超聲波輔助溶菌酶酶解提取地木耳蛋白質(zhì)工藝優(yōu)化

李 讓 魯 軍 陳劍婷 袁 悅 田 漫 任迪峰

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品系北京市林業(yè)食品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京 100015）

地木耳（Nostoccommune）又名地皮菜、葛仙米、地耳等，屬原核生物界、藍(lán)藻門、念珠藻屬的單細(xì)胞陸生固氮藍(lán)藻，是一種高蛋白、低脂肪的綠色食品，蛋白質(zhì)含量一般占干重的14.6%～21.81%，是很好的蛋白質(zhì)來源［1－3］。其組分中的藻藍(lán)蛋白（PC），不僅可作為食品著色劑和熒光探針，同時對于自由基的清除和特異性免疫功能的提高也有促進(jìn)作用，有較大的應(yīng)用價值［4，5］。地木耳蛋白質(zhì)中氨基酸結(jié)構(gòu)比例與人體需要量相近，長期食用可提高機(jī)體免疫力［6，7］。傳統(tǒng)的地木耳蛋白質(zhì)提取方法主要有溶劑法和堿法，但因存在提取溶劑不易去除、提取率低和生產(chǎn)成本較高等缺點(diǎn)［8－10］，使得地木耳中的蛋白質(zhì)尚未被充分開發(fā)利用。

從顯微結(jié)構(gòu)看，地木耳部分藻絲存在膠鞘包裹、細(xì)胞壁成分復(fù)雜、破壁難度較大［11］等問題。而地木耳中蛋白質(zhì)主要存在于胞內(nèi)，因此提取關(guān)鍵技術(shù)在于破壁［5］。有研究［12］采用溶菌酶添加少量纖維素酶和果膠酶進(jìn)行原核藻類處理，破壁效果較好。同時一些蛋白質(zhì)或多糖提取的研究［13－15］表明，采用酶解方法，再結(jié)合反復(fù)凍融溫和破壁，可避免高溫對原料造成營養(yǎng)損失等不良影響。另有研究［16－21］采用超聲波輔助處理藻類或其他植物原料，利用其產(chǎn)生的空化及機(jī)械作用加速細(xì)胞壁的破碎，促進(jìn)蛋白質(zhì)溶出，提高蛋白質(zhì)提取效率。

基于以上眾多研究成果可以發(fā)現(xiàn)，整合酶解、凍融以及超聲波輔助法進(jìn)行植物原料的細(xì)胞破碎將是一種很好的地木耳蛋白質(zhì)提取優(yōu)化思路。本研究擬以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)，結(jié)合酶解、凍融和超聲波法進(jìn)行細(xì)胞破碎，探究地木耳蛋白質(zhì)的提取條件，并通過響應(yīng)面法對提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，旨在為地木耳蛋白質(zhì)的進(jìn)一步開發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

地木耳片：山西汾陽市迅達(dá)土特產(chǎn)品有限責(zé)任公司；

牛血清白蛋白（BSA）：生物試劑，美國Amresco公司；

考馬氏亮藍(lán)G-250：生物試劑，天津市博迪化工有限公司；

果膠酶：活力單位＞10kU/g solid，上海伊卡生物技術(shù)有限公司；

纖維素酶：活力單位為10kU/g solid，上海伊卡生物技術(shù)有限公司；

溶菌酶：活力單位＞20kU/mg，上海前塵生物科技有限公司；

液氮：中科院半導(dǎo)體研究所；

磷酸、乙醇：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

凱氏定氮儀：KDY-9830型，北京市通潤源機(jī)電技術(shù)有限責(zé)任公司；

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：JAC-IV型，濟(jì)寧市奧波超聲波電氣有限公司；

低速離心機(jī)：LD4-2型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；

數(shù)顯溫控儀：XMTB型，余姚市東方電工儀器廠；

紫外可見分光光度計(jì)：725型，上海美譜達(dá)儀器有限公司；

臺式恒溫振蕩器：TS-100B型，上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；

電子天平：FA2004-N型，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 地木耳蛋白質(zhì)提取工藝

地木耳干片→粉碎→80目過篩→稱量→料液混勻→液氮凍融→組合酶酶解（0.1%溶菌酶、0.05%纖維素酶、0.05%果膠酶，55℃酶解1h）→滅酶（80℃，15min）→超聲波處理→離心分離（4 000r/min，15min）→測定蛋白質(zhì)提取率

1.3.2 地木耳總蛋白含量的測定 根據(jù)GB 5009.5—2010，采用微量凱氏定氮法測定地木耳蛋白質(zhì)的總量。

1.3.3 地木耳的可溶性蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白質(zhì)染色法在595nm處測定可溶性蛋白質(zhì)含量［22］。按式（1）計(jì)算可溶性蛋白質(zhì)提取率：

1.3.4 超聲波破碎條件單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）時間對地木耳蛋白質(zhì)提取率的影響：料液比為1∶30（m∶V），超聲功率600W，超聲時間分別為10，15，20，25，30min，以可溶性蛋白質(zhì)的提取率為指標(biāo)，按1.3.1工藝流程測定所提取地木耳蛋白質(zhì)的提取率。

（2）功率對地木耳蛋白質(zhì)提取率的影響：料液比為1∶30（m∶V），超聲時間25min，超聲功率分別為200，400，600，800，1 000W，以可溶性蛋白質(zhì)的提取率為指標(biāo)，按1.3.1工藝流程測定所提取地木耳蛋白質(zhì)的提取率。

（3）料液比對地木耳蛋白質(zhì)提取率的影響：超聲功率為800W，超聲時間25min，料液比分別為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60（m∶V）。以可溶性蛋白質(zhì)的提取率為指標(biāo)，按1.3.1工藝流程測定所提取地木耳蛋白質(zhì)的提取率。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析方法 利用Design-Expert 8.0.5軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲得數(shù)學(xué)模型，對響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析、方差分析，用F檢驗(yàn)判定回歸方程中各變量對響應(yīng)值影響的顯著性，得出超聲波各因素對蛋白質(zhì)提取率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取時間對蛋白質(zhì)含量的影響 由圖1可知，在2 5min前，隨著時間的延長，溶液中的可溶性蛋白含量不斷增加，說明地木耳細(xì)胞壁在超聲波的反復(fù)作用下出現(xiàn)明顯破損，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)被釋放出來，蛋白質(zhì)肽鏈間被破壞的二硫鍵的量不斷增大，直到2 5min時，達(dá)到飽和；當(dāng)提取時間超過25min后，溶液中蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)降低的趨勢，這可能是因?yàn)殡S著時間的延長，產(chǎn)生的熱量過多，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性降低，引起蛋白質(zhì)分解。綜上分析可得，較佳的提取時間為25min。

圖1 提取時間對蛋白提取率的影響Figure 1 Effect of extraction time on protein content

2.1.2 提取功率對蛋白質(zhì)含量的影響 由圖2可知，在8 00W前，隨著提取功率的增長，超聲波振動空化、機(jī)械粉碎、攪拌等作用，使組織中的細(xì)胞破裂，利于溶劑滲透到細(xì)胞內(nèi)，蛋白質(zhì)含量逐漸增加。當(dāng)提取功率超過8 00W，由于超聲提取功率過大，溫度迅速升高會破壞蛋白質(zhì)，從而影響蛋白質(zhì)提取率，使得溶液中蛋白質(zhì)含量逐漸降低。綜上可得，較佳的提取功率為800W。

圖2 超聲功率對蛋白質(zhì)提取率的影響Figure 2 Effect of ultrasonic power on protein content

2.1.3 料液比的影響 料液比越大，即溶劑體積越大，則溶劑中可以容納的有效成分越多。料液比對蛋白質(zhì)提取的影響見圖3，當(dāng)料液比達(dá)到1∶40（m∶V）時，蛋白質(zhì)含量不再繼續(xù)提高，說明此時地木耳蛋白質(zhì)中肽鏈間被破壞的二硫鍵的量達(dá)到最大。再增加水量，不能顯著破壞肽鏈間的二硫鍵，溶液中蛋白質(zhì)含量無明顯變化，隨著所加水量增加到一定程度，濃度過小使得摩擦破碎不完全，蛋白質(zhì)濃度反而降低［23］。由圖3可知，料液比1∶40（m∶V）為最佳條件。

圖3 料液比對蛋白質(zhì)提取率的影響Figure 3 Effect of ratio of material to liquid on protein content

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取時間、功率和料液比3個因素作試驗(yàn)因素，以蛋白質(zhì)提取率為響應(yīng)值，借助Design-Expert 8.0.5Trial軟件對提取條件進(jìn)行分析優(yōu)化，試驗(yàn)因素及水平見表1。

2.2.2 地木耳優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 地木耳優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

表2 地木耳提取優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Optimization of fermentation conditions design and results of experimental design

2.2.3 模型的建立與顯著性檢驗(yàn) 通過Design-Expert 8.0.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得蛋白質(zhì)提取率（Y）對自變量時間、功率、料液比的多元回歸方程：

對該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

由表3可知，模型P＜0.01，失擬項(xiàng)P＝0.620 7＞0.05，說明該模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，殘差主要由隨機(jī)誤差引起；同時復(fù)相關(guān)系數(shù)R2＝0.927 8，Radj2＝0.834 9，說明該模型對試驗(yàn)的擬合情況良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著。由此可得，應(yīng)用該回歸方程分析和預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果具有可行性［24］。

分析表3可得出，交互項(xiàng)AB、BC與二次項(xiàng)A2、C2均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。另外，通過F值的大小，可以推斷在選定的試驗(yàn)范圍內(nèi)各因素對試驗(yàn)結(jié)果的重要性，F(xiàn)值越大，其重要性越大［25］，在所選的各因素范圍內(nèi)，各因素對結(jié)果的影響大小順序?yàn)椋汗β剩緯r間＞料液比。

2.2.4 最優(yōu)酶解參數(shù)的確定 Design-expert 8.0.5軟件的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)分析優(yōu)化結(jié)果見圖4～6。

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 Test result of regression analysis

圖4 提取時間超聲功率對地木耳蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)面圖Figure 4 The response surface figure about the effect of extraction time and ultrasonic poweron protein content

圖5 超聲功率料液比對地木耳蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)面圖Figure 5 The response surface figure about the effect of ultrasonic power and ratio of material to liquid on protein content

圖6 提取時間料液比對地木耳蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)面圖Figure 6 The response surface figure about the effect extraction time and ratio of material to liquid on protein content

由圖4可知，料液比固定在零水平的條件下，蛋白質(zhì)的提取率隨時間的增大先提高后降低。前期地木耳蛋白質(zhì)提取率的增加可能是因?yàn)槌暡ㄒ坏┡c體系組分接觸，即刻產(chǎn)生空化效應(yīng)，地木耳細(xì)胞壁得到充分破碎，從而使得蛋白質(zhì)分子的溶出能力增加。而超聲時間和超聲功率增加到一定的數(shù)值時，蛋白質(zhì)的某些次級鍵受到破壞而變性，從而使得蛋白質(zhì)的溶解度下降。此等高線是橢圓型的，但是并不密集，可說明超聲時間和超聲功率交互作用顯著。

由圖5可知，時間固定在零水平的條件下，增加料液比會使蛋白質(zhì)的提取率先增加后降低，增加超聲功率使提取率緩慢增加。等高線逐漸靠近并呈現(xiàn)橢圓，這說明料液比和功率的交互作用顯著。由圖6可知，功率固定在零水平的條件下，地木耳蛋白質(zhì)提取率隨著料液比和超聲時間的增加呈現(xiàn)的是先增加后降低的趨勢，并且料液比增加的幅度大于超聲時間增加引起的幅度。料液比過大，會使得溶液濃度過小，超聲產(chǎn)生的機(jī)械作用不能均勻地作用于地木耳細(xì)胞，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)提取率的降低。二者等高線是圓形的，可說明超聲時間和料液比交互作用并不明顯。

2.2.5 最佳提取工藝的確定及模型驗(yàn)證 借助分析軟件可直接得出最優(yōu)提取工藝為：時間27.49min、功率1 000W、料液比1∶41.93（m∶V），最佳提取率為17.85%。但從試驗(yàn)的可行性考慮，將最優(yōu)工藝調(diào)整為：時間27.5min、功率1 000W、料液比1∶42（m∶V）。為了驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的準(zhǔn)確性，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得實(shí)際蛋白質(zhì)平均提取率為17.24%，相對偏差3.41%。由此可說明，響應(yīng)面法所優(yōu)化的總蛋白提取條件與實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果相近，參考作用與試驗(yàn)價值較高。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用酶解、凍融及超聲法聯(lián)合處理地木耳材料的方法，并對影響地木耳蛋白質(zhì)提取率的因素：時間、功率及料液比進(jìn)行了研究，在此基礎(chǔ)上利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和響應(yīng)面分析建立了回歸方程。由F檢驗(yàn)得到因子貢獻(xiàn)率為功率＞時間＞料液比。通過Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面法建立三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，得到最優(yōu)條件為：時間27.5min、功率1 000W和料液比1∶42（m∶V），此工藝下的提取率為17.24%，通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了該模型的可行性，對地木耳蛋白的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了良好的基礎(chǔ)。本研究下一步擬在抗氧化活性等方面對本法提取的地木耳蛋白質(zhì)進(jìn)行探究，以期為地木耳蛋白質(zhì)在功能性食品開發(fā)等應(yīng)用中起到推動作用。

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