腎茶水提取物對(duì)大鼠腺嘌呤腎功能衰竭模型的腎功能影響

張少貴，黃榮桂，鄭興中

2.福建醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院腎臟病研究室，泉州362000

慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）是一組進(jìn)行性腎單位毀損，從而使腎臟的排泄功能、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定功能和內(nèi)分泌功能紊亂為特征的臨床綜合群。透析和腎臟移植是治療該病的重要手段，但受治療費(fèi)用及其他因素限制。因此，非透析療法特別是中藥治療CRF已為國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)專家所重視。本研究采用腺嘌呤灌胃法建立大鼠CRF模型，觀察腎茶對(duì)CRF大鼠尿液尿酸、血清肌酐（creatinine，Cr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和腎小球?yàn)V過率（glomerular filtration rate，GFR）及對(duì)腎臟病理學(xué)改變的影響，探討腎茶水提取物對(duì)腺嘌呤致CRF大鼠的腎臟保護(hù)作用及其可能的機(jī)制，為中西醫(yī)結(jié)合防治、延緩CRF提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量200～220g[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2013－0005]。

1.1.2 藥物腎茶[Clerodendranthusspicatus（Thunb.）C.Y.Wu ex H.W.Li]藥材又名貓須草，購(gòu)自泉州市醫(yī)藥分公司，產(chǎn)地福建同安，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院金琪漾教授鑒定，為唇形科腎茶屬多年生草本植物。取腎茶粗粉150g加蒸餾水10倍量，浸泡1h后，在70℃水浴提取2h后，濾過，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮制成劑量1mL相當(dāng)于1g生藥的腎茶水提取物供用。嚴(yán)格按照提取操作規(guī)程，保證藥物質(zhì)量穩(wěn)定。尿毒清顆粒沖劑（批號(hào)20130904，廣州康臣藥業(yè)有限公司）。

1.1.3 試劑 腺嘌呤（河南新鄉(xiāng)拓新生化科技有限公司），蒽酮、菊粉（美國(guó)Sigma公司），尿酸、BUN、Cr及MDA等測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所），兔抗堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）試劑盒（福州一冠生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模、給藥途徑 SD大鼠40只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為5組，由于預(yù)試驗(yàn)正常大鼠各項(xiàng)指標(biāo)穩(wěn)定，故安排5只為正常對(duì)照組。即正常對(duì)照組（n＝5），模型對(duì)照組（n＝8），腎茶低劑量組 （n＝8），腎茶高劑量組（n＝8），陽性對(duì)照組（即尿毒清組，n＝8）。除正常對(duì)照組等體積蒸餾水灌胃，其他各組按200mg／kg體質(zhì)量腺嘌呤灌胃造模逐漸誘發(fā)CRF。除正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積蒸餾水灌胃外，各治療組相應(yīng)予腎茶2.5、5.0g·kg－1·d－1、尿毒清1.81g·kg－1·d－1灌胃，均連續(xù)給藥4周。治療17d將大鼠放入代謝籠中，收集8h尿液，測(cè)尿酸含量，4周后采血，測(cè)定GFR，并處死大鼠，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。

1.2.2 主要觀察指標(biāo) （1）測(cè)定尿液尿酸含量；（2）治療4周后，大鼠戊巴比妥鈉溶液麻醉，經(jīng)股動(dòng)脈采血，測(cè)定血清BUN、Cr和MDA，均按試劑盒操作步驟分別測(cè)定；（3）測(cè)定GFR，采用蒽酮法測(cè)定菊糖含量，用注射器從股動(dòng)脈取血，不保留動(dòng)脈插管，避免取微量血時(shí)插管存在死腔，影響血樣品[1]；（4）病理組織學(xué)檢查：中性10%福爾馬林溶液固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋，常規(guī)H－E染色，光鏡觀察；（5）免疫組織化學(xué)檢測(cè)：石蠟切片常規(guī)脫蠟入水，高壓抗原修復(fù)（bFGF），3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗（1∶160）和二抗（1∶320），DAB顯色，鏡下觀察。在高倍鏡（×200）下隨機(jī)選擇20個(gè)腎小球和20個(gè)視野腎小管－間質(zhì)，根據(jù)染色面積和強(qiáng)度進(jìn)行半定量評(píng)分。染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)：基本不著色者0分，著色淡者1分，適中者2分，深者3分；染色面積標(biāo)準(zhǔn)：無染色或微弱染色為0，染色面積＜25%為1，25%～50%為2，50%～75%為3，＞75%為4。兩者得分相加為最終值。

2 結(jié) 果

2.1 治療第17d尿尿酸水平 造模第17d，各組尿尿酸水平見表1，其中模型對(duì)照組較正常對(duì)照組顯著減少（P＜0.01），腎茶高劑量組較模型對(duì)照組及腎茶低劑量組顯著增加（P＜0.01）。

2.2 治療4周血清Cr、BUN水平 腎茶各劑量治療組血Cr、BUN值顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.01，表1）。

2.3 治療4周菊粉清除率和血清MDA含量 腎茶高劑量組腎菊粉清除率明顯高于模型對(duì)照組（P＜0.05）。腎茶各劑量治療組血清 MDA含量顯著低于模型對(duì)照組（P＜0.05，表1）。

表1 治療4周各組血清肌酐、尿素氮、菊粉清除率和血清MDA含量比較Tab 1 The effects of C.Spicatus on Scr，BUN，the inulin clearance rate and the MDA

2.4 腎臟病理學(xué)觀察 光鏡：腎茶高劑量組大鼠腎代償性增大較模型對(duì)照組減輕，呈蚤咬腎狀，模型對(duì)照組呈大白腎狀。與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組光鏡下見區(qū)域性腎單位萎縮、消失，腎小球腫脹明顯，腎小管破壞嚴(yán)重，部分破壞消失或極度擴(kuò)張和萎縮，腎間質(zhì)及腎小管內(nèi)見大量尿酸結(jié)晶沉積；間質(zhì)內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，伴纖維增生、肉芽形成；腎茶高劑量組腎單位萎縮、消失、纖維增生面積較小，腎小球輕度腫脹，腎小管擴(kuò)張和萎縮較小，管腔中尿酸結(jié)晶沉積較少，近曲及遠(yuǎn)曲小管壞死程度減輕，可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。腎茶低劑量組與尿毒清組均有一定的改善（圖1）。

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果：bFGF在正常對(duì)照組腎小管及腎間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較少；在模型對(duì)照組腎小管及腎間質(zhì)細(xì)胞中bFGF的表達(dá)明顯增加（P＜0.01）；而在腎茶高劑量組上述增加的表達(dá)受到明顯抑制（P＜0.05，圖2，3）。

3 討 論

腎茶又名貓須草，其主要活性成分有迷迭香酸（RsA）、熊果酸，其他有黃酮、香豆素、三萜類化合物及肌醇等200多種化合物。藥理作用主要有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗凝、抗感染、利尿等。近年來已有應(yīng)用單味腎茶及其復(fù)方制劑治療慢性腎炎及腎功能不全的實(shí)驗(yàn)和臨床研究報(bào)道[2－3]。本研究發(fā)現(xiàn)，第17d腎茶治療組能增加CRF模型大鼠尿酸排泄，4周后降低血清BUN、Cr及MDA含量，改善腎臟組織病理異常。因此，腎茶能提高大鼠機(jī)體的抗氧化能力，減輕自由基對(duì)腎小球的損傷和腎臟組織病理異常，具有明顯改善CRF大鼠腎功能的作用。

文獻(xiàn)報(bào)道，RsA是較強(qiáng)的黃嘌呤氧化酶抑制劑，RsA類似物咖啡酸也有較強(qiáng)的黃嘌呤氧化酶抑制作用[4]。而黃嘌呤氧化酶是嘌呤轉(zhuǎn)變成尿酸過程中的關(guān)鍵酶。RsA可通過黃嘌呤氧化酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用減少嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩幔瑴p輕其在腎小管的沉積，改善腎臟對(duì)體內(nèi)尿酸的排泄。腎茶還具有利尿作用，使尿液尿酸排泄增多[5－6]。本研究以菊粉清除率為指標(biāo)顯示，高劑量腎茶治療可以改善GFR和降低血清Cr、BUN，改善腎功能。

圖1 腎臟H－E染色病理學(xué)改變（ ×100）Fig 1 The histopathology of the renal constitution examined（H－E ×100）

圖2 bFGF免疫組織化學(xué)表達(dá)Fig 2 The expression of bFGF in the kidneys

圖3 各組腎組織bFGF蛋白表達(dá)Fig 3 The expressiong of bFGF in the kidneys

CRF時(shí)測(cè)定MDA含量?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[7]。腎茶抗氧化的主要活性成分為 RsA[8]，可與不飽和脂肪酸競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合脂質(zhì)過氧化物，終止脂質(zhì)過氧化的連鎖反應(yīng)。研究表明，RsA能清除過量活性氧自由基，抑制iNOS和COX－2的表達(dá)，從而減少NO和PEG2的產(chǎn)生，具有很強(qiáng)的抗氧化作用[9－11]。近年來，有研究報(bào)道，腎茶及其主要成分RsA能有效抑制糖尿病腎病大鼠腎組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，抑制其氧化損傷過程[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，腎茶能有效地減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，抑制CRF的進(jìn)展。

研究表明，bFGF可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增生和膠原纖維合成[13]。而成纖維細(xì)胞是腎間質(zhì)纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，在腎間質(zhì)纖維化中起重要作用[14]。在CRF患者腎間質(zhì)單核細(xì)胞和小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中，bFGF表達(dá)明顯增強(qiáng)。本研究顯示，高劑量腎茶治療可減少腎臟組織bFGF的表達(dá)，延緩、減輕腎臟組織纖維化的程度。

2011年，Mohamed等對(duì)腎茶標(biāo)準(zhǔn)化的50%乙醇提取物進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)，大鼠單劑量5 000mg·kg－1·d－1灌胃，觀察14d，未見毒性反應(yīng)及死亡；亞急性毒性試驗(yàn)，大鼠以5 000mg·kg－1·d－1劑量灌胃，連續(xù)28d，給藥組與對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)比較，均無明顯差別[15]。Muhammad等用沙門氏菌微粒體試驗(yàn)和小鼠骨髓微核測(cè)試均證明，腎茶水提取物不會(huì)致突變，不構(gòu)成基因毒性風(fēng)險(xiǎn)[16]。因此腎茶水提取物毒性小，使用安全，特別適用于健腎、改善腎功能。本研究為腎茶進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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