紫蘇葉中總黃酮的超聲波輔助提取工藝優(yōu)化

陳洪彬 鄭金水 蔡英卿 張晨曦 陳明賢（.泉州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，福建 泉州 3600；.福建省泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 泉州 36；3.分子生物學(xué)與藥物化學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 泉州 3600）

紫蘇（Perilla frutescensL.）又名紅蘇、香蘇、蘇草、桂荏等，為唇形科（Lamiaceae）紫蘇屬（Perilla）下唯一種，是藥食兼用的一年生草本植物，主產(chǎn)于東南亞以及中國(guó)的臺(tái)灣、江西、湖南等省［1，2］。紫蘇葉中富含紫蘇醛、紫蘇醇、左旋檸檬烯等揮發(fā)性油和迷迭香酸、咖啡酸、阿魏酸等酚酸類以及芹菜素、木犀草素等黃酮類物質(zhì)，具有解熱鎮(zhèn)靜、抗炎、抗過敏、抗氧化、抗腫瘤、降脂保肝、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等功效，也廣泛用作烹飪風(fēng)味調(diào)料［2－5］。國(guó)內(nèi)外研究中有關(guān)總黃酮的提取 方 法 主 要 有 水 浴 浸 提［6］、微 波 輔 助［7，8］、超 聲 波 輔助［9，10］、微波—超聲波協(xié)同輔助［11］、超臨界 CO2流體萃?。?2］等，超聲波輔助提取通過其機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增強(qiáng)介質(zhì)的穿透力，可有效增加總黃酮的提取率，降低成本［10］。目前，有關(guān)紫蘇葉中的化學(xué)成分研究主要集中在其揮發(fā)性精油［1，5］，對(duì)其黃酮類成分的研究較少且集中在抗氧化活性評(píng)價(jià)方面，對(duì)其提取工藝優(yōu)化較少深入研究［7－9］。本研究擬以紫蘇葉為試驗(yàn)材料，采用超聲波輔助乙醇提取法提取總黃酮，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化紫蘇葉中總黃酮的提取工藝，以期為紫蘇葉的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

材料：紫蘇葉采自福建泉州市農(nóng)科所園區(qū)，60℃烘干后粉碎至80目備用；

數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱：GZX－9240MBE型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；

萬能粉碎機(jī)：ZN－02型，北京興時(shí)利合科技發(fā)展有限公司；

電子天平：BS124S型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；

雙頻數(shù)控超聲波清洗器：KQ－300VDE型，300W，昆山超聲儀器有限公司；

冷凍高速離心機(jī)：TGL－16G型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

可見分光光度計(jì)：V－1100型，上海美譜達(dá)儀器有限公司；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：生物級(jí)，上海金穗生物科技有限公司；

亞硝酸鈉、硝酸鋁、無水乙醇、氫氧化鈉等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

紫蘇葉→60℃恒溫干燥→粉碎、過80目篩→超聲波輔助提取→離心→定容→檢測(cè)

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 參考王艷麗等［11］的方法，以蘆丁為標(biāo)品，采用NaNO2—Al（NO3）3顯色法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y＝ 0.886x＋ 0.007（R2＝ 0.995），其中y為黃酮溶度（mg/mL），x為吸光值。

1.2.3 總黃酮含量的測(cè)定 參考王艷麗等［11］的方法，采用NaNO2—Al（NO3）3顯色法測(cè)定提取液中總黃酮的含量，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃酮濃度及提取率。

式中：

Y——紫蘇葉總黃酮提取率，%；

C——測(cè)定樣液黃酮濃度，mg/mL；

V0——提取液總體積，mL；

n——稀釋倍數(shù)；

V1——測(cè)定吸取樣液體積，mL；

m——稱取紫蘇葉干粉末質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）液料比對(duì)總黃酮提取率的影響：在超聲時(shí)間3 0min，超聲功率300W，乙醇濃度60%，提取溫度60℃下，液料比分別為10∶1，20∶1，3 0∶1，40∶1，50∶1，60∶1（V∶m），考察總黃酮的提取率。

（2）超聲時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響：在超聲功率3 00W，乙醇濃度60%，提取溫度60℃，液料比20∶1（V∶m）下，超聲時(shí)間分別為10，20，30，40，50min，考察總黃酮的提取率。

（3）乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響：在超聲時(shí)間3 0min，超聲功率300W，提取溫度60℃，液料比20∶1（V∶m）下，乙醇濃度分別為20%，40%，60%，80%，100%，考察總黃酮的提取率。

（4）提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響：在超聲時(shí)間3 0min，超聲功率300W，乙醇濃度60%，液料比20∶1（V∶m）下，提取溫度分別為30，40，50，60，70℃，考察總黃酮的提取率。

1.2.5 提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box－Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以紫蘇葉總黃酮提取率為響應(yīng)值，選取液料比、超聲時(shí)間、乙醇濃度、提取溫度4個(gè)影響因素，利用Design－Expert 8.05軟件設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 液料比對(duì)紫蘇葉中總黃酮提取率的影響 由圖1（a）可知：隨著液料比從10∶1（V∶m）到20∶1（V∶m），總黃酮提取率逐漸增加，在液料比為20∶1（V∶m）時(shí)，紫蘇葉總黃酮提取率最高；當(dāng)液料比超過20∶1（V∶m）后，總黃酮提取率逐漸下降。這是因?yàn)椋阂毫媳容^低時(shí)，紫蘇葉中總黃酮的浸出率降低；而液料比較高時(shí)，浸提液中總黃酮的濃度低，大大降低了后續(xù)濃縮的效率。故確定提取過程最佳液料比為2 0∶1（V∶m）。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)紫蘇葉中總黃酮提取率的影響 由圖1（b）可知：隨著超聲時(shí)間的增加，紫蘇葉中總黃酮提取率逐漸增加，超聲時(shí)間40min后增加幅度減少。雖然超聲浸提時(shí)間越長(zhǎng)，總黃酮提取率越高，但也會(huì)增加其他高分子雜質(zhì)的浸出，不利于后續(xù)對(duì)紫蘇葉黃酮類物質(zhì)的分離。故確定提取過程最佳超聲時(shí)間為30min。

2.1.3 乙醇濃度對(duì)紫蘇葉中總黃酮提取率的影響 由圖1（c）可知：隨著乙醇濃度從20%到40%，紫蘇葉總黃酮提取率增加，在乙醇濃度為40%時(shí)，紫蘇葉中總黃酮提取率最高。當(dāng)乙醇濃度超過40%后，總黃酮提取率逐漸下降。這是因?yàn)椋鹤咸K葉中黃酮類物質(zhì)以木犀草素為主，且多與糖苷結(jié)合在一起，水溶性相比其他游離黃酮高。同時(shí)，過高的乙醇濃度會(huì)增加紫蘇葉中葉綠素等脂溶性色素的浸出，干擾因素增加，不利于后續(xù)對(duì)紫蘇葉黃酮類物質(zhì)的進(jìn)一步分離。故確定提取過程最佳乙醇濃度為40%。

2.1.4 提取溫度對(duì)紫蘇葉中總黃酮提取率的影響 由圖1（d）可知：隨著提取溫度的提高，紫蘇葉總黃酮提取率逐漸提高，在提取溫度為50℃時(shí)，紫蘇葉總黃酮提取率最高，之后有所下降。這是因?yàn)椋哼^高的溫度會(huì)使提取溶劑中的乙醇濃度降低，減少紫蘇葉中黃酮類物質(zhì)的浸出，也會(huì)破壞黃酮的結(jié)構(gòu)。故確定最佳提取溫度為50℃。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果與分析

圖1 液料比、超聲時(shí)間、乙醇濃度和提取溫度對(duì)紫蘇葉總黃酮提取率的影響Figure 1 Effects ofliquid－material ratio，ultrasonic times，ethanol concentration，extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids from Perilla frutescens leaves

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別選取液料比、超聲時(shí)間、乙醇濃度、提取溫度4個(gè)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，以總黃酮提取率作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)的響應(yīng)值（表1）。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 因素和水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

表2 紫蘇葉中總黃酮提取響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

利用Design－Expert 8.05軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果（表2）進(jìn)行分析，得到以紫蘇葉總黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值的回歸方程：

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)回歸方程的有效性及各因素對(duì)紫蘇葉總黃酮提取率的影響程度，結(jié)果見表3。由表3可知，回歸模型P＜0.0001，說明回歸模型達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)P＝0.126 3＞0.05，不顯著，說明該模型合適；信噪比（Adeq Precision）＝17.59＞4，說明模型與試驗(yàn)值擬合度很好；回歸方程的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2＝0.956 4，校正決定系數(shù)＝0.912 9，說明該方程擬合度較高，可利用該模型對(duì)紫蘇葉總黃酮的提取率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。進(jìn)一步分析可知，A、C及C2項(xiàng)對(duì)紫蘇葉總黃酮提取率的影響極顯著（P＜0.01），A2、B2及AC項(xiàng)對(duì)紫蘇葉總黃酮提取率的影響顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)對(duì)紫蘇葉總黃酮提取率的影響不顯著（P＞0.05）。在所選的因素水平范圍內(nèi)，各因素對(duì)紫蘇葉總黃酮提取率的影響大小為：C＞A＞B＞D，即：乙醇濃度＞液料比＞超聲時(shí)間＞提取溫度。

表3 方差分析Table 3 ANOVA of the constructed regression model

表3 方差分析Table 3 ANOVA of the constructed regression model

＊表示差異顯著，P＜0.05；＊＊表示極差異顯著，P＜0.01。R2＝0.956 4，＝0.912 9，Adeq Precision＝17.59。

項(xiàng)目 平方和 自由度 均方 F值 P值 顯著性模型 41.045 919 46 14 2.931 851 21.968 78 ＜0.000 1 1.868 375 001 14 0.133 455失擬項(xiàng) 1.670 283 68 10 0.167 028 3.372 755 0.126 3 不顯著純誤差 0.198 091 321 4 0.049 523總和＊＊A 7.041 528 462 1 7.041 528 52.763 18 ＜0.000 1 ＊＊B 0.043 534 315 1 0.043 534 0.326 209 0.577 0 C 15.969 762 65 1 15.969 76 119.663 7 ＜0.000 1 ＊＊D 0.036 435 595 1 0.036 436 0.273 017 0.609 5 AB 0.030 829 323 1 0.030 829 0.231 009 0.638 2 AC 0.814 194 736 1 0.814 195 6.100 877 0.027 0 ＊AD 0.042 976 499 1 0.042 976 0.322 029 0.579 4 BC 0.054 610 75 1 0.054 611 0.409 206 0.532 7 BD 0.026 715 295 1 0.026 715 0.200 182 0.661 4 CD 0.040 327 021 1 0.040 327 0.302 176 0.591 2 A2 0.849 094 69 1 0.849 095 6.362 387 0.024 4 ＊B2 0.933 169 581 1 0.933 17 6.992 373 0.019 2 ＊C2 16.730 933 64 1 16.730 93 125.367 3 ＜0.000 1 ＊＊D2 0.189 176 255 1 0.189 176 1.417 525 0.253 6殘差42.914 294 46 28

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素的相互影響 根據(jù)回歸模型方差分析（表3）可知，液料比和乙醇濃度的交互項(xiàng)對(duì)紫蘇葉總黃酮提取率影響顯著，將超聲時(shí)間和提取溫度中的兩個(gè)因素固定在零水平，得到液料比和乙醇濃度兩個(gè)因素對(duì)紫蘇葉總黃酮提取率交互影響的響應(yīng)曲面圖（圖2）。由圖2可知：液料比和乙醇濃度之間的等高線形狀呈橢圓形，響應(yīng)曲面坡度非常陡峭，說明AC之間的交互作用強(qiáng)，對(duì)紫蘇葉中總黃酮提取率的影響大，達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

2.2.3 最佳工藝參數(shù)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 進(jìn)一步分析回歸方程，得到響應(yīng)面法優(yōu)化紫蘇葉中總黃酮超聲輔助提取的最佳工藝條件為：液料比29.24∶1（V∶m）、超聲時(shí)間40.02min、乙醇濃度44.57%、提取溫度50.51℃，在此條件下總黃酮提取率的理論值為5.56%。為進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的可靠性，根據(jù)實(shí)際可操作情況，采用修正的最佳提取工藝條件：液料比2 9∶1（V∶m）、超聲時(shí)間40min、乙醇濃度45%、提取溫度51℃，對(duì)超聲波輔助乙醇提取紫蘇葉中總黃酮工藝進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)（n＝3），得到紫蘇葉中總黃酮實(shí)際提取率的平均值為5.41%，與理論預(yù)測(cè)值5.56%誤差在5%以內(nèi)，說明該回歸模型可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

圖2 液料比和乙醇濃度兩因素交互作用對(duì)紫蘇葉中總黃酮提取率影響的等高線和響應(yīng)面圖Figure 2 Response surface plots and contour of liquidmaterial ratio and ethanol concentration interactive effects on the extraction rate of total flavonoids from Perilla frutescens leaves

3 結(jié)論

本研究通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)超聲波輔助提取紫蘇葉中總黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化、修正和驗(yàn)證，得到紫蘇葉中總黃酮提取的最佳工藝條件：液料比29∶1（V∶m）、超聲時(shí)間40min（超聲功率300W）、乙醇濃度45%、提取溫度51℃，在此條件下，總黃酮實(shí)際提取率達(dá)5.41%，說明試驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化紫蘇葉中總黃酮的提取具有實(shí)際可行性，為紫蘇葉的綜合開發(fā)利用，降低提取成本、減少能耗和工業(yè)化生產(chǎn)作業(yè)合理化提供有價(jià)值的參考依據(jù)。紫蘇葉中總黃酮的提取效果可能還與紫蘇葉的采收期、粉碎粒徑大小及采后存放環(huán)境等有關(guān)，對(duì)此，還需深入研究。

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