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    鵝肉發(fā)酵香腸菌種發(fā)酵性能與應(yīng)用研究

    2014-12-20 06:58:38王志威吳素娟李先保
    食品與機械 2014年5期
    關(guān)鍵詞:戊糖鵝肉酸乳

    王志威 吳素娟 李先保

    (安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院,安徽 鳳陽 233100)

    WANG Zhi-wei WU Su-juanLI Xian-bao

    鵝肉發(fā)酵香腸是指將鵝肉、豬背脂絞碎,加入鹽、糖、發(fā)酵菌種及香辛料等輔料,均勻混合后灌進腸衣,經(jīng)過微生物發(fā)酵而制成的風(fēng)味獨特、香味濃郁的發(fā)酵肉制品[1]。生產(chǎn)鵝肉發(fā)酵香腸的關(guān)鍵工藝是發(fā)酵劑的篩選和使用,發(fā)酵劑不僅保證了最終發(fā)酵成品的質(zhì)量安全性和穩(wěn)定性,而且決定了香腸的獨特風(fēng)味[2]。Maijala等[3]的研究結(jié)果表明,制備西式發(fā)酵香腸時,采用乳酸桿菌和微球菌混合發(fā)酵的效果比采用單一乳酸桿菌的好。中式發(fā)酵香腸若采用混合發(fā)酵菌種,生產(chǎn)出的產(chǎn)品其風(fēng)味也更優(yōu)[4]。此外,不同發(fā)酵劑對內(nèi)源菌群的影響作用不一致,一些發(fā)酵劑在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生細(xì)菌素,通??梢砸种婆c之相似的微生物[5]。有研究[6]認(rèn)為,2種乳酸菌混合培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的細(xì)菌素,導(dǎo)致其互相抑制,影響香腸的發(fā)酵效果。

    本研究在吸收西式發(fā)酵肉制品技術(shù)的基礎(chǔ)上,擬通過對植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、戊糖片球菌3種菌種的發(fā)酵性能分析,選出2種符合鵝肉發(fā)酵香腸發(fā)酵的發(fā)酵劑,并通過正交試驗確定復(fù)合發(fā)酵劑的最優(yōu)配比,從而制備出外觀、組織狀態(tài)、風(fēng)味較好的鵝肉香腸,并對鵝肉發(fā)酵香腸成熟過程和貯藏過程中的pH值和感官品質(zhì)等方面進行綜合分析。旨在為肉鵝養(yǎng)殖及深加工技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化提供試驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 原輔料

    鵝肉、豬肉肥膘、白胡椒粉、味精、五香粉、淀粉:鳳陽市售;

    乙醇、NaNO2、NaCl、Vc、蔗糖、葡萄糖:分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;

    木瓜蛋白酶:20萬U/g,南寧龐博生物工程有限公司;

    嗜酸 乳 桿 菌 (Lactobacillusacidophilus,La):編 號11073,中科院微生物所提供;

    植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,Lp):編號11016,中科院微生物所提供;

    戊糖 片 球 菌 (Pediococcuspentosaceus,Pp):編 號CICC23189,中科院微生物所提供;

    大腸桿菌、金黃色葡萄球菌:安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院微生物實驗室提供;

    無菌生理鹽水(用于對菌種凍干粉的活化):稱取8.5g氯化鈉加入到1 000mL蒸餾水中,在121℃下高壓滅菌1 5min;

    MRS固體培養(yǎng)基[7](用于菌種的培養(yǎng)和乳酸菌總數(shù)測定):蛋白胨10g,肉膏10g,酵母提取物5g,K2HPO42g,乙酸鈉5g,檸檬酸二銨1.5g,葡萄糖2 0g,吐溫80lmL,MgSO4·7H2O 0.6g,瓊脂15g,蒸餾水1 000mL,pH 值6.2~6.4;

    MRS液體培養(yǎng)基[8]:蛋白胨10g,肉膏10g,酵母提取物5g,K2HPO42g,乙酸鈉5g,檸檬酸二銨1.5g,葡萄糖2 0g,吐溫80lmL,MgSO4·7H2O 0.6g,蒸餾水1 000mL,pH值6.2~6.8。

    1.2 儀器與設(shè)備

    精密pH酸度計:PHS-3C型,上海精密科學(xué)儀器有限公司;

    斬拌機:CH-3508型,常熟凱博不銹鋼設(shè)備制造有限公司;

    絞肉機:M12S型,沈陽厚地實業(yè)有限公司;

    電子精密天平:JA61001型,上海精密科學(xué)儀器有限公司;

    電熱恒溫培養(yǎng)箱:HH.B11600型,上海躍進醫(yī)療器械廠;

    分析天平:FA2104N型,上海躍進醫(yī)療器械廠;

    手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器:SYQ-DSX-280B型,上海申安醫(yī)療機械廠;

    可見分光光度計:V-5000型,上海元析儀器有限公司;

    立式壓力蒸汽殺菌鍋:LS-B0L型,科大創(chuàng)新股份有限公司;

    低速離心機:KDC-40型,科大創(chuàng)新股份中佳分公司。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 菌種的活化 植物乳桿菌的活化[9]:在無菌條件下,用接種環(huán)將凍干粉菌種接種于滅菌后的MRS斜面培養(yǎng)上,在37℃下培養(yǎng)48h;用斜面上長出的菌種接種于MRS培養(yǎng)基上,于37℃培養(yǎng)48h;再次重復(fù)操作,直到長出的菌種生長良好為止,完成菌種的活化。戊糖片球菌和嗜酸乳桿菌的活化方法同植物乳桿菌。

    1.3.2 菌種發(fā)酵性能測定

    (1)耐食鹽能力的測定:采用添加了0,2,4,6,8g/L NaCl的液體MRS培養(yǎng)基,分別接入Lp、La、Pp 3種菌種,于3 6℃恒溫培養(yǎng)24h,600nm波長處測定相應(yīng)的吸光度值[10]。

    (2)耐亞硝酸鹽能力的測定:將3種菌種分別接種到添加有0,50,100,150mg/kg亞硝酸鹽含量的液體 MRS培養(yǎng)基,于3 6℃恒溫培養(yǎng)24h,600nm波長處測定吸光度值,以判斷3種菌種的存活情況[6]。

    (3)產(chǎn)粘性的測定:用10g/L蔗糖代替葡萄糖制作MRS固體培養(yǎng)基,將植物乳桿菌、戊糖片球菌和嗜酸乳桿菌3種菌種分別接種于該培養(yǎng)基上,同時作為對比,將這3種菌種分別接種于含有10g/L葡萄糖的 MRS培養(yǎng)基上,于3 6℃恒溫培養(yǎng)24h,用接種針挑起菌落直接觀察其產(chǎn)粘性[11]。

    (4)拮抗性的測定:在固體MRS培養(yǎng)基上對其中一種菌種進行劃線接種,于3 6℃恒溫培養(yǎng)24h,觀察菌落生長情況,并測出其菌落總數(shù)。

    (5)蛋白質(zhì)降解能力的測定:將1mL菌懸液涂布于加有15%脫脂乳的MRS固體培養(yǎng)基中,于3 6℃恒溫培養(yǎng)2 4h,通過菌落周圍的透明圈狀況來判定菌種蛋白質(zhì)降解能力[12]。

    (6)不同溫度生長能力的測定:將3種菌種分別接種于液體 MRS培養(yǎng)基中,分別在5,15,25,35,45℃下恒溫培養(yǎng)24h,同時把液體 MRS培養(yǎng)基作為空白對照組,于600nm下測定菌液的吸光度值。

    (7)抑菌能力的測定:將待測菌株接種到 MRS液體培養(yǎng)基中,于3 6℃恒溫培養(yǎng)48h,離心法取得發(fā)酵上清液,然后用牛津杯法測定各菌株發(fā)酵液的抑菌活性。牛津杯法的操作:將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌涂布于基礎(chǔ)培養(yǎng)基上,將經(jīng)滅菌的牛津杯間隔放置在指示菌平板上。首先向各個牛津杯中分別滴加200μL的乳桿菌發(fā)酵上清液,然后將混合菌液以1∶1(V∶V)的比例滴加到各牛津杯中,于3 6℃恒溫培養(yǎng)24h后取出,測量各抑菌圈直徑的大小[13]。

    1.3.3 鵝肉發(fā)酵香腸的工藝流程

    1.3.4 單因素試驗設(shè)計

    (1)菌種配比的影響:根據(jù)菌種發(fā)酵性能測定結(jié)果并考慮經(jīng)濟、操作方便等因素,在此次試驗中從3種菌種中選出植物乳桿菌和戊糖片球菌作為復(fù)合發(fā)酵劑。有研究[14]表明,菌種配比對香腸的酸度影響較小,但是對香腸風(fēng)味影響很大,所以在此次試驗中主要是選擇產(chǎn)生良好風(fēng)味的發(fā)酵劑配比。本試驗選取發(fā)酵溫度3 6℃,發(fā)酵時間24h,對植物乳桿菌和戊糖片球菌的復(fù)合配比進行兩因素三水平的試驗,并對產(chǎn)品進行感官評價。

    (2)發(fā)酵時間的影響:在混合菌種(Lp∶Pp)配比1∶1(V∶V),接種量3%(V/m),發(fā)酵溫度3 6℃的條件下,發(fā)酵時間分別選擇6,12,18,24,30h進行試驗,測量香腸的p H值。

    (3)混合菌種接種量的影響:在混合菌種(Lp∶Pp)配比1∶1(V∶V),發(fā)酵溫度36℃,發(fā)酵時間24h的條件下,接種量(V/m)分別選擇1.0%,2.0%,3.0%,4.0%,5.0%(菌體細(xì)胞的濃度是107CFU/mL)進行試驗,從發(fā)酵開始每隔6h對每一接種量的香腸的pH值進行測定。

    (4)發(fā)酵溫度的影響:在混合菌種(L p∶Pp)配比1∶1(V∶V),接種量為3%(V/m)的條件下,分別于27,30,33,36,40℃發(fā)酵36h,從發(fā)酵開始每隔6h對每一溫度下的香腸的pH值進行測定[8]。

    1.4 測定項目及方法

    1.4.1 pH值的測定 取發(fā)酵香腸內(nèi)容物10g,搗碎后加入90mL蒸餾水,震蕩浸提20min后提取上清液,用精密pH計測定pH值。

    1.4.2 菌落總數(shù) 按GB 4789.2—2010《食品衛(wèi)生微生物檢驗菌落總數(shù)測定》中的平板計數(shù)法執(zhí)行。

    1.4.3 感官評分 由10名有感官評分經(jīng)驗的教師組成評定小組,按照外觀、組織狀態(tài)、風(fēng)味,逐一對發(fā)酵香腸進行評價打分,其標(biāo)準(zhǔn)見表1[9]。

    表1 香腸感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Fermented sausage sensual evaluation standard

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌種發(fā)酵性能的試驗結(jié)果

    2.1.1 耐食鹽性測定結(jié)果 在發(fā)酵香腸的加工中,食鹽有防腐保鮮、調(diào)味及提高保水性等作用。有研究[6]表明,一定的食鹽濃度能抑制腐敗菌的生長,減少對蛋白質(zhì)的分解。食鹽濃度對發(fā)酵香腸的發(fā)酵有顯著的影響,一般發(fā)酵劑要求其耐鹽性達到6%[15]。本研究以菌種在液體培養(yǎng)基中吸光值的變化,研究其耐食鹽性,結(jié)果見表2。

    由表2可知,3種菌種均受食鹽含量變化的影響,食鹽濃度增加,菌種的生長受到抑制,吸光值變小。其中嗜酸乳桿菌的吸光值隨食鹽濃度的增加變化大,而植物乳桿菌和戊糖片球菌的變化相對較小。說明嗜酸乳桿菌的耐鹽能力低于植物乳桿菌和戊糖片球菌。

    表2 不同食鹽濃度下各菌種的吸光度值Table 2 Absorbency value of various strains in different salt concentrations

    2.1.2 耐亞硝酸鹽性測定結(jié)果 在發(fā)酵香腸的加工中,加入亞硝酸鹽可以增強產(chǎn)品風(fēng)味和色澤,抑制細(xì)菌的增殖,對肉毒梭狀芽孢桿菌抑制作用明顯,保證制品的微生物安全性。發(fā)酵香腸生產(chǎn)所選的發(fā)酵劑一般要求可耐100mg/kg的亞硝酸濃度,否則會抑制發(fā)酵菌種的發(fā)酵性能,且成品中的亞硝酸鹽殘留量也會增加,影響發(fā)酵香腸的安全性[16]。本研究以吸光值的變化作為菌種的生長指標(biāo),研究菌種的耐亞硝酸鹽性,結(jié)果見表3。

    表3 不同亞硝酸鈉濃度下各菌種的吸光度值Table 3 Absorbency value of various strains in different sodium nitrate concentrations

    由表3可知,隨著亞硝酸鈉濃度的增加,植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和戊糖片球菌的生長均受到不同程度的抑制。其中嗜酸乳桿菌的吸光度值隨亞硝酸鹽濃度的增加而變化明顯,植物乳桿菌和戊糖片球菌的變化相對緩慢。由此可知,嗜酸乳桿菌的耐亞硝酸鹽性低于戊糖片球菌和植物乳桿菌。

    2.1.3 產(chǎn)粘性試驗測定結(jié)果 在香腸發(fā)酵過程中,不能產(chǎn)生黏液,否則會破壞發(fā)酵香腸的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)。通過觀察培養(yǎng)基培養(yǎng)情況(見表4)可以發(fā)現(xiàn),3種菌的產(chǎn)粘性相對都很低,但是嗜酸乳桿菌的菌體出現(xiàn)流體狀的情況比其他2種菌的嚴(yán)重一些,表明3種菌種均符合發(fā)酵香腸的發(fā)酵要求,其中植物乳桿菌和戊糖片球菌更加適合。

    2.1.4 拮抗性試驗測定結(jié)果 本研究以單個菌種和兩兩混合的菌種(1∶1,V∶V)在培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)觀察其菌落總數(shù)來判斷其拮抗性,結(jié)果見表5。

    表4 各菌種產(chǎn)粘性結(jié)果Table 4 The result of different strains for glischrogenou

    由表5可知,3種菌種單獨培養(yǎng)24h后菌種數(shù)量均有所增長,兩兩混合菌種培養(yǎng)后的菌落數(shù)量相對單個菌種培養(yǎng)的菌落總數(shù)變化不大。由此可知,3種菌種之間兩兩的拮抗性不大,其中植物乳桿菌和戊糖片球菌的組合相對較好。因此,植物乳桿菌和戊糖片球菌可以作為發(fā)酵香腸的混合發(fā)酵劑。

    2.1.5 蛋白質(zhì)分解試驗測定結(jié)果 發(fā)酵香腸的生產(chǎn)中,要求蛋白質(zhì)分解只在其內(nèi)源蛋白酶的作用下降解產(chǎn)生多肽、氨基酸及風(fēng)味物質(zhì),發(fā)酵劑應(yīng)不具有降解蛋白質(zhì)的作用。若發(fā)酵劑具有降解蛋白質(zhì)的能力,則會在生產(chǎn)貯藏銷售中產(chǎn)生胺類等堿性物質(zhì),導(dǎo)致腐?。?7,18]。本研究用加入脫脂乳的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,觀察其降解蛋白質(zhì)的能力,結(jié)果見表6。由表6可知,植物乳桿菌菌落周圍無透明光圈,嗜酸乳桿菌和戊糖片球菌菌落周圍的光圈不明顯。因此,3種菌種均符合發(fā)酵香腸的生產(chǎn)要求。

    表6 各菌種蛋白質(zhì)分解能力試驗結(jié)果Table 6 The result of different strains for protein decomposing ability

    2.1.6 菌株不同溫度下的生長能力測定結(jié)果 低溫發(fā)酵香腸發(fā)酵溫度一般為18~24℃,高溫發(fā)酵香腸發(fā)酵溫度一般為28~36℃[15]。這就要求菌種要選擇適當(dāng)?shù)纳L溫度。由圖1可知,在不同的溫度條件下培養(yǎng),菌種的生長速度有較大的差異,隨著溫度的增加,其生長速度逐漸增加,當(dāng)溫度在35℃時,生長速度最快。由此可知,35℃左右是最適合3種菌種生長的溫度。

    2.1.7 菌種抑菌能力的測定結(jié)果 發(fā)酵香腸以生肉為原料,且多為生食,在發(fā)酵過程中殘留有致病菌和腐敗菌在所難免。其主要的致病菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等。本研究分別測定了3種菌種及兩兩混合菌種(1∶1,V∶V)對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力,結(jié)果見表7。

    圖1 3種菌不同溫度下的生長能力Figure 1 Growth ability of three kinds strains in different temperature

    表7 乳酸菌的抑菌活性Table 7 Antibacterial circle diameter in tactic acid bacteria activity /mm

    由表7可知,嗜酸乳桿菌的抑菌能力明顯低于其他2種菌;植物乳桿菌和戊糖乳桿菌混合菌液的抑菌效果優(yōu)于其他2種混合菌液及單一菌液。根據(jù)耐鹽、耐亞硝酸鹽和粘性試驗的結(jié)果,選擇植物乳桿菌和戊糖片球菌混合菌種作為鵝肉發(fā)酵香腸的發(fā)酵劑。

    2.2 菌種最優(yōu)配比試驗結(jié)果

    在發(fā)酵初期植物乳桿菌大量繁殖產(chǎn)生乳酸,香腸的pH值下降較快,影響戊糖片球菌的繁殖;發(fā)酵后期戊糖片球菌能夠更好的生長,并分解蛋白質(zhì)和脂肪,產(chǎn)生氨基酸和脂肪酸,賦予香腸良好的風(fēng)味[4]。為了考察植物乳桿菌和戊糖片球菌的交互作用對發(fā)酵香腸感官評價的影響,并確定二者的最優(yōu)配比,設(shè)計了兩因素三水平的試驗,結(jié)果見表8、9。

    由表8可知,隨著植物乳桿菌添加量的增加,感官評分呈下降趨勢;而隨著戊糖片球菌添加量的增加,香腸的風(fēng)味漸佳,有利于鵝肉發(fā)酵香腸質(zhì)量的改善。因此確定混合發(fā)酵劑的最優(yōu)配比是最終在植物乳桿菌和戊糖片球菌以1∶1(V∶V)的比例混合,接種量為3%。此配比下生產(chǎn)的發(fā)酵香腸的質(zhì)地柔軟有彈性,切片性較好,而且顏色鮮紅,酸味柔和,口感達到最佳。

    由表9可知,植物乳桿菌和戊糖片球菌對鵝肉發(fā)酵香腸的感官評價均有顯著影響,此外,二者之間的交互作用所產(chǎn)生的效應(yīng)對鵝肉發(fā)酵香腸的感官評價也在0.01水平上影響顯著,所以應(yīng)充分考慮二者相互作用產(chǎn)生的效應(yīng)對產(chǎn)量的影響,尋找兩因素的最佳組合。

    表8 菌種配比對香腸品質(zhì)影響的試驗設(shè)計及結(jié)果Table 8 Different strains ratio on the sausage-quality experimental design and results(n=3)

    表9 方差分析表Table 9 ANOVA table

    表9 方差分析表Table 9 ANOVA table

    誤差項及交互項參考文獻[19]的方法確定。

    差異源 平方和 自由度 均方差 F值 F臨界值顯著水平植物乳桿菌 78 2 39 8.775 F0.01=6.01 顯著戊糖片球菌 666 2 333 74.925 F0.01=6.01顯著交互 1 614 4 403.5 90.7 875 F0.01=4.58顯著誤差80 18 4.444 444總計2 438 26

    2.3 菌種在發(fā)酵過程中相關(guān)因素的確定

    2.3.1 發(fā)酵時間的確定 由圖2可知,鵝肉發(fā)酵香腸接種后,其pH值開始下降,在0~12h,pH值的下降速度較慢,在12~24hpH下降的速度較快,發(fā)酵24h后,其pH值趨于穩(wěn)定。此時香腸pH值為4.87,符合發(fā)酵香腸的pH標(biāo)準(zhǔn),再延長發(fā)酵時間會增加生產(chǎn)成本。因此,發(fā)酵時間選擇為24h。

    圖2 發(fā)酵時間對發(fā)酵香腸pH值的影響Figure 2 Effect of fermentation time on pH value of goose sausage

    2.3.2 發(fā)酵溫度的確定 發(fā)酵溫度的選擇關(guān)系到混合發(fā)酵菌種及腸內(nèi)各類微生物的生長競爭和平衡。由于發(fā)酵香腸的原材料未經(jīng)殺菌處理,為了保證發(fā)酵安全,應(yīng)該迅速使發(fā)酵劑成長為優(yōu)勢菌種,以產(chǎn)生乳酸,降低pH值,抑制雜菌生成。

    圖3顯示了發(fā)酵香腸在不同溫度下的產(chǎn)酸速度。在較高的溫度(39℃)時,產(chǎn)品發(fā)酵速度快,但腸體滲油現(xiàn)象比較明顯。而在較低的溫度(27,30,33℃)時,產(chǎn)酸速度較慢,發(fā)酵周期長,易引起其他雜菌的生長。而在36℃發(fā)酵時,發(fā)酵得到的產(chǎn)品酸度適中,故選擇36℃作為發(fā)酵溫度。

    圖3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵香腸pH值的影響Figure 3 Effect of fermentation temperature on pH value of goose sausage

    2.3.3 菌種接種量的確定 由圖4可知,發(fā)酵菌種的接種量與產(chǎn)酸速度正相關(guān),即發(fā)酵菌種接種量越大,產(chǎn)酸速度越快,這與李俊芳等[20]的研究結(jié)果一致。但是接種量過大(4%,5%,V/m)時,pH值會快速下降到較低值,使得短時間內(nèi)由于腸內(nèi)積累了大量的酸,且分布不夠均勻,使得腸的酸味刺激性較大,香味也不夠充足。而接種量過小(1%,2%,V/m)時,不僅產(chǎn)品的發(fā)酵周期較長,而且在發(fā)酵初期易受其他雜菌的污染。所以,接種量在3%(V/m)出現(xiàn)最佳值。

    3 結(jié)論

    圖4 接種量對發(fā)酵香腸pH值的影響Figure 4 Effect of inoculum quantity on pH value of goose sausage

    從耐食鹽、耐亞硝酸鹽性、是否產(chǎn)粘性、菌種之間是否有拮抗性,蛋白質(zhì)的分解能力和菌種的抑菌能力方面對菌種發(fā)酵性能方面進行研究,從而確定植物乳桿菌和戊糖片球菌組成的混合發(fā)酵劑是鵝肉發(fā)酵香腸的最優(yōu)發(fā)酵劑,二者按1∶1(V∶V)配比、接種量為3%(V/m)、在36℃恒溫發(fā)酵2 4h的條件下制成的鵝肉發(fā)酵香腸的pH值和水分活度均達到所需的要求,且呈現(xiàn)出質(zhì)地柔軟富有彈性、切片性好、顏色紅潤、酸味柔和、口味上乘的品質(zhì)。此外,隨著接種乳酸菌的發(fā)酵,香腸pH值迅速下降,使得有害雜菌的生產(chǎn)和繁殖受到顯著抑制,從而提升了鵝肉發(fā)酵香腸的安全性和穩(wěn)定性。

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