周利敏 鄭喜群 劉曉蘭 劉 玥
(1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院,黑龍江 齊齊哈爾 161006;2.農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點實驗室,黑龍江 齊齊哈爾 161006)
中國玉米產(chǎn)量約占世界玉米總產(chǎn)量的20%,是世界上玉米生產(chǎn)第二大國,美國玉米產(chǎn)量位居世界第一位[1]。
玉米中營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富,如蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、維生素及微量元素等,具有開發(fā)高營養(yǎng)、高生物學功能食品的巨大潛力,而且種植面積廣泛、產(chǎn)量高,不只是依靠籽粒作為單一用途的作物,而逐漸發(fā)展成為集糧食、飼料、工業(yè)原料等多用途為一體的產(chǎn)品[2]。目前中國玉米深加工產(chǎn)品結構較單一、質(zhì)量較差、原料利用率較低[2]。作為工業(yè)原料主要用于生產(chǎn)淀粉,其副產(chǎn)物浸泡液、粉漿等用作發(fā)酵工業(yè)的原料,一部分玉米淀粉則用于生產(chǎn)淀粉糖和生化用品等[3]。
在玉米濕法淀粉生產(chǎn)過程中,每加工l萬t玉米會產(chǎn)生300~350t的玉米漿、350t的胚芽餅和600t的玉米蛋白粉[4]。玉米蛋白粉(corn gluten meal,CGM)是玉米淀粉濕法加工中產(chǎn)量最大、蛋白質(zhì)含量最高的副產(chǎn)物。CGM含62%~71%(m/m)的蛋白質(zhì),其主要組分是玉米醇溶蛋白(zein,65%~68%)和谷蛋白(glutelin,22%~33%)[5],此外,還含有20%左右的淀粉和10%~15%的纖維,維生素A,類胡蘿卜素及十幾種無機鹽等。玉米蛋白粉中疏水性氨基酸含量較高,而且缺少賴氨酸、色氨酸等人體必需氨基酸,這種特定的氨基酸組成導致玉米蛋白粉的水溶性差,難以被人體吸收。感官方面,玉米蛋白粉味苦,口感粗糙。所以,目前其在食品中的應用較少,主要被用作粗蛋白飼料[4]。
蛋白質(zhì)的生理功能特性取決于其氨基酸組成和結構。玉米醇溶蛋白是玉米蛋白粉的主要蛋白質(zhì)。玉米醇溶蛋白含有高比例的亮氨酸(19.3%~21.1%)、丙氨酸(8.3%~1 0.5%)、異亮氨酸(5.0%~6.2%)、脯氨酸(9.0%~1 0.5%)等脂肪族氨基酸[6]。研究[7-10]表明,含有高比例的丙氨酸、亮氨酸等氨基酸的蛋白,具有促進體內(nèi)乙醇代謝的功效。玉米蛋白在其多肽鏈中存在多個功能區(qū),具有抗氧化、促進酒精代謝、抗高血壓等多肽功能序列[11-15]。玉米蛋白有效利用的瓶頸是功能特性釋放問題,改善其水溶性,可使其功能性釋放出來。
基于玉米醇溶蛋白的水溶性差的性狀,本研究擬采用蛋白酶酶解的方法,改善玉米醇溶蛋白的水溶性,細致分析其Alcalase與Protamex酶解物的分子量分布,為玉米蛋白在工業(yè)上的廣泛應用提供基礎數(shù)據(jù)。
1.1.1 材料與試劑
玉米蛋白粉:黑龍江省青岡縣淀粉廠;
Alcalase堿性蛋白酶(固體):比活力為5.0×104U/g,諾維信公司;
Protamex復合蛋白酶(固體):比活力為4.32×104U/g,諾維信公司;
凝膠過濾色譜標準蛋白(藍色葡聚糖2 000,Aprotinine、桿菌肽、還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽):美國GE公司;
其它試劑均為市售分析純試劑。
1.1.2 主要儀器設備
pH計:PB-10型,北京伯樂生命科學發(fā)展有限公司;
高效液相色譜儀:Hitachi L-7100型,天美(中國)科學儀器有限公司。
1.2.1 玉米醇溶蛋白的提取 采用60%~95%乙醇萃取法[16]。
1.2.2 原料理化指標測定
(1)蛋白含量測定:采用微量凱氏定氮法,參照GB 5009.5—85;
(2)水分的測定:采用恒重法,參照GB 5497—85;
(3)酶活力測定:采用福林—酚法,參照SB/T 10317—1999;
(4)水解度的測定:采用pH-stat法[17]。
1.2.3 玉米醇溶蛋白的酶解方法 稱取一定質(zhì)量的玉米醇溶蛋白(蛋白干基)配制成蛋白濃度5%的懸濁液,置45℃恒溫磁力加熱攪拌器中預熱,調(diào)節(jié)初始pH 9.0,按照酶底比3%(m/m)加入Alcalase堿性蛋白酶和Protamex復合蛋白酶,開始計時,酶解期間用0.1MNaOH穩(wěn)定體系pH為9.0。達到指定的水解度后,于85℃水浴中滅酶5min。立即冷卻,10 000r/min離心10min,上清液即為酶解液。
1.2.4 酶解物分子量分布測定方法 利用凝膠色譜法測定玉米醇溶蛋白酶解物的分子量分布特征。用凝膠色譜預裝柱Superdex peptide 10/300GL(13μm)在高效液相色譜儀上進行測定
(1)凝膠色譜標準蛋白分子量標準曲線的繪制:所用標準蛋白分子量為:Ⅰ藍色葡聚糖2 000(2 000kDa),ⅡAprotinine(6.5kDa),Ⅲ 桿菌肽(1.4kDa),Ⅳ 氧化型谷胱甘肽(0.6kDa),Ⅴ還原型谷胱甘肽(0.3kDa)。凝膠柱外水體積V0用藍色葡聚糖2 000測定。將藍色葡聚糖2 000、aprotinine、桿菌肽、氧化型谷胱甘肽、還原型谷胱甘肽分別按照濃度1.0,0.5,1.0,1.5,2.0mg/mL,用 pH 7.0 20mmol/L的磷酸鹽緩沖液配制混合標準蛋白溶液。
標準蛋白樣品過0.22μm微孔濾膜后上樣進行Superdex peptide 10/300GL凝膠色譜。上樣量100μL,流速0.25mL/min,紫外檢測波長為214nm,測定各分子量標準蛋白的洗脫體積(Ve)。以標準蛋白分子量對數(shù)(lgMr)做縱軸,有效分配系數(shù)(Kav)做橫軸,作出標準曲線,其中,有效分配系數(shù)按式(1)計算。標準曲線如圖1所示。
式中:
Kav——有效分配系數(shù);
Ve——洗脫體積,mL;
V0——外水體積,mL;
Vt——柱體積,mL。
圖1 標準蛋白的分子量對數(shù)與有效分配系數(shù)Kav關系曲線Figure 1 The correlation curve between lg Mr of molecular weight standards and their Kav
(2)玉米醇溶蛋白酶解物分子量分布測定:取適量玉米醇溶蛋白酶解液,上樣前過0.22μm微孔濾膜,上樣量1 00μL。洗脫條件與標準蛋白相同。將樣品的凝膠層析譜圖與標準蛋白凝膠層析譜圖進行比對,計算酶解物分子量分布。
經(jīng)提取的玉米醇溶蛋白的蛋白含量為90.41%,水分含量為5.13%。
堿性蛋白酶Alcalase和Protamex具有高度的安全性,符合FAO/WHO推薦的食品級酶制劑標準。Alcalase是一種內(nèi)切肽酶,由選育出的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)生產(chǎn)而得。它的主要有效成分枯草桿菌蛋白酶A(subtilisin carlsberg,EC 3.4.21.62)是一種內(nèi)切蛋白酶,對肽鍵特異性較弱,優(yōu)先水解不帶電荷的較大分子量蛋白質(zhì)或肽的鍵[16]。Protamex是由枯草桿菌產(chǎn)生的,其活性中心含絲氨酸殘基,作用位點廣泛,專一性不強。
按照1.2.3所示方法,分別利用Alcalase和Protamex酶解玉米醇溶蛋白,間隔30min分別計算水解度。水解度隨反應時間的變化關系見圖2。
圖2 反應時間對堿性蛋白酶及復合蛋白酶水解玉米醇溶蛋白水解度的影響Figure 2 Effects of reaction time on DH of the zein by alcalase and protamex respectively
由圖2可知:隨著水解時間的延長,Alcalase與Protamex水解玉米醇溶蛋白的水解度均呈現(xiàn)先快速增大,后緩慢增加的趨勢,在反應開始的前30min,酶促反應均為一級反應,30~90min,酶促反應均由一級反應進入混合級反應,當水解時間達到4h時,水解度均趨近恒定,催化反應進入零級反應階段,此時蛋白水解度分別達到3 2.29%和3 1.34%。整體來看,與Protamex相比,Alcalase酶解玉米醇溶蛋白作用效果較強烈,這與玉米醇溶蛋白的蛋白酶作用位點有關。
蛋白酶解物的肽分子量分布是重要的性質(zhì)之一,直接影響酶解物的理化性質(zhì)和功能性質(zhì)[18,19]。按照1.2.3方法,利用Alcalase酶解玉米醇溶蛋白,分別測定水解度2%,6%,15%,3 2.29%時的酶解液的肽分子量分布,結果見圖3。
由圖3可知,隨著水解反應的進行,色譜圖呈現(xiàn)兩個明顯的趨勢,主峰峰高逐漸增加和峰保留時間逐漸增大。增大水解度,不溶于水的玉米醇溶蛋白部分繼續(xù)被酶切為可溶性的短肽,導致酶解液中的可溶性肽含量增加;同時,酶解液中的可溶性短肽繼續(xù)被Alcalase作用,酶切為分子量更小的組分。
一種酶水解蛋白質(zhì)往往不徹底,屬于部分水解,得到大小不一的肽段或氨基酸的混合物。當用Alcalase水解玉米醇溶蛋白時,酶解液中分子量300~4 000Da的肽段為主要組分,水解度2%(圖3(a))時占77.06%。隨著水解程度的加深,主要組分所占比例降低。水解度6%(圖3(b))時占69.65%,水解度15%(圖 3(c))時占67.38%,水解度3 2.29%(圖3(d))時占59.83%。同時,分子量小于300Da的組分所占比例增大,色譜圖中保留時間79min(分子量120 Da)的組分面積隨水解度增大而增大。
此外,水解度2%,6%,15%,32.29%的酶解液中均存在大于玉米醇溶蛋白單體分子量(21~25kDa)的組分。說明玉米醇溶蛋白是單體以不同聚集程度而形成的聚集體存在。水解度小于15%時,部分玉米醇溶蛋白單體仍不同程度地以聚集體的形式存在;當水解度達到32.29%時,聚集體的形式基本被展開。郭云昌等[20]用 AFM在4.00μm×4.00μm范圍內(nèi)掃描觀察,發(fā)現(xiàn)玉米醇溶蛋白聚集體主要集中在50~150nm。聚集體的存在形式也使得Alcalase首先作用于暴露在肽鏈外側的位點,酶切下分子量較小的肽段。
按照1.2.3所示方法,利用Protamex酶解玉米醇溶蛋白,分別測定水解度2%,6%,15%,31.34%時酶解液的肽分子量分布,結果見圖4。
由圖4可知:與Alcalase作用效果相似,Protamex水解玉米醇溶蛋白時,隨著水解反應的進行,也呈現(xiàn)兩個明顯的趨勢,主峰峰高逐漸增加和峰保留時間逐漸增大。水解度2%時,酶解液中蛋白聚集體較大;水解度大于2%時,酶解液中蛋白聚集體逐漸被展開。
當用Protamex水解玉米醇溶蛋白時,酶解液中分子量300~4 000Da的主要肽段分別為水解度2%(圖4(a))時占78.96%,水解度6%(圖4(b))時占71.32%,水解度15%(圖4(c))時 占 69.08%,水 解 度 31.34% (圖 4(d))時 占 6 1.06%。分子量小于300Da的組分所占比例隨水解度增加而增大。水解度大于15%,色譜圖中保留時間為79min的主峰面積顯著增大。
與Alcalase相比,相同的水解度下,Protamex水解玉米醇溶蛋白酶解液中主要肽段所占比例均稍大,但主峰峰高較低,所以,Protamex酶解的玉米醇溶蛋白酶解液中可溶性蛋白含量稍低,這表明Protamex作用于玉米醇溶蛋白比Alcalase水解的效果稍弱,與試驗現(xiàn)象一致。
圖3 Alcalase酶解玉米醇溶蛋白酶解液中肽分子量分布Figure 3 Molecular weight distribution profiles of zein hydrolysate of hydrolysis by alcalase
圖4 Protamex酶解玉米醇溶蛋白酶解液中肽分子量分布Figure 4 Molecular weight distribution profiles of zein hydrolysate of hydrolysis by protamex
Alcalase與Protamex都能有效地改善玉米醇溶蛋白的溶解性,相同的水解度下,Alcalase作用的玉米醇溶蛋白酶解液中的可溶性蛋白含量較高。在Alcalase和Protamex蛋白酶作用于玉米醇溶蛋白的過程中,聚集體形式的玉米醇溶蛋白首先被Alcalase和Protamex酶切作用逐漸展開,隨著酶解的進行,酶解物中的肽段分子量分布逐漸減小。依據(jù)使用需求,兩種蛋白酶生物催化玉米醇溶蛋白獲得的不同分子量分布的蛋白水解物均可在食品行業(yè)廣泛應用。
1 張龍.玉米利用現(xiàn)狀及副產(chǎn)品開發(fā)[J].食品工程,2009(4):14~15.
2 LV Zhi-wei,Hu Xiao-ming.Production of biotechnology fulvic acid from fermented corn straws by microbial community LCM9 and its application effect[J].Agricultural Science &Technology,2010,38(35):20 466~20 468.
3 陳志輝,趙政文.湖南省特用玉米生產(chǎn)現(xiàn)狀評述及發(fā)展對策[J].作物研究,2001(1):43~45.
4 尤新.玉米深加工技術[M].北京:中國輕工出版社,2008:255~268.
5 Magoichi Y,Masayasu T,Osamu N,et al.Preparation of corn peptide from gluten meal and its administration effect on alcohol metabolis in stroke-prone spontaneously hypertensive tats[J].J.Nutr.Sci.Vitaminol,1996(42):219~231.
6 Pomes A F.Zein[J].Encyclopedia of Polymer Science and Technology,1971(15):125~132.
7 Yamaguchi M,Nishikiori F,Ito M.Effect of com peptide on alcohol metabolism and plasma free amino acid concentrations in healthy men[J].European Journal of Clinical Nutrition,1996(10):682~688.
8 Yamaguchi M,Nishikori F,Yoshida M.Water soluble vegetable oligopeptides:comparative study on alcohol metabolism and plasma amino acid concentrations in stroke-pr-ne spontaneously hypertensive rats[J].Journal of Food BiochEmistry,1998(3):227~244.
9 Magoichi,Nichikiori,F(xiàn)umi,et al.Effect of long-term corn peptide ingestion on alcohol metabolism in strokepronr spontaneously hypertensive rats with alcoholloading[J].J.Nutr.Sci.Vitaminol,1996,42(6):567~580.
10 Ma Z L,Zhang W J,Yu G C,et al.The primary structure identification of a corn peptide facilitating alcohol metabolism by HPLC—MS/MS[J].Peptides,2012,37(1):138~143.
11 Suh H J,Whang J H,Lee H.A peptide from corn gluten hydrolysate that is inhibitory toward angiotensin I converting enzyme[J].Biotechnology Letters,1999,21(12):1 055~1 058.
12 Suh H J,Wang J H,Suh D B,et al.Preparation of angiotensin I converting enzyme inhibitor from corn gluten[J].Process Biochemistry,2003,38(8):1 239~1 244.
13 Zhang B,Luo Y,Wang Q.Effect of acid and base treatments on structure,rheological,and antioxidant properties ofα-zein[J].Food Chemistry,2011,124(1):210~220.
14 Zheng X Q,Li L L,Liu X L,et al.Production of hydrolysate with antioxidative activity by enzymatic hydrolysis of extruded corn gluten[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2006,73(4):763~770.
15 Zhou K,Sun S,Canning C.Production and functional characterisation of antioxidative hydrolysates from corn protein via enzymatic hydrolysis and ultrafiltration[J].Food Chemistry,2012,135(3):1 192~1 197.
16 鄭喜群.玉米黃粉的酶解工藝與抗氧化活性肽的制備[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學,2006.
17 Lowry O H,Rosebrough N J,F(xiàn)arr A L,et al.Protein measurement with the Folin phenol reagent[J].Journal of Biological Chemistry,1951,193(1):264~275.
18 Frankc C,Swaisgood D H.Spectrophotometric assay using ophthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins[J].J.Dairy Sci.,1983,66(6):1 219~1 227.
19 Jens A N.Enzymic hydrolysis of food proteins[M].London and New York:Elsevier Applied Science Publishers,1986:122~144.
20 郭云昌,劉鐘棟,安宏杰,等.基于AFM的玉米醇溶蛋白的納米結構研究[J].鄭州工程學院學報,2004,25(4):8~11.