離子排斥色譜法測(cè)定黃酒中的13種有機(jī)酸

林曉婕， 魏 巍， 何志剛， 林曉姿＊

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心，福建 福州350013；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建 福州350013）

黃酒也稱為米酒，是我國(guó)歷史最悠久的傳統(tǒng)釀造酒，作為傳統(tǒng)的保健養(yǎng)生佳品，其功用和價(jià)值早已得到廣泛的認(rèn)可和應(yīng)用［1］，國(guó)家也將其列入了“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃的重點(diǎn)科研項(xiàng)目中；然而，對(duì)黃酒功效和活性物質(zhì)的研究還停留在起步階段，同時(shí)生產(chǎn)中發(fā)生的黃酒酸敗問(wèn)題不僅降低了出酒率，還常常造成生產(chǎn)加工上的困難［2］；2004年以來(lái)，黃酒的相關(guān)研究顯著增加，大大提高了對(duì)黃酒理化檢測(cè)和發(fā)酵工藝的研究水平，但對(duì)于有機(jī)酸等活性物質(zhì)仍不能滿足多種物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)需求。因此，有必要建立一種快速、準(zhǔn)確、同時(shí)檢測(cè)多種有機(jī)酸的方法，從而深入對(duì)黃酒活性物質(zhì)的研究，為黃酒的工藝控制和新品種研發(fā)提供支持。

黃酒中的有機(jī)酸包括琥珀酸、乳酸、醋酸、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、草酸等，其中部分來(lái)自原料或酵母代謝產(chǎn)生；部分由細(xì)菌污染產(chǎn)生，如丁酸等［2，3］。有機(jī)酸不僅構(gòu)成黃酒的組成成分，同時(shí)又是風(fēng)味成分的前體物質(zhì)，在貯存過(guò)程中部分逐步形成芳香酯，增加濃厚感，降低甜度［4］。目前有機(jī)酸的分析方法主要有滴定法［5］、分光光度法［6］、酶法［7］、熒光法［8］、薄層色譜法［9］、毛細(xì)管電泳法［10］、分子印跡固相萃取法［11］、氣相色譜法［12］、高效液相色譜法［13］等，國(guó)內(nèi)外大多利用高效液相色譜法來(lái)檢測(cè)有機(jī)酸［14］。呂旭聰?shù)龋?5］建立了針對(duì)黃酒和葡萄酒中酒石酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸的反相高效液相色譜檢測(cè)方法。近年發(fā)展起來(lái)的離子排斥色譜法（ion-exclusion chromatography，IEC）操作更為簡(jiǎn)便，樣品前處理簡(jiǎn)單，極適合含水基體，對(duì)強(qiáng)親水性和強(qiáng)揮發(fā)性的物質(zhì)不會(huì)造成損失，幾乎不受無(wú)機(jī)陰離子的干擾，對(duì)有機(jī)酸的分析具有特異性且檢出限低［16］。目前，采用IEC 測(cè)定黃酒中的有機(jī)酸尚未見(jiàn)報(bào)道。本文建立了IEC 測(cè)定黃酒中有機(jī)酸的方法，同時(shí)對(duì)13種有機(jī)酸進(jìn)行了定性定量分析，該方法操作較反相液相色譜法更為簡(jiǎn)便，靈敏度、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性高，為黃酒發(fā)酵品質(zhì)的監(jiān)控、產(chǎn)品質(zhì)量的提升提供了相關(guān)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

e2695型高效液相色譜儀及2998型光電二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；Milli-Q 超純水系列（美國(guó)密理博公司）；Christ RVC2-18 臺(tái)式離心濃縮儀；梅特勒XP205DR電子天平（精確到0.01 mg）。Sep-pak C18 200 mg 固 相 萃 取 小 柱（美 國(guó)Waters公司）。草酸、馬來(lái)酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、琥珀酸、乳酸、富馬酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、蟻酸（美國(guó)Sigma公司）；乙腈（德國(guó)默克公司）；硫酸（優(yōu)級(jí)純）。取福建6家知名黃酒品牌的市售產(chǎn)品為樣品，分別編號(hào)為1?！?＃。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：IC-Pak Ion Exclusion 色 譜 柱（WAT010290，Waters公司）（300 mm×7.8 mm，7μm）及IC-Pak Ion Exclusion Insert 保 護(hù) 柱 芯（WAT020770，Waters公司）。柱溫50 ℃。流動(dòng)相：H2SO4溶液（A）與乙腈（B）的混合溶液（體積比為98∶2），線性梯度程序：0～40 min，流動(dòng)相A 的濃度由0.01 mol／L上升到0.02 mol／L；40～50 min，流 動(dòng) 相A 的 濃 度 為0.01 mol／L；流 速 為0.5 mL／min。進(jìn)樣體積為10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

1.3 樣品預(yù)處理

參 照 郭 燕 等［17］、Usenik 等［18］的 方 法，樣 品 以10 000 g離心10 min，取上清液，稀釋至適當(dāng)濃度后，用0.45μm 濾膜過(guò)濾，備用。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別精密稱取適量草酸、馬來(lái)酸、富馬酸5 mg，檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、琥珀酸、乳酸50 mg，吸取1 g／L乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸50μL，用超純水溶解并定容至5 mL，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相成分的選擇 參考文獻(xiàn)［19，20］報(bào)道，選擇蟻酸、硫酸的水溶液為流動(dòng)相水相，以酸濃度0.01 mol／L、流速0.5 mL／min、柱溫50℃、水相溶液（A）與乙腈（B）的混合溶液（體積比為98∶2）對(duì)有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品進(jìn)行了分析測(cè)定，結(jié)果表明：以蟻酸為流動(dòng)相水相時(shí)，在30 min內(nèi)未見(jiàn)出峰；以硫酸作流動(dòng)相水相時(shí)，檸檬酸與酒石酸、琥珀酸與乳酸均未基線分離，其余9種有機(jī)酸基本得到基線分離。

硫酸濃度的選擇 考察不同硫酸濃度（0.004、0.006、0.008、0.010、0.015、0.020 mol／L）條件下的分離情況。結(jié)果表明，硫酸濃度越低，檸檬酸與酒石酸、琥珀酸與乳酸的分離效果越差，當(dāng)硫酸濃度為0.004 mol／L時(shí)，檸檬酸與酒石酸重疊；隨著硫酸濃度的增大，檸檬酸與酒石酸、琥珀酸與乳酸的分離效果越來(lái)越好，但馬來(lái)酸與檸檬酸、富馬酸與醋酸的分離度降低，因此選擇了1.2 節(jié)的梯度洗脫流動(dòng)相。在此條件下，13種有機(jī)酸在30 min內(nèi)均得到了很好的分離。

乙腈比例的選擇 分別考察了不同體積比（98∶2、96∶4、94∶6）的H2SO4溶液與乙腈的混合溶液。結(jié)果表明，流動(dòng)相中不同的乙腈比例對(duì)有機(jī)酸分離效果沒(méi)有影響，隨著乙腈比例的加大，柱壓升高，因此選擇體積比為98∶2。

2.1.2 流速的選擇

固定1.2 節(jié)其他條件不變，考察了不同流速（0.3、0.5、0.8、1 mL／min）對(duì)分離效果的影響。結(jié)果表明，流速越低，分離度越好，分析時(shí)間越長(zhǎng)；當(dāng)流速為0.3 mL／min時(shí)，分析時(shí)間為50 min，綜合考慮分離度和分析時(shí)間，選擇流速為0.5 mL／min。

2.1.3 柱溫的選擇

分別考察了30、40、45、50、55、60℃這6個(gè)柱溫條件，結(jié)果表明，隨著柱溫升高，各種有機(jī)酸分離度增加，但溫度超過(guò)55℃時(shí)，基線漂移嚴(yán)重，因此選擇50 ℃柱溫，13種有機(jī)酸達(dá)到定量要求。

2.1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

13種有機(jī)酸的紫外最大吸收峰均在210 nm 左右，硫酸溶液在210 nm 處幾乎沒(méi)有紫外吸收，因此選擇在210 nm 處檢測(cè)有機(jī)酸。

在優(yōu)化的色譜條件下，對(duì)混合的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢測(cè)，草酸、馬來(lái)酸、富馬酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸的質(zhì)量濃度依次為0.005、0.005、0.500、0.500、0.500、0.030、0.500、0.500、0.005、1.000、1.000、1.000、1.000 g／L。從圖1 可以看出，13 種有機(jī)酸能夠較好的分離和檢出。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍與檢出限

將13種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC 分析，對(duì)各測(cè)得值進(jìn)行相關(guān)系數(shù)分析和線性回歸分析。結(jié)果（見(jiàn)表1）表明，除了草酸和抗壞血酸的相關(guān)系數(shù)分別為0.999 8和0.999 7外，其他11種有機(jī)酸的相關(guān)系數(shù)都為0.999 9，說(shuō)明各種有機(jī)酸組分的峰面積和有機(jī)酸組分的質(zhì)量濃度的線性相關(guān)性很好，在此條件下可以很好地測(cè)定有機(jī)酸的含量。當(dāng)信噪比（S／N）為3時(shí)，測(cè)得13 種有機(jī)酸的檢出限，草酸、馬來(lái)酸、醋酸、丙酸、異丁酸和丁酸的檢出限為0.01 mg／L，富馬酸的檢出限為0.001 mg／L，其余6種有機(jī)酸的檢出限為0.1 mg／L。

表1 13種有機(jī)酸的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 1 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients，limits of detection of the 13 organic acids

圖1 有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of organic acid standards

2.2.2 精密度考察

將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，根據(jù)所得峰面積考察精密度，草酸、馬來(lái)酸、富馬酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、丙酸、異丁 酸、丁 酸 的RSD 分 別 為0.4%、0.2%、0.8%、0.5%、0.3%、0.5%、0.2%、0.4%、0.1%、0.2%、0.3%、0.2%、0.2%，表明該方法的精密性良好。

2.2.3 重復(fù)性

取同一份混合均勻的黃酒樣品5份，離心后用0.45μm 濾膜過(guò)濾待測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣，測(cè)得草酸、馬來(lái)酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、琥珀酸、乳酸、乙酸的平均質(zhì)量濃度分別為0.005 1、0.000 5、0.055 9、0.270 5、0.466 2、0.107 2、3.888 7、4.552 4、0.000 4 g／L，RSD 分 別 為0.2%、1.9%、0.7%、0.4%、2.0%、1.3%、2.1%、0.2%、2.1%，表明該方法的重復(fù)性達(dá)到分析的要求。

2.2.4 回收率

采用加標(biāo)回收法測(cè)定回收率。精確量取10 mL按1.3節(jié)方法處理的同一樣品5份，加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.45μm 濾膜過(guò)濾，平行測(cè)定5次，根據(jù)加標(biāo)濃度和測(cè)定濃度計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)品的回收率及RSD。結(jié)果（見(jiàn)表2）表明，各有機(jī)酸的回收率為93.4%～103.8%，RSD 為0.1%～1.5%。

表2 13種有機(jī)酸的回收率及精密度（RSD）（n＝5）Table 2 Recoveries and precisions of the 13 organic acids（n＝5）

2.3 樣品測(cè)定

圖2 黃酒樣品中有機(jī)酸的HPLC 譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of organic acids in a rice wine sample

對(duì)福建6家知名黃酒品牌的市售產(chǎn)品測(cè)定有機(jī)酸的組成和含量。黃酒中的組分很多，除有機(jī)酸外，還含有色素、氨基酸、多酚、糖等干擾組分，經(jīng)固相萃取和高速離心預(yù)處理黃酒樣品的色譜分離度差異不大，出于成本及操作簡(jiǎn)便的考慮，選擇采用高速離心的方法處理樣品。圖2為3＃樣品的色譜圖，黃酒樣品中的有機(jī)酸含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。表3 表明，因各種酒的釀造工藝和原材料的不同，含有的有機(jī)酸的種類和含量也有所不同。6種黃酒樣品中乳酸和琥珀酸的含量相對(duì)較高，其中乳酸主要由乳酸菌的同型發(fā)酵產(chǎn)生，琥珀酸主要由乳酸菌的異型發(fā)酵產(chǎn)生，草酸、馬來(lái)酸和富馬酸的含量相對(duì)較低，均不含丙酸、異丁酸和丁酸。

表3 黃酒樣品中的有機(jī)酸含量（n＝5）Table 3 Contents of organic acids in rice wine samples（n＝5） g／L

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種利用離子排斥色譜同時(shí)測(cè)定13種有機(jī)酸含量的方法，該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，不僅適用于福建黃酒樣品中有機(jī)酸的分析，也可用于其他酒中有機(jī)酸的分析。該方法成功地定性定量分析了黃酒中的主要有機(jī)酸，該方法對(duì)黃酒發(fā)酵過(guò)程中的有機(jī)酸動(dòng)態(tài)研究及黃酒生產(chǎn)質(zhì)量控制具有實(shí)用價(jià)值。

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