0 mL蒸餾水,混勻后靜置5 min,用酸度計測定pH值。

      1.5 PCR法檢測仔豬糞便益生菌相對含量

      1.5.1 細菌基因組提取及引物設(shè)計 分別取不同時間點備用糞樣2 g,放入組織粉碎機中磨碎,加5 mL無菌磷酸緩沖液稀釋,充分混勻,取2 mL勻漿,采用solarbio細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌種基因組DNA。在GenBank上查找蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌菌株的16S rDNA序列,然后利用 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)設(shè)計屬內(nèi)特異性引物,上下游引物序列見表2。

      表2 蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌和戊糖乳桿菌特異性引物Table 2 Primer sequences for genes in Bacillus cereus,Lactobacillus rhamnosus and Lactobacillus pentosus

      1.5.2 PCR法檢測樣品糞便蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌和戊糖乳桿菌相對含量 PCR程序參考陳津津[13]等方法并加以改進:10×PCR Buffer,25 mmol/L Mg2+,200 μmol/L dNTPS, 上下游引物 0.2 (μmol/L)/0.2(μmol/L),DNA模板1μL,1.25UTaq酶(Promega);反應(yīng)條件:94℃變性3 min;循環(huán)35次;94℃變性40 s,55℃退火20 s,72℃延伸 75 s;72℃延伸5 min。

      1.6 DGGE分析微生態(tài)制劑對仔豬腸道菌群的影響

      選取斷奶當(dāng)天,斷奶后7、14、21、28 d和63 d收集的兩組仔豬糞樣供DNA提取,方法同上。

      利用一對細菌通用的引物 F933-954:5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCAC GGGGGGGCACAAGCGGTGGAGCATGTGG -3’,R1369-1388:5’-GCCCGGGAACGTATTCACCG-3’對細菌的16S rDNA的V6—V8區(qū)片段進行PCR反應(yīng)[14]。DGGE用質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%聚丙烯酰胺凝膠,尿素質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度30%~50%,電泳緩沖液為0.5×TAE,先200 V恒壓電壓預(yù)電泳10 min,隨后在85 V電壓電泳10~12 h。電泳結(jié)束后,用銀染法進行染色,顯色定影后干燥過夜,觀察染色效果并照相。

      將DGGE凝膠圖譜上的特殊條帶進行回收,以8 f和1 510 r[15]作為PCR引物用于引導(dǎo)細菌16S rDNA全序列的擴增,然后將PCR產(chǎn)物進行膠回收,與PMD-18T質(zhì)粒連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)中,將轉(zhuǎn)化成功的質(zhì)粒進行測序,序列的同源性通過互聯(lián)網(wǎng)與GenBank數(shù)據(jù)庫進行比較。

      1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

      所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行方差顯著性分析。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 微生態(tài)制劑對仔豬生長性能的影響

      仔豬斷奶時由于環(huán)境、飼料、消化生理和免疫等因素的改變,易使斷奶仔豬產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),出現(xiàn)消化吸收功能異常,消化道正常微生物區(qū)系紊亂,導(dǎo)致腹瀉和生長發(fā)育受阻[16]。由表3可知,喂食微生態(tài)制劑可以促進仔豬的生長,降低料質(zhì)量比和腹瀉率。在喂食微生態(tài)制劑前兩周時,與對照組相比,試驗組仔豬頭平均日增質(zhì)量增加35%,平均料質(zhì)量比降低9.04%,腹瀉率下降37.04%;喂食3~4周時,仔豬頭平均日增質(zhì)量增加26.32%,平均料質(zhì)量比降低7.7%,腹瀉率下降26.32%;喂食5~8周時,頭平均日增質(zhì)量增加10.71%,平均料質(zhì)量比降低7.7%,腹瀉率下降12.03%。說明微生態(tài)制劑對仔豬生產(chǎn)性能的影響具有顯著的時間效應(yīng),在仔豬斷奶初期微生態(tài)制劑對仔豬的影響最顯著。

      本研究中,飼喂混合微生態(tài)菌制劑2周后頭平均日增質(zhì)量增加35%,平均料質(zhì)量比降低9.04%,腹瀉率下降37.04%,與黃麗彬[17]和王海東[18]等研究相比較,此混合微生態(tài)菌制劑效果更佳,這可能是由于本微生態(tài)制劑中的菌種間發(fā)生協(xié)調(diào)作用,相互促進各自在腸道內(nèi)的有益作用,使其益生效果更加明顯。

      2.2 微生態(tài)制劑對仔豬糞樣pH值的影響

      通常認(rèn)為,糞便的pH值可部分反映動物消化道中的酸堿程度。pH值偏酸,反映消化道環(huán)境有利于有益微生物的生長,而偏堿則反映對有害微生物有利,產(chǎn)生腹瀉的概率較大[19]。

      由圖1可知,試驗期間,由于斷奶的影響,在對照組中,仔豬糞便pH呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,直到35 d后pH值才逐漸恢復(fù)到斷奶當(dāng)日水平。試驗組仔豬糞樣pH始終較對照組低,且基本保持在斷奶水平。

      表3 微生態(tài)制劑對仔豬生長性能的影響Table 3 Effents of compound probiotic on growth performance of weaning piglet

      圖1 微生態(tài)制劑對仔豬糞便pH值的影響Fig.1 Effents of compound probiotic on pH of weaning pigle

      圖1說明,通過飼喂本微生態(tài)制劑使仔豬消化道保持偏酸性環(huán)境,可利于有益微生物的生長。有研究表明,腸道中的酸性環(huán)境有利于營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,可提高飼料利用率,這點恰好與微生態(tài)制劑促進仔豬生長性能相吻合。

      2.3 糞便中3種目標(biāo)益生菌相對含量變化分析

      研究表明,對糞便微生物數(shù)量的動態(tài)監(jiān)測可以反映目標(biāo)益生菌在腸道內(nèi)定植過程的演變規(guī)律[20]。圖 2(a)(b)(c)各為飼喂微生態(tài)菌制劑后跟蹤檢測3種目標(biāo)益生菌——蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌和戊糖乳桿菌于仔豬體內(nèi)相對于斷奶當(dāng)日變化情況。結(jié)果表明,由于斷奶的影響,對照組中兩種乳酸桿菌在仔豬斷奶初期顯著降低,而試驗組中3目標(biāo)菌數(shù)量均明顯高于對照組,隨喂食時間的延長試驗組中3種目標(biāo)菌在腸道內(nèi)的含量有增加的趨勢,并且在停喂一周后,糞樣中仍存在此3種益生菌,且數(shù)量較飼喂時無明顯變化。說明,在飼喂8周后微生態(tài)制劑中益生菌已成功定植到仔豬消化道中,可以幫助減緩斷奶時仔豬消化道內(nèi)乳酸菌的變化,維持其腸道的穩(wěn)定性。

      圖2 仔豬糞便中3種益生菌隨時間變化情況Fig.2 Changes of Bacillus cereus,Lactobacillus rhamnosus,and Lactobacillus pentosus on flora in weanling piglets over time

      有研究表明,益生菌進入動物體內(nèi)可通過定植繁殖來維持消化道有益菌的優(yōu)勢作用,并與腸道中的病原菌及潛在的致病菌競爭營養(yǎng)物質(zhì),從而抑制有害菌的生長[21-22],提高機體的抗應(yīng)激能力[23],進一步促進仔豬的生長。

      2.4 微生物制劑對斷奶仔豬腸道菌群的影響

      利用DGGE技術(shù)對斷奶仔豬糞樣菌群進行跟蹤研究,結(jié)果見圖3,并將特殊條帶摳膠測序,見表4。

      圖3 仔豬糞樣細菌16S rDNA的V6-V8區(qū)擴增產(chǎn)物的DGGE圖譜Fig.3 Bacterial DGGE profiles generated from V6-V8 16S rDNA fragments of piglets fecal samples

      結(jié)果表明,蠟樣芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌和戊糖乳桿菌均存在于飼喂益生菌的仔豬糞樣中,且此3益生菌數(shù)量顯著高于對照組,這與qPCR結(jié)果相一致,再次說明3種益生菌成功定植在仔豬腸道內(nèi)。并且,本微生態(tài)制劑可以通過增加宿主腸道益生菌(X1、X5、X6、X7、X12和X13)的數(shù)量及減少有害菌(X9和X10)的方式來調(diào)節(jié)腸道功能。如蠟樣芽孢桿菌X1,是一種兼性厭氧菌,可以在腸道內(nèi)短時間定植,消耗大量的氧,維持腸道厭氧環(huán)境,有益于厭氧的乳酸菌的生長;X6、X7和X13均為乳酸菌,眾所周知,乳酸菌是動物腸道中常見的益生菌,其在抑制動物腸道有害細菌的生長繁殖,抵抗病原茵的感染,代謝產(chǎn)生醋酸、丙酸、丁酸和乳酸等有機酸,刺激腸道蠕動,抑制腸道腐敗,提高抗病能力等方面,都有著重要的作用。所以認(rèn)為,添加本微生態(tài)制劑可創(chuàng)造出有利于乳酸菌生長繁殖的環(huán)境,通過增殖腸道益生菌的數(shù)量來調(diào)節(jié)仔豬腸道菌群的平衡,進而緩解仔豬斷奶應(yīng)激反應(yīng)及促進仔豬生長。

      表4 圖3中DGGE圖譜中特異性條帶的16S rDNA序列分析及物種鑒定Table4 16S rDNA sequenceanalysisand species identification ofselected dominant DGGE bands in Fig.3

      3 結(jié)語

      在本文所述試驗條件下,飼喂微生態(tài)制劑可以通過在仔豬消化道內(nèi)定植益生菌來增加斷奶仔豬日增質(zhì)量,降低料質(zhì)量比和腹瀉率,維持仔豬腸道中pH值的穩(wěn)定,促進腸道益生菌的生長繁殖,抑制有害菌的生長;并且,此微生態(tài)制劑對仔豬生長性能的影響有時間效應(yīng),在仔豬斷奶初期效果最佳。

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