多壁碳納米管固相萃取凈化-高效液相色譜法測定豬肉和雞肉中的磺胺多殘留

趙海香， 劉海萍， 閆早嬰

（河北北方學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，河北 張家口075000）

磺胺類藥物（sulfonamides，SAs）是指具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類人工合成抗菌藥物，在動物飼養(yǎng)和水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中被廣泛應(yīng)用［1］。SAs在動物體內(nèi)作用和代謝時間較長，可造成SAs在動物可食性組織中殘留，而長期食用就可能引起SAs在體內(nèi)的蓄積，對健康有害［2］。為了保證消費者的安全，我國及許多國家規(guī)定了SAs的最大殘留限量（MRL），即在動物源食品中SAs總量不超過0.10 mg／kg［3］。因此，建立簡單有效的SAs多殘留檢測方法具有重要意義。

SAs多殘留測定常經(jīng)固相萃?。⊿PE）［4-6］和基質(zhì)固相分散萃取（MSPD）［7-10］凈化處理后，采用HPLC-MS／MS［5，10］、超 高 效 液 相 色 譜-串 聯(lián) 質(zhì) 譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS／MS）［7，11］、HPLCPDA［4，6］或HPLC-UV［8，9］測定。常用的凈化吸附劑有HLB［4，5］、氨基（NH2）吸附劑［6，7］、PSA（N-丙基乙二 胺）［8］、C18［8］、硅 膠 固 載 離 子 液 體［9］和 碳 納 米管［12，13］等，其中碳納米管（CNTs）是一種新的以碳為基礎(chǔ)的納米材料，具有多孔、疏水表面和封閉面狀π電子系，通過發(fā)生π-π 和疏水相互作用對其他化合物具有很強的吸附能力和較大的吸附容量，是一種較為理想的吸附材料［14］。CNTs對水樣品中SAs（如磺胺甲惡唑、磺胺嘧啶）具有強烈的吸附作用［15-17］，吸附效果好于C18［17］。Fang等［1］報道了以CNTs作為吸附劑的在線固相萃取-HPLC 同時測定雞蛋和豬肉中10種SAs多殘留的方法。最近報道了采用磁性多壁碳納米管（MWCNTs）作為吸附劑的SPE凈化雞蛋樣品中7種SAs殘留的方法［12］，以及采用分散固相萃取（DSPE）方法測定豬肉中18種SAs的方法［13］。MWCNTs性質(zhì)與C18相似，屬于非極性材料，但吸附能力更強［17］，價格更低。本文以p Ka值為5～10.4的多種SAs為分析物，用MWCNTs SPE 柱凈化樣品，有效消除了基質(zhì)效應(yīng)，提高了方法的靈敏度，同時降低了分析成本。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑和材料

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司），配紫外檢測器（UV）、G1313 型自動進樣器、Chemstations色譜工作站；固相萃取裝置（Supelco公司）；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海振捷實驗設(shè)備有限公司）；3K-30冷凍離心機（Sigma公司）；WH-861渦混合儀（太倉科教器材廠）；MTN-2800 氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

磺胺嘧啶（SDZ）、磺胺甲基嘧啶（SMR）、磺胺二甲基嘧啶（SMTZ）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺鄰二甲氧嘧啶（SDX）、磺胺甲惡唑（SMZ）、磺胺喹惡啉（SQX）、磺胺間二甲氧嘧啶（SDM）、胺苯磺胺（SA）、磺胺噻唑（STZ）、磺胺吡啶（SPD）和磺胺甲噻二唑（SMT）等磺胺對照品（純度≥98.5%，美國Sigma公司）；甲醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯和乙腈為色譜純（德國Fluka公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純，水為二次蒸餾水。

準確稱取各種磺胺類藥物標準品各10.0 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻，配成1 000 mg／L 的標準儲備液，-20 ℃避光存放，有效期6個月。準確量取磺胺類藥物標準儲備液各0.5 mL，用甲醇定容至10 mL，配制成50 mg／L的磺胺類藥物混合標準儲備液，再用流動相稀釋成0.010～1.00 mg／L 的混合標準工作液，存放在2～8 ℃冰箱中備用，有效期6個月。

多壁碳納米管（L-MWNT-2040），外徑20～40 nm，長度5～15μm，表面積40～300 m2／g，純度＞95%，購于深圳納米港公司。120 ℃下烘干2 h，干燥器中冷卻備用。稱取250 mg MWCNTs于6 mL固相萃取空柱管中，放置上下篩板，控制填裝高度以保證其在一定的壓力下具有0.5 mL／min的流速。

豬肉和雞肉隨機購于本地市場或超市。豬肉樣品、雞肉樣品去皮后采用組織搗碎機攪碎、混勻，置于4 ℃保存?zhèn)溆?。不能及時分析時應(yīng)冷凍保存。

1.2 樣品前處理方法

1.2.1 提取

稱取勻漿后的樣品（5±0.05）g，置于50 mL離 心 管 中；依 次 加 入15 mL 乙 腈 和4 g 無 水Na2SO4；渦旋混合提取1 min，超聲提取5 min；以5 000 r／min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中；重復(fù)提取一次，合并上清液；加入10～15 mL正己烷脫脂；在5 000 r／min下離心5 min，棄去正己烷層，剩余提取液轉(zhuǎn)移至梨形瓶中；于50 ℃濃縮至近干，待凈化。

1.2.2 MWCNTs SPE凈化

采用5 mL洗脫液丙酮-二氯甲烷（1∶1，v／v）、5 mL甲醇、5 mL pH6.0的NaH2PO4緩沖溶液活化MWCNTs SPE 柱?；罨^程注意使MWCNTs SPE柱保持液面濕潤。向1.2.1節(jié)提取液中加入5 mL pH6.0的NaH2PO4緩沖液，渦旋混勻，上樣到MWCNTs SPE柱上；用5 mL pH6.0的NaH2PO4緩沖液洗滌蒸餾瓶，然后也上樣到MWCNTs SPE柱上；棄掉流出液，真空抽干5 min；用5 mL 5%（v／v）丙酮-正己烷淋洗，棄掉淋洗液；用10 mL 丙酮-二氯甲烷（1∶1，v／v）溶液洗脫，收集洗脫液于10 mL離心管中；加入0.1 mL 乙二醇，在N2下吹至0.1 mL；加入0.9 mL 流動相，混勻；取適量溶液過0.22μm 液膜，進行HPLC-UV 分析。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：Agilent ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：50 mmol／L NaH2PO4-乙腈（7∶3，v／v）；流速：0.70 mL／min；紫外檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：50μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC-UV 方法的建立

由于12種磺胺類藥物的p Ka值在5～10.4之間，酸堿性不同，流動相的pH 值對磺胺類藥物的保留時間和分離影響很大［18］，應(yīng)注意選擇流動相的pH。研究選取的流動相體系包括乙腈-磷酸-水、甲醇-甲酸-水、甲酸-乙腈、甲醇-磷酸鹽緩沖液、乙腈-磷酸鹽緩沖液。為了有效改善色譜峰拖尾，從而改善SMR 和SMTZ、SMZ 和SDX 的分離，最后確定流動相為50 mmol／L NaH2PO4-乙腈（7∶3，v／v）溶液。利用NaH2PO4溶液對pH 的緩沖能力，保持pH 的相對穩(wěn)定，12種SAs分離情況見圖1。

2.2 MWCNTs凈化條件的優(yōu)化

2.2.1 pH 的影響

磺胺類藥物難溶于水，但是一般在弱酸或弱堿溶液中易溶，且12種磺胺類藥物p Ka值在5～10.4之間，酸堿性差別較大，因此選擇pH4.5～7.5 的NaH2PO4緩沖溶液進行研究，選擇出適宜的pH 溶液作為上樣溶液。研究了0.5 mg／L 的12 種磺胺混合標準溶液在pH4.5～7.5的NaH2PO4緩沖溶液中的溶解性，實驗采用乙酸乙酯萃取、HPLC-UV法測定，結(jié)果如圖2所示。在pH5.5～6.0范圍內(nèi)，除了SA、SPD、SMR 外，其余9種磺胺類藥物的萃取回收率均大于70%。分析其原因，可能是SA（p Ka10.4）在弱酸性水溶液中的溶解度較大，導(dǎo)致乙酸乙酯萃取回收率較低；而SMR（p Ka8.0）和SPD（p Ka8.5）在中性和弱堿性溶液中溶解度較低。最終確定緩沖溶液的pH 為5.5～6.0。

2.2.2 洗脫條件的優(yōu)化

圖1 12種磺胺藥物經(jīng)MWCNTs SPE凈化的HPLC-UV 色譜圖Fig.1 HPLC-UV chromatograms of the 12 SAs after MWCNTs SPE clean-up

首先考察了單一溶劑對SPE柱上12種磺胺的洗脫效率，結(jié)果如圖3所示。乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮和甲醇這4種溶劑的洗脫效果相近，9種藥物的回收率在60%～80%之間，不能夠完全滿足殘留分析的要求；SMR 和SQX 的回收率較低，低于10%；SPD 的回收率低于50%。對上樣流出液和淋洗液中的磺胺進行測定，沒有檢測到SMR、SPD 和SQX，因此這3 種分析物不存在穿漏和淋洗損失。結(jié)合2.1節(jié)的結(jié)果分析，SMR 和SPD 在此pH 值下溶解性較小，可能導(dǎo)致回收率低；SQX 可能與多壁碳納米管的吸附作用強，不易被洗脫所致。

圖2 不同pH 條件下12種磺胺類藥物的乙酸乙酯萃取回收率（0.5 mg／L）Fig.2 Recoveries of the 12 SAs（0.5 mg／L）at different pHs with ethyl acetate extraction

圖3 4種單一有機溶劑作為洗脫劑時MWCNTs SPE柱上12種磺胺藥物的回收率（0.5 mg／L）Fig.3 Recoveries of the 12 SAs（0.5 mg／L）on MWCNTs SPE cartridge with four single organic solvent as the elution solvent

為了獲得理想的回收率，進一步考察了混合二元溶劑對MWCNTs SPE柱上0.5 mg／L的12種磺胺類藥物的洗脫效果。由于甲醇作洗脫溶劑時干擾色譜峰較多，所以未使用甲醇。所選二元體系包括丙酮-乙酸乙酯（1∶1，v／v）、二氯甲烷-乙酸乙酯（1∶1，v／v）和丙酮-二氯甲烷（1∶1，v／v），結(jié)果見圖4。除了SPD、SMR 和SQX 外，其余9種磺胺類藥物的回收率在70%～90%之間，滿足殘留分析的要求。比較圖3和圖4可以看出，混合溶劑的洗脫回收率高于單一溶劑，對于低回收率的化合物SA、SDZ和STZ，丙酮-二氯甲烷（1∶1，v／v）的洗脫回收率較高。但圖4 中SQX 的洗脫回收率均低于30%，可能的原因是其被MWCNTs強烈吸附而難于洗脫；SMR 和SPD 回收率較低的原因可能是其在pH6.0的NaH2PO4緩沖溶液中溶解度較低。綜合考慮選擇丙酮-二氯甲烷（1∶1，v／v）為洗脫溶劑，同時測定了9種磺胺類藥物，各藥物的回收率均能夠滿足殘留分析的要求。綜合以上實驗結(jié)果，優(yōu)化的凈化條件如1.2.2節(jié)所述，研究表明影響磺胺類藥物在MWCNTs SPE柱上吸附和洗脫的主要因素為酸堿性、在水中的溶解性和與MWCNTs的相互作用。

圖4 混合溶劑（1∶1，v／v）對12種磺胺藥物的洗脫效果圖（0.5 mg／L）Fig.4 Elution effect of the 12 SAs（0.5 mg／L）with the mixed solvents（1∶1，v／v）

2.3 檢出限、定量限和添加回收率

依據(jù)上述實驗確定的提取、凈化和HPLC-UV測定條件，根據(jù)S／N＝3確定9種磺胺類藥物的檢出限為0.003 mg／L，根據(jù)S／N ＝10確定其定量限為0.01 mg／L。方 法 的 線 性 范 圍 為0.01～1.0 mg／L，線性相關(guān)系數(shù)r2≥0.998。對豬肉和雞肉樣品進行添加回收率試驗，分別添加3個水平，每個水平重復(fù)6次測定，回收率結(jié)果見表1，9種磺胺藥物的添加回收率滿足殘留分析的要求（74.2%～89.2%）。凈化效果圖見圖1，從色譜圖可見分析物基本無干擾，凈化效果較好，原因可能是SAs與MWCNTs除了表面吸附作用外，SAs具有的苯環(huán)和五元環(huán)或六元環(huán)結(jié)構(gòu)，與MWCNTs的π 電子體系易形成π-π 共軛作用，因此MWCNTs對SAs藥物具有較好的吸附能力，回收率高、凈化效果較好。

表1 HPLC-UV 測定9種磺胺類藥物的添加回收率和相對標準偏差（n＝6）Table 1 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of the nine SAs in spiked samples determined by HPLC-UV with MWCNTs SPE（n＝6）

3 結(jié)論

采用MWCNTs作為SPE 吸附劑搭建反相凈化體系，建立了豬肉、雞肉樣品中多種SAs獸藥殘留的HPLC-UV 測定方法。凈化效果較好，表明MWCNTs SPE是一種具有較好應(yīng)用前景的動物組織樣品殘留物的凈化柱；且MWCNTs SPE 柱的價格比常用的C18 SPE柱低，可降低分析成本。但對于種類繁多的SAs，由于受到藥物酸堿性的影響，MWCNTs SPE柱在反相體系中難以在一個pH 值下同時分析p Ka范圍較寬的SAs。因此MWCNTs SPE柱對SAs的應(yīng)用還需要進行更多的探索，比如采用正相分析體系，減少酸堿性的影響等。

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