超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜雙內(nèi)標(biāo)法同時(shí)測(cè)定復(fù)方杏香兔耳風(fēng)膠囊中的10種有效成分

范曉蘇， 龐 倩， 徐遠(yuǎn)金＊

（1.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西大學(xué)，廣西 南寧530004；2.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧530004）

復(fù)方杏香兔耳風(fēng)膠囊由杏香兔耳風(fēng)、白術(shù)兩味中藥材研制而成，具有清熱解毒、祛瘀生新的功效，用于濕熱下注所致陰道炎、白帶等癥。其中杏香兔耳風(fēng)含有倍半萜、三萜、黃酮、酚酸類化合物［1，2］；白術(shù)中主要含有揮發(fā)油、內(nèi)酯類化合物及多糖［3］。

已有文獻(xiàn)報(bào)道采用紫外分光光度法［4］、近紅外光譜法［5］、高效液相色譜法［6-11］測(cè)定杏香兔耳風(fēng)中綠原酸、原兒茶酸、原兒茶醛、3，5-二咖啡酰奎寧酸、木犀草素的含量；采用毛細(xì)管電泳法［12］、微管液相色譜法［13］、高效液相色譜法［14，15］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［16］測(cè)定白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯I、白術(shù)內(nèi)酯III的含量，以及采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［17］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［18，19］測(cè)定其在血液中的濃度；也有高效液相色譜法測(cè)定中成藥復(fù)方杏香兔耳風(fēng)膠囊中木犀草素、綠原酸含量的報(bào)道［20，21］。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法相對(duì)于高效液相色譜法具有定性能力強(qiáng)和靈敏度高 的 優(yōu) 點(diǎn)，已 廣 泛 應(yīng) 用 于 食 品［22，23］、藥 品［24］、飼料［25］的分析等領(lǐng)域。但同時(shí)測(cè)定原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、野黃芩苷、黃芩苷、異綠原酸C、木犀草素、芹菜素、白術(shù)內(nèi)酯III和白術(shù)內(nèi)酯I含量的分析方法尚未見有報(bào)道。本文建立了采用以咖啡酸和淫羊藿苷為內(nèi)標(biāo)同時(shí)測(cè)定復(fù)方杏香兔耳風(fēng)膠囊中原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、野黃芩苷、黃芩苷、異綠原酸C、木犀草素、芹菜素、白術(shù)內(nèi)酯III和白術(shù)內(nèi)酯I（結(jié)構(gòu)式見圖1）10種有效成分含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS／MS）分析方法。該方法準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便快速，已成功用于實(shí)際樣品的分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290Infinity LC System，Agilent 6460 Triple Quad LC／MS（美國(guó)Agilent公司）；Eppendorf Centrifuge 5810 R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；Synthesis A10TM超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；ME215S電子天平（德國(guó)Sar-torius公司）；KQ2200DV 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

甲醇、乙腈和甲酸購(gòu)自Fisher公司（色譜純）；對(duì)照品原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、咖啡酸（IS）和黃芩苷購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所（純度為98%），野黃芩苷、異綠原酸C、木犀草素、芹菜素、淫羊藿苷（IS）、白術(shù)內(nèi)酯III和白術(shù)內(nèi)酯I購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司（純度為98%）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；復(fù)方杏香兔耳風(fēng)膠囊樣品為江西銀濤藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)分別為1212016、1302002、1307007。

1.2 溶液制備

1.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液

選用咖啡酸為原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸和異綠原酸C 的內(nèi)標(biāo)物，淫羊藿苷為野黃芩苷、黃芩苷、木犀草素、芹菜素、白術(shù)內(nèi)酯III和白術(shù)內(nèi)酯I的內(nèi)標(biāo)物。準(zhǔn)確稱取含咖啡酸10.0 mg 和淫羊藿苷5.00 mg 的對(duì)照品，分別用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，配成1.00 g／L 和0.500 g／L 的儲(chǔ)備液，于4 ℃下保存，使用前用甲醇稀釋到所需濃度。

1.2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液

準(zhǔn)確稱取含原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、野黃芩苷、異綠原酸C、黃芩苷、木犀草素、芹菜素、白術(shù)內(nèi)酯III和白術(shù)內(nèi)酯I各10.0 mg的對(duì)照品，分別用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，配成1.00 g／L的儲(chǔ)備液，于4℃下保存，使用前用甲醇稀釋到所需濃度。

1.2.3 供試樣品溶液

取復(fù)方杏香兔耳風(fēng)膠囊樣品數(shù)粒，除去其膠囊，取其內(nèi)容物，研碎，混勻。精密稱取0.5 g置于具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入50 mL50%（v／v）乙醇水溶液，密塞，搖勻，稱定重量，在40 ℃超聲波儀中超聲60 min，靜置，放冷，再稱定重量，用50%（v／v）乙醇水溶液補(bǔ)足減少的質(zhì)量。另取10 mL容量瓶，準(zhǔn)確加入0.01 mL的1.00 g／L咖啡酸儲(chǔ)備液、0.500 g／L淫羊藿苷儲(chǔ)備液及2 mL的復(fù)方杏香兔耳風(fēng)膠囊樣品溶液，用50%（v／v）乙醇水稀釋至刻度，搖勻；在4 000 r／min、4 ℃條件下離心15 min，取上層清液，經(jīng)0.22μm 微孔濾膜過濾后作為供試樣品溶液。

圖1 10種分析物和2種內(nèi)標(biāo)物的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of the ten analytes and two internal standards

1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8μm）。以甲醇（A）和含0.3%甲酸的水（B）為流動(dòng)相。梯度洗脫程序：0～5 min，15%A～20%A；5～7 min，20%A～40%A；7～9 min，40%A～45%A；9～17 min，45%A～60%A；17～20 min，60%A～65%A；20～22 min，65%A～100%A。流速：0.3 mL／min；進(jìn)樣量：1μL。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離源（ESI），采用正、負(fù)離子快速切換、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式監(jiān)測(cè)；干燥氣體為N2，溫度為300 ℃，流速為10 L／min；霧化氣體為N2，霧化器壓力為2.8×105Pa；鞘氣氣體為N2，溫度為360 ℃，流速為12 L／min；毛細(xì)管電壓為4 000 V，噴嘴電壓為0V。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙內(nèi)標(biāo)物的選擇

實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行了篩選，由于原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、異綠原酸C 結(jié)構(gòu)比較類似，且保留時(shí)間也相對(duì)接近；而野黃芩苷、黃芩苷、木犀草素、芹菜素結(jié)構(gòu)類似，保留時(shí)間也相近；白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯I與野黃芩苷、黃芩苷、木犀草素、芹菜素結(jié)構(gòu)雖不類似，但保留時(shí)間較接近，且10個(gè)物質(zhì)間的保留時(shí)間差異較大，可采用雙內(nèi)標(biāo)法。實(shí)驗(yàn)過程中考察了嗎啡、丹皮酚、咖啡酸、蒙花苷、左氧氟沙星、射干苷、淫羊藿苷等物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)，發(fā)現(xiàn)咖啡酸和淫羊藿苷作為內(nèi)標(biāo)物能與待測(cè)物質(zhì)完全分離，且穩(wěn)定性好。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

對(duì)常用流動(dòng)相甲醇-水和乙腈-水體系進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，使用乙腈-水體系作流動(dòng)相時(shí)，原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、咖啡酸的保留時(shí)間短，組分間未完全分離；使用甲醇-水體系作流動(dòng)相時(shí)，色譜峰形對(duì)稱、分離效果好，且質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度也高于乙腈-水體系。流動(dòng)相中添加低濃度的有機(jī)酸有利于降低綠原酸、咖啡酸和異綠原酸C 峰的拖尾現(xiàn)象，且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加甲酸時(shí)質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度優(yōu)于乙酸（見圖2），故在流動(dòng)相中添加甲酸。且隨著流動(dòng)相中甲酸濃度的改變，各組分峰面積變化不大。綜合考慮正離子和負(fù)離子模式檢測(cè)的組分，選擇以甲醇和0.3%甲酸的水為流動(dòng)相體系進(jìn)行梯度洗脫。

圖2 流動(dòng)相中甲酸和乙酸的含量對(duì)12種組分峰面積的影響Fig.2 Effects of the volume fractions of formic acid and acetic acid in mobile phase on the peak areas of the twelve components

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別對(duì)對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)的母離子進(jìn)行二次碎裂，得到二級(jí)質(zhì)譜特征離子譜圖（見圖3）；再以選擇的子離子優(yōu)化其他質(zhì)譜條件。表1為優(yōu)化的源內(nèi)碎裂電壓和碰撞能量。從圖3中，可以看出野黃芩苷、黃芩苷、木犀草素、芹菜素、白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯I、淫羊藿苷（IS）的準(zhǔn)分子離子峰為［M＋H］＋；原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、異綠原酸C、咖啡酸（IS）的準(zhǔn)分子離子峰為［M-H］-；從優(yōu)化試驗(yàn)中選出各物質(zhì)響應(yīng)最強(qiáng)且穩(wěn)定的子離子作為定量子離子，因此進(jìn)行正、負(fù)離子切換多反應(yīng)監(jiān)測(cè)時(shí)，分別對(duì)原兒茶酸m／z 109.0、原兒茶醛m／z 108.1、綠原酸m／z 191.1、野 黃 芩 苷 m／z 287.0、異 綠 原 酸 C m／z 353.0、黃 芩 苷m／z 271.0、木 犀 草 素m／z 153.0、芹 菜 素m／z 153.0、白 術(shù) 內(nèi) 酯III m／z 163.0、白 術(shù) 內(nèi) 酯I m／z 187.2、咖 啡 酸（IS）m／z 135.1、淫羊藿苷（IS）m／z 531.2的碎片離子進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

表1 10種組分及2種內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS／MS parameters of the ten compounds and the two internal standards

圖3 10種對(duì)照品和2種內(nèi)標(biāo)的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 MS／MS spectra of the ten standards and the two internal standards

2.4 色譜與質(zhì)譜行為

在選定的色譜-質(zhì)譜條件下，根據(jù)峰的保留時(shí)間及質(zhì)譜信息進(jìn)行定性及定量分析。對(duì)照品及樣品的MRM 譜圖見圖4。木犀草素、芹菜素有拖尾現(xiàn)象，在采用的色譜條件下難以通過添加甲酸或者乙酸來解決，但在MRM 檢測(cè)中采用固定的掃描時(shí)間，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精密度影響不大。

圖4 （a）對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)和（b）樣品與內(nèi)標(biāo)的MRM 色譜圖Fig.4 Multiple reaction monitoring chromatograms of（a）standards with internal standards and（b）a sample with internal standards

2.5 線性關(guān)系及檢出限

取各對(duì)照品儲(chǔ)備液，精確配制一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于優(yōu)化條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，重復(fù)3次，以各物質(zhì)定量離子峰面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物定量離子峰面積比值的平均值（Y）對(duì)被測(cè)組分的質(zhì)量濃度（X，μg／L）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍。以信噪比（S／N）等于3為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得10種待測(cè)組分的檢出限（見表2）。

表2 10種組分的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 2 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients（r）and detection limits of the ten compounds

2.6 樣品提取方法的考察

取復(fù)方杏香兔耳風(fēng)膠囊樣品數(shù)粒，除去其膠囊，取其內(nèi)容物，研碎，混勻，于10個(gè)具塞錐形瓶中分別精密稱取0.5 g樣品，分別加入50 mL 乙醇、乙醇-水（95∶5，v／v）、乙醇-水（75∶25，v／v）、乙醇-水（50∶50，v／v）、乙醇-水（25∶75，v／v）、甲醇、甲醇-水（95∶5，v／v）、甲醇-水（75∶25，v／v）、甲醇-水（50∶50，v／v）、甲醇-水（25∶75，v／v），密塞，搖勻，稱定重量，超聲60 min，放冷，再稱定重量，用提取液補(bǔ)足減少的質(zhì)量。另取10 個(gè)10 mL 容量瓶，分別準(zhǔn)確加入0.01 mL的混合內(nèi)標(biāo)使用液和上述2 mL的復(fù)方杏香兔耳風(fēng)膠囊樣品溶液，用提取液稀釋至刻度，搖勻；于4 000 r／min、4 ℃條件下離心15 min，取上層清液，經(jīng)0.22μm 濾膜過濾后進(jìn)樣分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙醇-水（50∶50，v／v）的提取效果較好。

同時(shí)也考察了15、30、45、60、90 min不同提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在乙醇-水（50∶50，v／v）條件下超聲提取60 min的效果較好。

2.7 精密度和穩(wěn)定性

取同一批次樣品6份，按1.2.3節(jié)的方法制備樣品溶液，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定，結(jié)果顯示原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、野黃芩苷、異綠原酸C、黃芩苷、木犀草素、芹菜素、白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯I的平均質(zhì)量濃度分別為1.08、0.518、0.418、0.548、0.333、0.149、0.022 7、0.010 5、0.016 3、0.008 95 mg／L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.065%～2.0%，表明該方法有較好的精密度。

取同一批次樣品，按1.2.3節(jié)方法制備樣品溶液，于室溫下分別放置0、2、4、6、8、10 h后取樣，在優(yōu)化條件下測(cè)定，結(jié)果顯示10種目標(biāo)物的平均質(zhì)量濃度的RSD 為0.089%～3.1%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密稱取已知原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、野黃芩苷、異綠原酸C、黃芩苷、木犀草素、芹菜素、白術(shù)內(nèi)酯III和白術(shù)內(nèi)酯I含量的同批復(fù)方杏香兔耳風(fēng)膠囊樣品0.5 g共9份，3份為一組，分別加入精密稱定的低、中、高3 個(gè)質(zhì)量的混合對(duì)照品。按1.2.3節(jié)的方法制備樣品溶液并進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算10種成分的平均回收率，結(jié)果見表3。本方法在3個(gè)添加水平下，10種成分的加標(biāo)回收率為92.5%～106%，RSD 均不大于3.2%，能滿足復(fù)方杏香兔耳風(fēng)膠囊中10種有效成分的測(cè)定要求。

表3 10種組分在樣品中的加標(biāo)回收率（n＝3）Table 3 Recoveries of the ten compounds spiked in a sample（n＝3）

2.9 樣品分析

分別精密稱取不同批號(hào)的樣品各3 份，按1.2.3節(jié)的方法制備樣品溶液，按上述優(yōu)化好的條件進(jìn)行樣品測(cè)定，把各組分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值代入回歸方程計(jì)算得到樣品中10種組分的含量，結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可用于復(fù)方杏香兔耳風(fēng)膠囊中10種有效成分含量的同時(shí)測(cè)定。

表4 3批樣品中10種有效成分的含量Table 4 Contents of the ten compounds in three samples

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定復(fù)方杏香兔耳風(fēng)膠囊中原兒茶酸、原兒茶醛、綠原酸、野黃芩苷、異綠原酸C、黃芩苷、木犀草素、芹菜素、白術(shù)內(nèi)酯III、白術(shù)內(nèi)酯I 10種藥效成分含量的雙內(nèi)標(biāo)分析方法。該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，穩(wěn)定性好，已成功用于復(fù)方杏香兔耳風(fēng)膠囊中10種有效成分含量的同時(shí)測(cè)定。

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