固相萃取-超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定血液中的4種蘇丹染料

朱 浩， 黃坤玉， 付建飛， 胡 岳， 黃嫻妮， 陳曉紅， 鄒寶波， 金米聰

（1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波315211；2.寧波市疾病預(yù)防控制中心，浙江省微量有毒化學(xué)物健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波315010；3.寧波市疾病預(yù)防控制中心，寧波市毒物研究與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波315010）

蘇丹染料（蘇丹Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）是指分子結(jié)構(gòu)中含有偶氮基（-N＝N-）發(fā)色團(tuán)的一類人工合成的脂溶性偶氮染料，主要用于紡織品、橡膠、塑料、油漆等的著色［1］。研究表明蘇丹染料分子可以通過(guò)多種途徑接觸到人體，并透過(guò)生物膜進(jìn)入血液，再隨著血液的循環(huán)流動(dòng)，分散到全身各組織細(xì)胞，與生物體內(nèi)的大分子（蛋白質(zhì)、DNA 等）相結(jié)合，進(jìn)而產(chǎn)生一定程度的致敏性與致癌性［2］。鑒于蘇丹染料的嚴(yán)重危害，一些國(guó)家和世界權(quán)威組織相繼頒布了嚴(yán)格的法律法規(guī)和技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)令禁止蘇丹染料作為食品添加劑應(yīng)用于食品，并被世界癌腫研究機(jī)構(gòu)（IARC）列為第3類可能致癌物質(zhì)［3，4］。

目前，檢測(cè)這4種蘇丹染料的方法主要有分光光 度 法［5］、薄 層 色 譜 法［6］、電 化 學(xué) 法［7］、酶 聯(lián) 免 疫法［8］、液 相 色 譜 法［9-14］、氣 相 色 譜-質(zhì) 譜 聯(lián) 用法［13，15，16］、液相 色 譜-質(zhì) 譜 聯(lián) 用 法［16-21］及 毛 細(xì) 管 電泳法［22］等，這些方法的靈敏度、選擇性和分析通量存在差異?；谑称坊|(zhì)中蘇丹染料的分析研究［4-13，15-22］比較多，而生物基質(zhì)較少。雖然目前何榮等［14］以鎂試劑Ⅱ作為內(nèi)標(biāo)，采用高效液相色譜法測(cè)定了血液中的蘇丹染料，但是方法的檢出限較高，適用性有限，因此亟須針對(duì)生物基質(zhì)樣品中的染料殘留建立一套穩(wěn)定可靠、靈敏度高的檢測(cè)方法，以便對(duì)染料的危害進(jìn)行定量評(píng)估。超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UFLC-MS／MS）具有較高的靈敏度與選擇性，現(xiàn)已成為一種人們比較認(rèn)可的并用于有毒化學(xué)物殘留測(cè)定與確證分析的有力技術(shù)手段。本研究結(jié)合固相萃取凈化，建立了同時(shí)測(cè)定血液樣品中4種蘇丹染料的UFLC-MS／MS方法，并應(yīng)用于蘇丹染料殘留的實(shí)際檢測(cè)工作。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Prominence UFLC XR 型超快速液相色譜儀，配有LC-20AD 輸液泵、SIL-20AC 自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20AC 柱溫箱和DGU-20A3脫氣機(jī)（日本島津株式會(huì)社）；API 5500型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX 公 司）和Analyst 1.5.1 數(shù) 據(jù) 處 理 系統(tǒng)；全玻璃溶劑過(guò)濾器（美國(guó)Waters公司）；Milli-Q純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；12孔固相萃取儀（美國(guó)Supelco 公司）；KQ-100B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sorvall Legend RT離心機(jī)（德國(guó)Heraeus公司）；N-EVAP111氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）；WH-1 型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

實(shí)驗(yàn)用水均為Milli-Q 純水系統(tǒng)制備的超純水；甲醇、乙腈和正己烷均為色譜純（德國(guó)Merck公司）；甲酸和乙酸銨均為色譜純（美國(guó)ROE Scientific公 司）；蘇 丹Ⅰ（純 度＞95.0%）、Ⅱ（純 度＞99.0%）、Ⅲ（純度＞98.0%）、Ⅳ（純度＞98.0%）對(duì)照品均購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；Cleanert C18固相萃取柱（6 mL／500 mg）（天津Agela Technologies公司）；空白血液樣品由寧波大學(xué)附屬醫(yī)院提供。

1.2 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm）；流動(dòng)相：0.1%（v／v）甲酸水溶液（A），0.1%甲酸（v／v）乙腈溶液（B）。柱溫：40.0℃；流速：0.45 mL／min；進(jìn)樣量：5μL。梯度洗脫程序：0～2.00 min，10%B～95%B；2.00～4.50 min，95%B；4.50～4.51 min，95%B～10%B；4.51～6.50 min，10%B。

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描（ESI＋）；定量檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；電噴霧電壓：4 500 V；霧化氣壓力：344.8 kPa（50.0 psi）；輔助氣流速：344.8 kPa（50.0 psi）；氣簾氣壓力：275.9 kPa（40.0 psi）；碰 撞 氣 壓 力：41.4 kPa（6.0 psi）；離子源溫度：500 ℃；掃描時(shí)間：50 ms；碰撞室出口電壓：10.0 V；碰撞室入口電壓：10.0 V；保留時(shí)間、Q1／Q3離子對(duì)、碰撞能量（CE）及去簇電壓（DP）見表1。

表1 4種蘇丹染料的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MRM parameters for the four Sudan dyes

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取適量的各種蘇丹染料對(duì)照品，用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成1 000 mg／L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在-20 ℃下避光儲(chǔ)存。準(zhǔn)確吸取各種染料標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.10 mL至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成10.0 mg／L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。使用時(shí)用乙腈逐級(jí)稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，在4 ℃下避光保存。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確吸取0.5 mL的血液樣品于20 mL聚四氟乙烯離心管中，加入5 mL 乙腈，迅速振蕩渦旋10 min，超聲提取10 min，20 000 r／min 高速 離心5 min，取出上清液；重復(fù)提取1次，合并上清液。取5 mL上清液于另一支干凈的離心管中，加入5 mL水，混勻，移入預(yù)先依次用6 mL甲醇和6 mL 水活化平衡后的C18 固相萃取小柱，用乙腈-水（1∶1，v／v）溶液5 mL淋洗后抽干，最后用5 mL正己烷進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。經(jīng)氮吹儀濃縮至近干后，加入0.5 mL乙腈溶解殘?jiān)?，過(guò)0.2μm 濾膜，避光放置12 h后，供UFLC-MS／MS測(cè)定分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白沉淀／萃取劑的選擇

鑒于血液基質(zhì)中具有較多的蛋白成分，常需要選擇合適的蛋白沉淀劑。由于與色譜分析過(guò)程中流動(dòng)相的組成相同，乙腈、甲醇等有機(jī)溶劑經(jīng)常作為蛋白沉淀劑用于分析檢測(cè)的前處理［23］。蘇丹類染料屬于脂溶性染料，具有較高的疏水常數(shù)（logP）（如蘇丹Ⅰ：5.86），較易溶于乙腈、甲醇和正己烷等有機(jī)溶劑［13］。為取得最佳的萃取效果，試驗(yàn)中比較了乙腈、甲醇和正己烷分別作為沉淀劑對(duì)染料物質(zhì)的回收率，結(jié)果如圖1所示。由圖1可看出，在使用甲醇和正己烷時(shí)4 種蘇丹染料的平均回收率分別為42.7%～87.5%和37.1%～71.8%，使用乙腈時(shí)的回收率最高，平均為86.9%～104.5%。這可能是由于乙腈作為蛋白沉淀劑時(shí)，易產(chǎn)生細(xì)微的蛋白沉淀［23］，有利于染料物質(zhì)的析出，不易被包覆；而甲醇沉淀蛋白易產(chǎn)生絮狀沉淀，染料物質(zhì)易被包埋，回收率比較低；正己烷不能沉淀蛋白，和血液樣品成懸浮混濁液，會(huì)黏附目標(biāo)物，不利于固相萃取凈化。

圖1 提取溶劑對(duì)4種染料平均回收率的影響Fig.1 Effect of extraction solvents on the average recoveries of the four dyes

2.2 絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的比較

設(shè)計(jì)了3組含有相同濃度的各種目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)系列，分別比較了低、中、高3個(gè)不同添加水平（0.5、2.0、15.0μg／L）下各待測(cè)物的色譜峰面積。利用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)系列組（A）、空白血樣基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)系列組（B）和經(jīng)過(guò)SPE凈化的空白血樣基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)系列組（C）計(jì)算未凈化和凈化后的絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)Ewithoutpurification和ESPEpurification，結(jié) 果 如 表2 所 示。Ewithoutpurification在21.38%～67.76%范圍內(nèi)，這表明空白血樣直接萃取后測(cè)定時(shí)存在較大的基質(zhì)效應(yīng)，此時(shí)基質(zhì)對(duì)4種蘇丹染料均產(chǎn)生了明顯的抑制效應(yīng)；而ESPEpurification在85.44%～105.67%范圍內(nèi)，這表示經(jīng)C18 SPE 凈化后，基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的測(cè)定干擾較小，SPE可有效降低血液樣品中蘇丹系列目標(biāo)物測(cè)定的基質(zhì)效應(yīng)。

2.3 固相萃取方法的選擇與優(yōu)化

這4種蘇丹類染料的極性比較弱，在反相C18色譜柱上均具有較強(qiáng)保留，可以使用反相機(jī)理的固相萃取柱進(jìn)行凈化［1，13］。實(shí)驗(yàn)比較了3種常用的固相萃取柱（中性氧化鋁柱、弱陽(yáng)離子交換柱（WCX）和C18柱）的處理效果，發(fā)現(xiàn)蘇丹類染料物質(zhì)在中性氧化鋁柱上的保留較差；在WCX 柱上的吸附性較強(qiáng)，不易洗脫；采用C18固相萃取柱，各種物質(zhì)均具有較好的回收率，平均為91.7%～103.4%。C18固相萃取柱凈化處理過(guò)程中，結(jié)合固相萃取柱填料的性質(zhì)，考察了上樣液中水與有機(jī)溶劑的最佳體積比（見圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)上樣液中乙腈含量超過(guò)50%時(shí)，蘇丹Ⅰ保留性較差，易于流失；當(dāng)水與乙腈的體積比約為1∶1時(shí)，各物質(zhì)均能較好地保留吸附。實(shí)驗(yàn)中選擇正己烷洗脫，主要基于正己烷對(duì)蘇丹類染料物質(zhì)有較高的溶解度并且自身有較大的揮發(fā)性，這有利于目標(biāo)物質(zhì)的洗脫及后續(xù)的濃縮。

表2 血樣中4種蘇丹類染料的基質(zhì)效應(yīng)比較Table 2 Comparison of the matrix effects with and without SPE purification for the four Sudan dyes in blood samples

圖2 上樣液中水與乙腈比例對(duì)過(guò)柱回收率的影響Fig.2 Influence of the ratio of water／acetonitrile during SPE procedure on recovery

2.4 色譜流動(dòng)相的選擇與優(yōu)化

蘇丹類染料的分子結(jié)構(gòu)中-N＝N-基團(tuán)易與鄰位的-OH 形成分子內(nèi)氫鍵，p Ka值較大，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性、不易解離［18］。理論上，流動(dòng)相中加入一定量的甲酸有利于染料分子質(zhì)子化，從而使ESI質(zhì)譜檢測(cè)器響應(yīng)值增強(qiáng)?？疾炝肆鲃?dòng)相中不同體積分?jǐn)?shù)（0、0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%）的甲酸對(duì)色譜分離及質(zhì)譜檢測(cè)的影響（見圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在酸性流動(dòng)相條件下，當(dāng)甲酸體積分?jǐn)?shù)在0～0.1%范圍內(nèi)增大時(shí)4種蘇丹染料的色譜峰面積隨之逐漸增大；當(dāng)甲酸體積分?jǐn)?shù)大于0.1%時(shí)，分析物的色譜峰面積出現(xiàn)減小的趨勢(shì)，這可能與甲酸濃度過(guò)高對(duì)待測(cè)物的響應(yīng)產(chǎn)生飽和抑制有關(guān)。

2.5 偶氮染料的光學(xué)異構(gòu)現(xiàn)象

圖3 流動(dòng)相中甲酸的體積分?jǐn)?shù)對(duì)峰面積的影響Fig.3 Influence of the volume percentage of formic acid in the mobile phase on the peak area of the four dyes

在4種染料的色譜分離過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)蘇丹Ⅲ和Ⅳ染料在不同的保留時(shí)間分別出現(xiàn)兩個(gè)色譜峰。在確保儀器系統(tǒng)、對(duì)照品物質(zhì)等均無(wú)問(wèn)題的前提下，Molder等［9］研究表明由于蘇丹Ⅲ和Ⅳ染料的結(jié)構(gòu)中有偶氮基團(tuán)（-N＝N-），在光的誘導(dǎo)下可以發(fā)生E-Z 構(gòu)象的互變（見圖4），從而產(chǎn)生兩個(gè)色譜峰（第一峰和第二峰）（見圖5）。在測(cè)定4種蘇丹染料的殘留時(shí)，忽略第一峰會(huì)致使蘇丹Ⅲ和Ⅳ產(chǎn)生大約10%～30%的定量誤差［9］；由于蘇丹Ⅲ和Ⅳ的第一峰的保留時(shí)間恰好與蘇丹Ⅰ和Ⅱ的色譜峰保留時(shí)間相近，從而也會(huì)造成蘇丹Ⅰ、Ⅱ的錯(cuò)誤檢出［10，11］。為解決這個(gè)問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了探索性研究，分別討論了3種不同溶劑（乙腈、5 mmol／L 乙酸銨、0.1%（v／v）甲酸）對(duì)蘇丹染料的光學(xué)異構(gòu)現(xiàn)象的影響，每種條件各設(shè)白天普通組和黑暗避光組，儲(chǔ)存7天后測(cè)定，相互對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：白天普通組中第一峰隨著溶劑的不同而變化，差異較為顯著；而黑暗避光組中第一峰全部消失（見圖6），與溶劑無(wú)關(guān)。可能的原因是蘇丹染料形成分子內(nèi)氫鍵，從而抑制EZ 異構(gòu)體的產(chǎn)生；或是E-Z 構(gòu)象互變轉(zhuǎn)化加快，使得第一峰改變或消失［11］。

對(duì)于蘇丹Ⅲ和Ⅳ染料的黑暗避光時(shí)間對(duì)第一峰的影響，Molder等［9］提出使用鋁箔包裹進(jìn)樣瓶、黑暗避光3～4.5 h 后第一峰會(huì)消失；但Schummer等［17］研究結(jié)果是使用鋁箔包裹進(jìn)樣瓶、黑暗避光12 h后第一峰依然存在。本實(shí)驗(yàn)中，配制低、中、高3個(gè)水平（0.5、2.0、15.0μg／L）的對(duì)照品溶液，分別于黑暗裝置中放置不同時(shí)間后取出測(cè)定，發(fā)現(xiàn)黑暗放置12 h后，蘇丹Ⅲ和Ⅳ染料的第一峰完全消失，與Molder等［9］的研究結(jié)果一致，MRM 色譜圖如圖6所示，有效地避免了偶氮染料定量分析過(guò)程中產(chǎn)生的光學(xué)異構(gòu)現(xiàn)象。

圖4 偶氮苯的E-Z 光學(xué)異構(gòu)體Fig.4 Azobenzene and its E-Zisomerization

圖5 正常有光條件下4種蘇丹染料（2.0μg／L）的MRM 色譜圖Fig.5 MRM chromatogram of the four Sudan dyes at 2.0μg／L under light-possessed condition

圖6 黑暗放置12 h后4種蘇丹染料（2.0μg／L）的MRM 色譜圖Fig.6 MRM chromatogram of the four Sudan dyes under dark-disposed（12 h）condition at 2.0μg／L

2.6 線性范圍與檢出限

采用C18小柱凈化后的空白樣品溶液配制質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μg／L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，黑暗避光放置12 h后重復(fù)測(cè)定5次。以所得峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X，μg／L）進(jìn)行線性回歸分析，得到4種染料的回歸方程，見表3。結(jié)果表明，4 種染料在0.1～20.0 μg／L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999。采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)色譜峰的信噪比（S／N）大于3 倍確定檢出限（LOD），S／N大于10倍確定定量限（LOQ），得到血液中蘇丹Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的檢出限均為0.06μg／L，定量限均為0.2μg／L。

表3 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量檢出限Table 3 Linear regression equations，correlation coefficients and LOQs

2.7 方法的回收率與精密度

在空白血液樣品中進(jìn)行低、中、高3種質(zhì)量濃度（0.5、2.0和15.0μg／L）的4種蘇丹類染料加標(biāo)試驗(yàn)，每個(gè)添加水平做6 組平行試驗(yàn)，結(jié)果如表4 所示。在不同的加標(biāo)濃度下，蘇丹Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的回收率為93.0%～108.2%，方法的精密度為4.8%～9.5%，表明方法具有較好的回收率及穩(wěn)定性。

表4 全血樣品中4種蘇丹染料的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）Table 4 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of the four Sudan dyes spiked in a whole blood sample（n＝6）

2.8 實(shí)際應(yīng)用

實(shí)驗(yàn)采用蘇丹染料陽(yáng)性暴露的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?duì)6只SD（Sprague-Dawley）大鼠進(jìn)行平行灌胃添加4種蘇丹染料的食用花生油溶液，1 h后收集血液樣品，按1.4節(jié)步驟進(jìn)行定量分析，得到陽(yáng)性血樣中蘇丹Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的平均質(zhì)量濃度分別為7.27、6.69、5.78和13.85μg／L。

3 結(jié)論

針對(duì)血液樣品中蘇丹類染料（蘇丹Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）的殘留檢測(cè)，通過(guò)C18 SPE 凈化有效地解決了待測(cè)物的基質(zhì)效應(yīng)，建立了一套采用固相萃取凈化結(jié)合超快速液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好，4種蘇丹染料在6.5 min之內(nèi)完成基線分離，適用于血液樣品中蘇丹染料殘留的分析檢測(cè)。

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