分散液液微萃取-反相液液微萃取-掃集-膠束電動(dòng)色譜法測(cè)定紅酒中的3種氯酚類物質(zhì)

孫建芝， 賀 暉， 劉書慧，2＊

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院，陜西 楊凌712100；2.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌712100）

氯酚類物質(zhì)被廣泛用作漂白劑、殺菌劑、殺蟲劑和木材防腐劑等。近年來在廢棄物和污泥［1］、土壤［2］、地下水及地表水［3］等中均已檢測(cè)到氯酚類污染物，甚至有文獻(xiàn)［4，5］報(bào)道在紅酒中也檢測(cè)到痕量氯酚類物質(zhì)。氯酚具有毒性大、難生物降解、“三致”（致癌、致畸、致突變）效應(yīng)等危害，已被美國環(huán)保局（EPA）［6］和我國國家環(huán)?？偩郑?］列入優(yōu)先控制污染物的黑名單。因此，建立一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的氯酚類物質(zhì)測(cè)定方法已成為亟待完成的任務(wù)。

氯酚類物質(zhì)在紅酒中的含量很低，傳統(tǒng)的分析方法難以得到可靠結(jié)果。目前，氯酚類化合物的提取方法主要有液液萃取法［8］、固相萃取法［9］、固相微萃取法［10］、頂空固相微萃取法［11］等。這些方法在樣品前處理中的應(yīng)用已比較成熟，但是存在有機(jī)溶劑消耗大、操作繁瑣、裝置昂貴等缺點(diǎn)。分散液液微萃?。―LLME）是2006年由Rezaee等［12］率先提出的一種萃取富集技術(shù)。該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、費(fèi)用低、富集倍數(shù)高、萃取效果好和對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，因此已被廣泛使用。近幾年，基于DLLME富集方法，新穎的反相分散液液微萃取技術(shù)（RPDLLME）［13，14］也得到廣泛應(yīng)用。

DLLME 常與氣相色譜-質(zhì)譜／電子捕獲檢測(cè)（GC-MS／ECD）［4，5］和 高 效 液 相 色 譜-紫 外 檢 測(cè)（HPLC-UV）［15，16］聯(lián)用測(cè)定氯酚類物質(zhì)。Campillo等［4］通過對(duì)分析物衍生化建立了DLLME-GC-MS模型，紅酒和軟木塞中的待分析物經(jīng)乙酸酐衍生后用200μL CCl4萃取，最后取4μL萃取相進(jìn)行GC分析測(cè)定。Pizarro等［5］使用CCl4作萃取劑，測(cè)定了葡萄酒中的鹵代酚和鹵代苯甲醚等物質(zhì)。Hadjmohammadi等［15］建 立 了 乙 醇 輔 助 萃 ?。ˋA）-DLLME-HPLC-UV 測(cè)定方法，并測(cè)定了3 種水樣中五氯酚的含量。這些方法中，GC 需要將樣品衍生化，操作過程繁瑣、冗長，而且使用的萃取劑均為毒性較大的含氯萃取劑；HPLC 靈敏度低，而且使用甲醇或乙腈作為流動(dòng)相，有機(jī)溶劑消耗多，污染嚴(yán)重。

毛細(xì)管電泳（CE）因其分離效率高、分析速度快、有機(jī)溶劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)在環(huán)境分析和食品分析中廣泛應(yīng)用，但CE-UV 靈敏度較低，仍是制約其發(fā)展的一個(gè)難題。如何提高檢測(cè)靈敏度以滿足檢測(cè)復(fù)雜樣品中痕量和超痕量組分的要求，依然是電泳研究領(lǐng)域中的焦點(diǎn)與熱點(diǎn)。在線富集技術(shù)是樣品進(jìn)樣或者分離過程中提高靈敏度的方法，常用的有場(chǎng)強(qiáng)放大［17］、動(dòng)態(tài)pH 連接［18］、掃集［19］和等電聚焦［20］等技術(shù)。近年來，已有報(bào)道將DLLME 與上述電泳在線富集方法聯(lián)用，如Us等［17］利用DLLME-fieldamplified sample injection（FASI）聯(lián)用建立了測(cè)定牛尿中β2-興奮劑類物質(zhì)的方法，該方法的LOD 為1.8～37.0μg／L，富集倍數(shù)為41～1 046，4種分析物 在5.5 min 內(nèi) 被 檢 測(cè)。Zhang 等［19］建 立 了DLLME-掃集-MEKC 方法測(cè)定黃瓜中的4 種新煙堿類殺蟲劑，該方法具有富集倍數(shù)高、重現(xiàn)性好和回收率高等優(yōu)點(diǎn)?；谏鲜鯠LLME 與CE 聯(lián)用的優(yōu)點(diǎn)，本研究選取五氯酚（PCP）、2，4，6-三氯酚（TCP）和2，4-二氯酚（DCP）等3種氯酚為模型分析物，建立了DLLME和RP-LLME兩步萃取與掃集-MEKC聯(lián)用的分離富集方法，并將該方法成功應(yīng)用于市售紅酒中氯酚類物質(zhì)的分析檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

P／ACETMMDQ 型毛細(xì)管電泳儀（美國Beckman Coulter公司），配備二極管陣列檢測(cè)器；彈性石英毛細(xì)管（50.2 cm×75μm，有效長度40 cm，河北永年銳灃色譜器件有限公司）；Direct-Q3型純水儀（美國Millipore公司）；Allegra X-12型離心機(jī)（美國Beckman Coulter公司）。

PCP、TCP 和DCP 標(biāo) 準(zhǔn) 品（純 度 為98%～99%，阿拉丁試劑公司）；離子液體［C4MIM］［PF6］（C4）、［C6MIM］［PF6］（C6）和［C8MIM］［PF6］（C8）（成捷化學(xué)有限公司）；正辛醇、磷酸三丁酯均為分析純（阿拉丁試劑公司）；正己烷、乙腈和甲醇均為色譜純；磷酸二氫鈉、鹽酸、氯化鈉、氫氧化鈉、磷酸均為分析純；十二烷基硫酸鈉（SDS）（美國Sanland 公司）。實(shí)驗(yàn)所用的11 種不同品牌紅酒（酒精含量11.5%～12%（v／v））均購于本地超市，并將樣品依次編號(hào)為1～11號(hào)。

PCP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（0.2 g／L）、TCP和DCP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（2.0 g／L）均用甲醇配制于10 mL棕色容量瓶中，置于-10 ℃下避光保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)不同濃度的工作溶液由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋而得。

1.2 電泳過程

新毛細(xì)管實(shí)驗(yàn)前需活化，活化步驟同文獻(xiàn)［21］所述，其中沖洗壓力均為137.8 kPa。電泳緩沖溶液為25 mmol／L NaH2PO4-100 mmol／L SDS-30%（v／v）乙腈，pH2.3；分離電壓為-15 kV；檢測(cè)波長為214 nm；樣品基體為80 mmol／L NaH2PO4，壓力進(jìn)樣（20.67 kPa×20 s）。

不同濃度的電泳緩沖溶液由200 mmol／L NaH2PO4和400 mmol／L SDS 儲(chǔ) 備 液 制 備，3 mol／L H3PO4溶液調(diào)節(jié)pH 值，緩沖溶液使用前用0.22μm 濾膜過濾并超聲脫氣5 min。

1.3 實(shí)際樣品處理

1.3.1 分散液液微萃取過程

取3.5 mL紅酒（濃HCl調(diào)節(jié)pH 至3.0；加入固體NaCl至120 g／L）置于一個(gè)具有細(xì)長頸的一次性聚乙烯萃取管中，加入300μL 正己烷，輕搖3 min后離心（5 000 r／min，3 min），上層正己烷相用微量進(jìn)樣器準(zhǔn)確吸取并轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中。

1.3.2 反相液液微萃取過程

取25μL 0.16 mol／L NaOH 溶液加入到上述正 己 烷 相 中，輕 搖2 min 后 離 心（5 000 r／min，2 min），用微量進(jìn)樣器準(zhǔn)確量取沉積于離心管底部的NaOH 溶液（25±1）μL。然后加入（25±1）μL 0.16 mol／L H3PO4溶液中和NaOH，離心（12 000 r／min，2 min）后直接進(jìn)行電泳分離富集測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 電泳參數(shù)的優(yōu)化

2.1.1 運(yùn)行緩沖溶液的選擇

在掃集-膠束電動(dòng)色譜富集法中，為了抑制電滲流，使SDS的電泳速度大于電滲流速度，選用酸性磷酸鹽緩沖溶液（pH2.3）。緩沖溶液體系中添加有機(jī)添加劑可以調(diào)節(jié)分析物在膠束和緩沖體系兩相中的分配能力，從而改善分析物的分離度和峰形。常用的有機(jī)添加劑有乙腈、乙醇、甲醇和異丙醇等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，緩沖溶液中加入30%（v／v）乙腈時(shí)樣品中的分析物達(dá)到完全分離且?guī)缀鯖]有雜質(zhì)干擾?？紤]分析物的分離度和遷移時(shí)間，故緩沖溶液中加入30%（v／v）乙腈。

實(shí)驗(yàn)考察了NaH2PO4緩沖液（pH2.3）濃度在15～60 mmol／L 范圍內(nèi)變化時(shí)對(duì)分析物分離度和靈敏度的影響。隨著緩沖液濃度的增加，遷移時(shí)間逐漸縮短，當(dāng)NaH2PO4濃度為25 mmol／L 時(shí)分析物的峰高達(dá)到最大。因此選取25 mmol／L NaH2PO4為優(yōu)化值。

SDS濃度是膠束掃集法中一個(gè)重要的參數(shù)［22］，對(duì)氯酚的分離和富集起著重要作用。通過增加SDS的濃度，可以提高電泳運(yùn)行緩沖液溶解樣品的能力，也有利于樣品的富集。但隨著SDS濃度的增大，SDS掃過樣品區(qū)帶后穿過緩沖溶液界面的速度會(huì)增大，導(dǎo)致樣品區(qū)帶展寬，甚至峰高降低。同時(shí)，隨著SDS濃度的增加，電泳電流及焦耳熱也會(huì)增大，體系溫度會(huì)升高，出峰穩(wěn)定性也受到消極影響。本實(shí)驗(yàn)考察了60～140 mmol／L 范圍內(nèi)不同濃度SDS對(duì)氯酚分離和富集效果的影響。結(jié)果表明，隨著SDS濃度的增加，分析物的峰高增加；當(dāng)SDS濃度大于100 mmol／L時(shí)，分析物峰高基本不再增加，而且峰展寬，不利于分離測(cè)定。因此選擇100 mmol／L SDS為最優(yōu)值。

2.1.2 樣品基體組成和進(jìn)樣時(shí)間的選擇

考察了樣品基體中NaH2PO4濃度（20、50、80和100 mmol／L）對(duì)分析物富集倍數(shù)的影響，結(jié)果見圖1。隨著NaH2PO4濃度的增加，3種物質(zhì)的遷移時(shí)間逐漸縮短，靈敏度增加；但是當(dāng)NaH2PO4濃度大于80 mmol／L時(shí)，分析物的靈敏度不再增加。因此選擇80 mmol／L NaH2PO4作為樣品基體。

進(jìn)樣時(shí)間影響方法的分離度和掃集的富集水平。實(shí)驗(yàn)中，考察了20.67 kPa下的3 個(gè)進(jìn)樣時(shí)間（20、30、40 s），相應(yīng)的進(jìn)樣長度為17.35、26.03、35.71 cm。如圖2所示，分析物的靈敏度隨進(jìn)樣時(shí)間的增加而增大。當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間＞30 s時(shí)，峰展寬的程度大于峰高增加的程度，不利于實(shí)際樣品的測(cè)定。并且在分析紅酒樣品的預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)進(jìn)樣時(shí)間大于20 s時(shí)，分析物（尤其是TCP 和DCP）不能與紅酒中的雜質(zhì)達(dá)到基線分離，故選擇樣品進(jìn)樣時(shí)間為20 s。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 分散液液微萃取

市售紅酒中乙醇含量約為12%（v／v），而乙醇與本文選用的萃取劑均能互溶，因此紅酒中的乙醇可以作為本實(shí)驗(yàn)的分散劑。此處主要考察DLLME過程中萃取劑種類及體積、樣品pH 值、離子強(qiáng)度和萃取時(shí)間等參數(shù)對(duì)3種氯酚萃取率的影響。

圖2 樣品進(jìn)樣時(shí)間對(duì)3種氯酚類物質(zhì)富集的影響Fig.2 Effect of the injection time on the sweeping efficiency for the three CPs

分散液液微萃取建立于三相溶劑體系，在分散劑的作用下萃取劑以微小液滴的形式分散在樣品溶液中，利用化合物在萃取劑和樣品溶液中的溶解度或分配系數(shù)不同，使化合物從樣品溶液中轉(zhuǎn)移到萃取劑中的方法。本文選用多種極性不同的萃取劑進(jìn)行比較，為方便歸類，將萃取劑按密度大小分為兩類：密度大于樣品溶液的萃取劑C4、C6和C8和密度小于樣品溶液的正己烷、正辛醇和磷酸三丁酯。取3.5 mL加標(biāo)紅酒和上述萃取劑各100μL，按1.3節(jié)實(shí)驗(yàn)步驟考察萃取劑對(duì)分析物萃取率的影響，結(jié)果如圖3 所示。除正己烷外，其他幾種萃取劑對(duì)PCP和TCP的萃取率很低，尤其是PCP 的萃取率幾乎為零。然而已有文獻(xiàn)［15，23，24］報(bào)道使用正辛醇、磷酸三丁酯和離子液體萃取氯酚，其回收率幾乎都滿足要求。因此以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能是由于第二步RP-LLME引起的。Li等［25］也曾報(bào)道堿溶液幾乎不能將氯酚尤其是PCP 和TCP 從正辛醇中萃取出來。其可能的原因如下：萃取劑結(jié)構(gòu)的不同，使萃取劑和氯酚之間存在分子間作用力、氫鍵和π-陽離子作用力等不同作用力。氯酚的羥基與正辛醇和磷酸三丁酯的氧原子可能形成作用力較強(qiáng)的氫鍵。氯酚與離子液體之間，除了離子液體中陰離子PF6-的F原子與氯酚的羥基可能形成氫鍵外，離子液體的陽離子與氯酚的苯環(huán)間也可能形成π-陽離子作用力，這些強(qiáng)的作用力使氯酚易被這些萃取劑從樣品溶液中萃取出來，而不易反萃取到堿溶液中。但是正己烷與氯酚之間只有分子間作用力，不存在氫鍵和π-陽離子作用力等較強(qiáng)的作用力，所以反萃取效果最優(yōu)。最后，選擇正己烷作為本實(shí)驗(yàn)的萃取劑。同時(shí)考察了萃取劑體積對(duì)萃取效率的影響，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)正己烷加入量＞300μL時(shí)，萃取率不再增加，所以選擇萃取劑的體積為300μL。

圖3 不同萃取劑對(duì)3種氯酚萃取回收率的影響（n＝3）Fig.3 Effect of the type of the extraction solvent on the extraction recoveries for the three CPs（n＝3）

3 種氯酚在25 ℃下 的p Ka分別為4.7、6.0、7.5［26］，均為弱酸性物質(zhì)，因此調(diào)節(jié)樣品的pH 值使其為酸性可使分析物的解離平衡向生成分子方向移動(dòng)，弱酸性分析物的解離度降低，從而降低分析物在溶液中的溶解度，有利于分析物被有機(jī)萃取劑有效萃取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品pH 為3.0 時(shí)分析物的萃取率最高。

通過加入不同質(zhì)量的固體NaCl（至0～250 g／L）來考察離子強(qiáng)度對(duì)分析物萃取率的影響。結(jié)果當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為120 g／L時(shí)，分析物的萃取率達(dá)到最大，隨后基本保持恒定。原因可能是隨著離子強(qiáng)度的增加，分析物在水中的溶解度減小，從而提高了萃取率；當(dāng)?shù)竭_(dá)最優(yōu)時(shí)，萃取率就不再變化。經(jīng)實(shí)驗(yàn)得出最優(yōu)的萃取時(shí)間為3 min、離心條件為5 000 r／min下3 min。

圖4 正己烷體積對(duì)3種氯酚萃取回收率的影響（n＝3）Fig.4 Effect of the volume of hexane on the extraction recoveries for the three CPs（n＝3）

2.2.2 反相液液微萃取

反相萃取參數(shù)影響分析物的萃取率和富集倍數(shù)，同時(shí)也影響電泳分析的分離效率和靈敏度。本實(shí)驗(yàn)考察了反相萃取過程中NaOH 濃度和體積、萃取時(shí)間和離心條件等實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)分析物萃取率的影響。

固定NaOH 體積為60 μL，考察不同濃度NaOH 溶液對(duì)反相萃取效率的影響，結(jié)果如圖5a所示。NaOH 的濃度為0.16 mol／L時(shí)，分析物的萃取率達(dá)到最優(yōu)。固定NaOH 濃度為0.16 mol／L，不同體積的NaOH 溶液對(duì)萃取率的影響如圖5b所示。當(dāng)NaOH 溶液體積大于25μL 時(shí)，萃取率不再增加。綜合考慮NaOH 溶液體積對(duì)分析物萃取效率和富集倍數(shù)的影響，選擇NaOH 的體積為25μL。

另外，通過優(yōu)化發(fā)現(xiàn)萃取時(shí)間為2 min、離心條件為5 000 r／min下2 min時(shí)萃取率即可達(dá)到最高。

圖5 NaOH 溶液（a）濃度和（b）體積對(duì)3種氯酚萃取回收率的影響（n＝3）Fig.5 Effect of the（a）concentration and（b）volume of NaOH solution on the extraction recoveries for the three CPs（n＝3）

2.3 線性范圍、檢出限、定量限和富集倍數(shù)

在優(yōu)化的富集、分離條件下分析了10個(gè)不同質(zhì)量濃度（0.5～100μg／L）的空白樣品加標(biāo)溶液，考察了各組分的線性范圍、檢出限（S／N ＝3）、定量限（S／N＝10）和富集倍數(shù)，結(jié)果如表1所示。

PCP和TCP的線性范圍為0.5～100μg／L（r≥0.991 0），DCP的線性范圍為1.5～80μg／L（r＝0.985 1）。比較文獻(xiàn)［27，28］報(bào)道的其他CE-UV 方法所得的氯酚類物質(zhì)的檢出限（3.5～100μg／L），本方法的檢測(cè)靈敏度高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。靈敏度雖不及GC-MS／ECD［4，5］，但 其 富 集 倍 數(shù) 遠(yuǎn) 遠(yuǎn) 大 于GCMS／ECD。

表1 3種氯酚類物質(zhì)的線性范圍、回歸方程、檢出限、定量限和富集倍數(shù)Table 1 Linear ranges，regression equations，LODs，LOQs and enrichment factors for the three CPs

2.4 方法的回收率及精密度

考察2個(gè)樣品（1號(hào)、2號(hào)）在3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率和精密度，按優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)每個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。3 種物質(zhì)的平均回收率為75.2%～104.7%，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤6.17%。

表2 兩個(gè)紅酒樣品中3種氯酚類物質(zhì)的加標(biāo)回收率（n＝3）Table 2 Recoveries of three CPs spiked in two red wine samples（n＝3）

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)市售11種紅酒進(jìn)行了分析，檢出1號(hào)、3號(hào)、8號(hào)和11號(hào)紅酒樣品中含有TCP，含量分別為2.92、1.13、0.61 和1.75μg／L，所有樣品中均檢測(cè)不到PCP和DCP。目前沒有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定紅酒中氯酚的最高限量，根據(jù)我國生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)［29］中對(duì)氯酚類物質(zhì)的限量標(biāo)準(zhǔn)得出這些紅酒中的TCP含量沒有超標(biāo)。部分實(shí)際樣品的電泳譜圖見圖6，可以看出該方法在16 min內(nèi)即可檢測(cè)出3種氯酚，并且?guī)缀鯖]有雜質(zhì)干擾。

圖6 （a）3號(hào)紅酒加標(biāo)（3種氯酚各15μg／L）樣品、（b）3號(hào)紅酒樣品和（c）1號(hào)紅酒樣品的電泳譜圖Fig.6 Electropherograms of（a）No.3 red wine sample spiked with the three CPs（15μg／L）；（b）No.3 red wine sample and（c）No.1 red wine sample

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)考察了影響掃集-膠束毛細(xì)管電動(dòng)色譜富集技術(shù)中富集效率和分離度的各種因素，同時(shí)考察了樣品前處理（DLLME 和RP-LLME）過程中影響分析物萃取率的各種參數(shù)。通過優(yōu)化這些參數(shù)，建立了離線富集-在線富集聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)紅酒中3種氯酚類物質(zhì)的分析方法.該方法具有富集倍數(shù)高、靈敏度高、簡(jiǎn)單易行、重現(xiàn)性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)，成功應(yīng)用于市售11種紅酒中氯酚的測(cè)定。紅酒有促進(jìn)睡眠、降低疾病發(fā)生率、美容養(yǎng)顏和改善血液循環(huán)等優(yōu)點(diǎn)，越來越多的人選擇飲用紅酒。而本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)出某些品牌紅酒中含有痕量的氯酚，因此紅酒的質(zhì)量安全問題也應(yīng)給予關(guān)注。

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