液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水環(huán)境中的十氯酮

周 麗， 董 亮， 史雙昕， 張利飛， 張秀藍(lán)， 楊文龍， 李玲玲， 黃業(yè)茹

（國(guó)家環(huán)境分析測(cè)試中心，北京100029）

十氯酮（kepone，chlordecone）又名開(kāi)蓬，是一種人工合成的有機(jī)氯殺蟲(chóng)劑，具有持久性有機(jī)污染物（POPs）的特性，目前已被列入《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約》禁用名單［1］。目前關(guān)于十氯酮的研究地區(qū)主要集中在美國(guó)弗吉尼亞州Hopewell市和法國(guó)法屬西印度群島（French West Indies）［2，3］。因此十氯酮在環(huán)境介質(zhì)中的數(shù)據(jù)還很缺乏，亟待補(bǔ)充。盡管目前沒(méi)有關(guān)于生產(chǎn)和使用十氯酮的報(bào)告，但不能排除有些國(guó)家仍在生產(chǎn)十氯酮或?qū)⑵溆米鬓r(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑。十氯酮在國(guó)內(nèi)的生產(chǎn)、使用狀況未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。由于十氯酮是滅蟻靈的降解產(chǎn)物，且工業(yè)級(jí)的滅蟻靈中含有十氯酮［1，3］，而我國(guó)到2009年5月為止尚未停止生產(chǎn)和使用滅蟻靈，尤其在江蘇地區(qū)，因此可能存在十氯酮的污染［4］。國(guó)內(nèi)對(duì)十氯酮的相關(guān)研究較少，僅有幾篇相關(guān)的文獻(xiàn)。為了更好地履行公約，我國(guó)需加快開(kāi)展對(duì)十氯酮的研究，調(diào)查十氯酮在我國(guó)的生產(chǎn)和使用情況及其在各種環(huán)境介質(zhì)中的污染現(xiàn)狀，從而準(zhǔn)確評(píng)估我國(guó)的污染狀況，以保護(hù)環(huán)境和人類的健康。

與其他有機(jī)氯農(nóng)藥不同，由于羰基的存在，十氯酮在水溶液中容易形成水合物，生成偕二醇。Harless等［5］同時(shí)采用核磁共振（NMR）、紅外光譜（IR）和質(zhì)譜（MS）證實(shí)了其在甲醇中以半縮醛的形式存在。目前十氯酮的分析測(cè)定多采用氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器（GC-ECD）和氣相色譜-質(zhì)譜（GCMS）［6-8］的方法，但亦有使用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS／MS）［9，10］、高 效 液 相 色 譜-串 聯(lián) 質(zhì) 譜（HPLC-MS／MS）和近紅外反射光譜法［9］（NIRS，near infrared reflectance spectroscopy）進(jìn)行分析檢測(cè)的報(bào)道。國(guó)內(nèi)孫翠香等［11］和王艷潔等［12，13］分別采用GC-MS和GC-ECD 的方法測(cè)定十氯酮。相比其他檢測(cè)方法，HPLC-MS／MS具有定性定量準(zhǔn)確、適用于極性化合物的測(cè)定等特點(diǎn)，目前尚未檢索到國(guó)內(nèi)采用HPLC-MS／MS測(cè)定十氯酮的相關(guān)報(bào)道。鑒于十氯酮是極性化合物及其在有機(jī)溶劑中的存在形式，本文建立了使用HPLC-MS／MS測(cè)定水環(huán)境中十氯酮的分析方法，并考察了凈化方式。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 7890-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，HPLC1200 液相色譜儀-6410A 串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Agilent公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮儀（Buchi公司，瑞士） 十氯酮是純度為99.9%的固體，購(gòu)于美國(guó)AccuStandard公司，內(nèi)標(biāo)13C10-kepone的標(biāo)準(zhǔn)溶液購(gòu)于美國(guó)Cambridge Isotope Laboratories（CIL）公司，丙酮、正己烷、二氯甲烷（農(nóng)殘級(jí)，美國(guó)J T Baker公司）；甲醇、乙腈（HPLC 級(jí)，美國(guó)Honeywell公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取1 mg十氯酮，用丙酮溶解、定容至10 mL，配制成100 mg／L十氯酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確量取50 μL上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用丙酮稀釋定容至5 mL，配制成1 mg／L十氯酮標(biāo)準(zhǔn)使用液，用此溶液配制工作溶液，作定量校正曲線。準(zhǔn)確量取50μL 100 mg／L13C10-kepone，用丙酮稀釋定容至5 mL，配制成1 mg／L13C10-kepone內(nèi)標(biāo)使用液。

1.3 樣品前處理

搖勻水樣，量取1 000 mL水樣（萃取所用水樣體積根據(jù)水質(zhì)情況可適當(dāng)增減），倒入2 000 mL的分液漏斗中，加入50μL1 mg／L13C10-kepone和30 mL二氯甲烷，振搖10 min，靜置分層，收集有機(jī)相，重復(fù)萃取3 遍，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約5 mL時(shí)加入15 mL 正己烷繼續(xù)濃縮，提取后進(jìn)行凈化。

將濃縮液定容至6 mL左右，加入2 mL乙腈進(jìn)行液液分配，提取乙腈相，然后氮吹濃縮，用乙腈定容，上機(jī)測(cè)定。如果是飲用水和地下水的萃取液可不經(jīng)過(guò)凈化。

1.4 液相色譜-質(zhì)譜條件

色 譜 柱：Eclipse plus C18 柱（100 mm×2.1 mm，3.5μm）；流速：0.3 mL／min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相：A 為水相，B 為乙腈；梯度洗脫條件：0～1.0 min，50%B；1.0～3.0 min，50%B～100%B；3.0～6.0 min，100%B；6.0～8.0 min，100%B～50%B；8.0～9.0 min，50%B。電噴霧負(fù)離子模式（ESI-）；毛細(xì)管電壓4 000 V；霧化器壓力241 kPa（35 psi）；干燥器流速10 L／min；干燥器溫度350 ℃。十氯酮的監(jiān)測(cè)離子對(duì)質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

表1 十氯酮監(jiān)測(cè)離子對(duì)質(zhì)譜條件Table 1 MRM transitions and MS operating parameters selected for the analysis of kepone

2 結(jié)果與討論

2.1 分析儀器的選擇

本研究分別使用了氣相色譜-質(zhì)譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析了十氯酮。氣相色譜-質(zhì)譜采用Agilent 7890-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜柱為DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm，J＆W）。程序升溫為60 ℃保持1 min，以50 ℃／min 升溫至180℃保持1 min，以5℃／min升溫至240℃保持2 min，以30 ℃／min升溫至300 ℃保持5 min。不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為2μL；載氣流速為1.55 mL／min；進(jìn)樣口溫度為260℃；接口溫度為280℃；質(zhì)譜的電離方式為電子轟擊源（EI），采集方式為選擇離子（SIM）模式。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)十氯酮采用氣相色譜-質(zhì)譜分析有以下缺點(diǎn)（見(jiàn)圖1）：容易拖尾，本實(shí)驗(yàn)使用了不同品牌的DB-5MS及1701色譜柱均會(huì)產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象；容易降解，在分析樣品一段時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)十氯酮降解，進(jìn)樣系統(tǒng)需保持清潔（比如襯管和色譜柱）。所以十氯酮不適用氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜分析，因此本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行分析。

圖1 100μg／L十氯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的SIM 圖Fig.1 Total ion chromatograms of 100μg／L kepone standard solution by GC-MS

2.2 十氯酮在溶劑中的存在形式

十氯酮在甲醇和丙酮／乙腈兩種溶劑中的存在形式不一樣。通過(guò)全掃描模式（MS2Scan）分析，在甲醇溶劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液中得到十氯酮的母離子質(zhì)荷比（m／z）是520.8，而丙酮／乙腈溶劑中得到的母離子m／z 為506.7。這充分說(shuō)明十氯酮在甲醇中以半縮醛的形式存在，而在丙酮／乙腈中以偕二醇的形式存在。在甲醇中得到母離子m／z 為520.8，而十氯酮的相對(duì)分子質(zhì)量是489.6，如果以半縮醛的形式存在則是在其結(jié)構(gòu)式上連接一個(gè)-CH3OH，當(dāng)采用ESI-模式電離時(shí)，則變成［M＋CH3OH-H］-，因此從520.8→489.6丟失的質(zhì)荷比為31.2，這一過(guò)程證實(shí)了十氯酮在甲醇中以半縮醛的形式存在（見(jiàn)圖2）。在丙酮／乙腈溶劑中得到母離子m／z 為506.7，如果以偕二醇的形式存在并采用ESI-模式時(shí)，則是［M＋H2O-H］-，從506.7→489.6丟失的質(zhì)荷比為17，這一過(guò)程說(shuō)明了十氯酮偕二醇的存在形式。此結(jié)論證實(shí)了Harless等［5］關(guān)于十氯酮在有機(jī)溶劑中以不同形式存在的報(bào)道?？紤]到前處理的方式，本實(shí)驗(yàn)采用丙酮溶劑的十氯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液。

圖2 十氯酮在甲醇（上）和丙酮／乙腈（下）中的存在形式Fig.2 Existing forms of kepone in methanol（up）and acetone／acetonitrile（down）

2.3 流動(dòng)相的選擇

由于十氯酮在不同溶劑中的存在形式不一樣，因此實(shí)驗(yàn)中考察了乙腈／水和甲醇／水兩種流動(dòng)相對(duì)十氯酮的影響。對(duì)丙酮溶劑的十氯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描模式分析，結(jié)果表明，在甲醇／水中出現(xiàn)兩個(gè)化合物，而在乙腈／水中出現(xiàn)一個(gè)化合物（見(jiàn)圖3），再一次證實(shí)了十氯酮在甲醇和丙酮／乙腈中的存在形式不同。因此本實(shí)驗(yàn)采用乙腈／水流動(dòng)相。

2.4 凈化條件的選擇

2.4.1 柱色譜凈化和酸凈化

實(shí)驗(yàn)中參考Moseman等［7］研究的方法，填充了6 g的硅膠柱，結(jié)果表明需要200 mL含2%（v／v）甲醇和10%（v／v）甲苯的正己烷才能完全洗脫十氯酮，說(shuō)明十氯酮在凈化柱上有很強(qiáng)的保留，采用一般的淋洗液很難洗脫，Saleh 等［6］也報(bào)道了十氯酮在Florisil柱上保留性強(qiáng)的特點(diǎn)。這種凈化方式使用的洗脫溶劑量大，極性強(qiáng)，因此凈化效果一般。本實(shí)驗(yàn)也嘗試了使用硫酸進(jìn)行凈化，結(jié)果顯示十氯酮不耐受硫酸。

2.4.2 液液分配凈化

圖3 不同流動(dòng)相體系下1 mg／L十氯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of kepone standard solution（1 mg／L）by HPLC-MS／MS in different mobile phase systems

在200 mL農(nóng)夫山泉水樣中加入50 ng十氯酮的標(biāo)準(zhǔn)溶液（丙酮溶劑），加入20 mL二氯甲烷萃取兩次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約5 mL時(shí)加入15 mL正己烷繼續(xù)濃縮至6 mL左右，加入2 mL乙腈進(jìn)行液液分配，提取乙腈相，然后氮吹濃縮，用乙腈定容，上機(jī)測(cè)定（目的是除去非極性化合物）。十氯酮的回收率為75%左右，考慮到凈化時(shí)十氯酮的損失，采用同位素稀釋法，即在樣品萃取時(shí)加入50 μL1 mg／L13C12-kepone用來(lái)定量。

2.4.3 加NaCl對(duì)萃取效率的影響

萃取時(shí)，分別在空白水樣中加入0、1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）和3%的NaCl，然后加入40 ng十氯酮的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述步驟進(jìn)行液液萃取和濃縮，結(jié)果顯示加入NaCl對(duì)萃取效率沒(méi)有影響。

2.4.4 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和氮吹濃縮的影響

在50 mL左右丙酮溶液中加入40 ng十氯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后進(jìn)行測(cè)定。另外，在10 mL丙酮溶液中加入50 ng十氯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)氮?dú)獯祾邼饪s后進(jìn)行測(cè)定。其回收率分別約為107%和103%（n＝3），所以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和氮吹濃縮對(duì)十氯酮沒(méi)有影響。

2.5 質(zhì)譜條件的選擇

根據(jù)十氯酮的結(jié)構(gòu)特征，本實(shí)驗(yàn)選擇電噴霧離子源負(fù)離子模式（ESI-），通過(guò)對(duì)采集時(shí)間、干燥氣流速、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行調(diào)整，獲得了優(yōu)化后的選擇監(jiān)測(cè)離子參數(shù)；適當(dāng)提高干燥氣流速可以優(yōu)化色譜峰形，對(duì)應(yīng)的LC-MS／MS 的MRM 色譜圖見(jiàn)圖4。

2.6 方法檢出限和線性方程

圖4 十氯酮的MRM 色譜圖Fig.4 MRM chromatograms of kepone

精確量取1.2節(jié)所述的標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級(jí)稀釋，配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)樣體積為10 μL。采用同位素稀釋法定量，結(jié)果表明十氯酮在5～100μg／L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2＝0.999，儀器檢出限為0.01 ng。方法檢出限按照HJ168-2010（環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則）規(guī)定，采用空白樣品加標(biāo)的方法計(jì)算。向1 L空白水樣（選用農(nóng)夫山泉作為空白水樣）中加入5 ng十氯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行做7個(gè)樣品，對(duì)經(jīng)過(guò)萃取、凈化、濃縮、上機(jī)分析的全過(guò)程空白樣品加標(biāo)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，其檢出限及定量限分別為0.70 ng／L 和2.8 ng／L。

2.7 方法的回收率和精密度

為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度和精密度，按HJ168-2010規(guī)定，分別對(duì)5、40和100 ng／L 3 個(gè)不同濃度添加水平的樣品，按全程序進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)水平分別做6次平行實(shí)驗(yàn)，本方法的回收率為95.1%～98.9%，精密 度（以 相 對(duì) 標(biāo) 準(zhǔn) 偏 差 計(jì)）為4.72%、3.85% 和4.45%。

2.8 實(shí)際樣品分析

采集了北京市地表水和景觀水共6個(gè)實(shí)際樣品進(jìn)行分析，每份樣品取兩份平行樣，按照所建立的方法進(jìn)行分析，結(jié)果表明在所有樣品中均未檢出十氯酮。

3 小結(jié)

本研究利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定環(huán)境水樣品中的十氯酮，結(jié)果表明十氯酮在甲醇和丙酮／乙腈溶劑中的存在形態(tài)不同。在甲醇中十氯酮以半縮醛的形式存在，而在丙酮／乙腈中以偕二醇的形式存在。由于十氯酮極性較強(qiáng)，在凈化時(shí)難以洗脫，且不耐酸，所以不能與其他有機(jī)氯農(nóng)藥一起分析。本研究所開(kāi)發(fā)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的儀器檢出限為0.01 ng，在水環(huán)境中檢出限及定量限分別為0.70 ng／L和2.8 ng／L。

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