腎茶水提取物對大鼠腺嘌呤腎功能衰竭模型的腎功能影響

張少貴，黃榮桂，鄭興中

2.福建醫(yī)科大學 附屬第二醫(yī)院腎臟病研究室，泉州362000

慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）是一組進行性腎單位毀損，從而使腎臟的排泄功能、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定功能和內(nèi)分泌功能紊亂為特征的臨床綜合群。透析和腎臟移植是治療該病的重要手段，但受治療費用及其他因素限制。因此，非透析療法特別是中藥治療CRF已為國內(nèi)外醫(yī)學專家所重視。本研究采用腺嘌呤灌胃法建立大鼠CRF模型，觀察腎茶對CRF大鼠尿液尿酸、血清肌酐（creatinine，Cr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和腎小球濾過率（glomerular filtration rate，GFR）及對腎臟病理學改變的影響，探討腎茶水提取物對腺嘌呤致CRF大鼠的腎臟保護作用及其可能的機制，為中西醫(yī)結(jié)合防治、延緩CRF提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量200～220g[上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2013－0005]。

1.1.2 藥物腎茶[Clerodendranthusspicatus（Thunb.）C.Y.Wu ex H.W.Li]藥材又名貓須草，購自泉州市醫(yī)藥分公司，產(chǎn)地福建同安，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學藥學院金琪漾教授鑒定，為唇形科腎茶屬多年生草本植物。取腎茶粗粉150g加蒸餾水10倍量，浸泡1h后，在70℃水浴提取2h后，濾過，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮制成劑量1mL相當于1g生藥的腎茶水提取物供用。嚴格按照提取操作規(guī)程，保證藥物質(zhì)量穩(wěn)定。尿毒清顆粒沖劑（批號20130904，廣州康臣藥業(yè)有限公司）。

1.1.3 試劑 腺嘌呤（河南新鄉(xiāng)拓新生化科技有限公司），蒽酮、菊粉（美國Sigma公司），尿酸、BUN、Cr及MDA等測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），兔抗堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）試劑盒（福州一冠生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模、給藥途徑 SD大鼠40只適應性飼養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量分層隨機分為5組，由于預試驗正常大鼠各項指標穩(wěn)定，故安排5只為正常對照組。即正常對照組（n＝5），模型對照組（n＝8），腎茶低劑量組 （n＝8），腎茶高劑量組（n＝8），陽性對照組（即尿毒清組，n＝8）。除正常對照組等體積蒸餾水灌胃，其他各組按200mg／kg體質(zhì)量腺嘌呤灌胃造模逐漸誘發(fā)CRF。除正常對照組和模型對照組給予等體積蒸餾水灌胃外，各治療組相應予腎茶2.5、5.0g·kg－1·d－1、尿毒清1.81g·kg－1·d－1灌胃，均連續(xù)給藥4周。治療17d將大鼠放入代謝籠中，收集8h尿液，測尿酸含量，4周后采血，測定GFR，并處死大鼠，進行各項指標測定。

1.2.2 主要觀察指標 （1）測定尿液尿酸含量；（2）治療4周后，大鼠戊巴比妥鈉溶液麻醉，經(jīng)股動脈采血，測定血清BUN、Cr和MDA，均按試劑盒操作步驟分別測定；（3）測定GFR，采用蒽酮法測定菊糖含量，用注射器從股動脈取血，不保留動脈插管，避免取微量血時插管存在死腔，影響血樣品[1]；（4）病理組織學檢查：中性10%福爾馬林溶液固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋，常規(guī)H－E染色，光鏡觀察；（5）免疫組織化學檢測：石蠟切片常規(guī)脫蠟入水，高壓抗原修復（bFGF），3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶，滴加適當比例稀釋的一抗（1∶160）和二抗（1∶320），DAB顯色，鏡下觀察。在高倍鏡（×200）下隨機選擇20個腎小球和20個視野腎小管－間質(zhì)，根據(jù)染色面積和強度進行半定量評分。染色強度標準：基本不著色者0分，著色淡者1分，適中者2分，深者3分；染色面積標準：無染色或微弱染色為0，染色面積＜25%為1，25%～50%為2，50%～75%為3，＞75%為4。兩者得分相加為最終值。

2 結(jié) 果

2.1 治療第17d尿尿酸水平 造模第17d，各組尿尿酸水平見表1，其中模型對照組較正常對照組顯著減少（P＜0.01），腎茶高劑量組較模型對照組及腎茶低劑量組顯著增加（P＜0.01）。

2.2 治療4周血清Cr、BUN水平 腎茶各劑量治療組血Cr、BUN值顯著低于模型對照組（P＜0.01，表1）。

2.3 治療4周菊粉清除率和血清MDA含量 腎茶高劑量組腎菊粉清除率明顯高于模型對照組（P＜0.05）。腎茶各劑量治療組血清 MDA含量顯著低于模型對照組（P＜0.05，表1）。

表1 治療4周各組血清肌酐、尿素氮、菊粉清除率和血清MDA含量比較Tab 1 The effects of C.Spicatus on Scr，BUN，the inulin clearance rate and the MDA

2.4 腎臟病理學觀察 光鏡：腎茶高劑量組大鼠腎代償性增大較模型對照組減輕，呈蚤咬腎狀，模型對照組呈大白腎狀。與正常對照組相比，模型對照組光鏡下見區(qū)域性腎單位萎縮、消失，腎小球腫脹明顯，腎小管破壞嚴重，部分破壞消失或極度擴張和萎縮，腎間質(zhì)及腎小管內(nèi)見大量尿酸結(jié)晶沉積；間質(zhì)內(nèi)有大量炎癥細胞浸潤，伴纖維增生、肉芽形成；腎茶高劑量組腎單位萎縮、消失、纖維增生面積較小，腎小球輕度腫脹，腎小管擴張和萎縮較小，管腔中尿酸結(jié)晶沉積較少，近曲及遠曲小管壞死程度減輕，可見少量炎癥細胞浸潤。腎茶低劑量組與尿毒清組均有一定的改善（圖1）。

免疫組織化學檢測結(jié)果：bFGF在正常對照組腎小管及腎間質(zhì)細胞中表達較少；在模型對照組腎小管及腎間質(zhì)細胞中bFGF的表達明顯增加（P＜0.01）；而在腎茶高劑量組上述增加的表達受到明顯抑制（P＜0.05，圖2，3）。

3 討 論

腎茶又名貓須草，其主要活性成分有迷迭香酸（RsA）、熊果酸，其他有黃酮、香豆素、三萜類化合物及肌醇等200多種化合物。藥理作用主要有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗凝、抗感染、利尿等。近年來已有應用單味腎茶及其復方制劑治療慢性腎炎及腎功能不全的實驗和臨床研究報道[2－3]。本研究發(fā)現(xiàn)，第17d腎茶治療組能增加CRF模型大鼠尿酸排泄，4周后降低血清BUN、Cr及MDA含量，改善腎臟組織病理異常。因此，腎茶能提高大鼠機體的抗氧化能力，減輕自由基對腎小球的損傷和腎臟組織病理異常，具有明顯改善CRF大鼠腎功能的作用。

文獻報道，RsA是較強的黃嘌呤氧化酶抑制劑，RsA類似物咖啡酸也有較強的黃嘌呤氧化酶抑制作用[4]。而黃嘌呤氧化酶是嘌呤轉(zhuǎn)變成尿酸過程中的關(guān)鍵酶。RsA可通過黃嘌呤氧化酶的競爭性抑制作用減少嘌呤轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩幔瑴p輕其在腎小管的沉積，改善腎臟對體內(nèi)尿酸的排泄。腎茶還具有利尿作用，使尿液尿酸排泄增多[5－6]。本研究以菊粉清除率為指標顯示，高劑量腎茶治療可以改善GFR和降低血清Cr、BUN，改善腎功能。

圖1 腎臟H－E染色病理學改變（ ×100）Fig 1 The histopathology of the renal constitution examined（H－E ×100）

圖2 bFGF免疫組織化學表達Fig 2 The expression of bFGF in the kidneys

圖3 各組腎組織bFGF蛋白表達Fig 3 The expressiong of bFGF in the kidneys

CRF時測定MDA含量?？煞从硻C體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映細胞受自由基攻擊的嚴重程度[7]。腎茶抗氧化的主要活性成分為 RsA[8]，可與不飽和脂肪酸競爭性結(jié)合脂質(zhì)過氧化物，終止脂質(zhì)過氧化的連鎖反應。研究表明，RsA能清除過量活性氧自由基，抑制iNOS和COX－2的表達，從而減少NO和PEG2的產(chǎn)生，具有很強的抗氧化作用[9－11]。近年來，有研究報道，腎茶及其主要成分RsA能有效抑制糖尿病腎病大鼠腎組織脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，抑制其氧化損傷過程[12]。本實驗結(jié)果也顯示，腎茶能有效地減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，抑制CRF的進展。

研究表明，bFGF可以促進成纖維細胞增生和膠原纖維合成[13]。而成纖維細胞是腎間質(zhì)纖維化的主要效應細胞，在腎間質(zhì)纖維化中起重要作用[14]。在CRF患者腎間質(zhì)單核細胞和小管上皮細胞胞質(zhì)中，bFGF表達明顯增強。本研究顯示，高劑量腎茶治療可減少腎臟組織bFGF的表達，延緩、減輕腎臟組織纖維化的程度。

2011年，Mohamed等對腎茶標準化的50%乙醇提取物進行毒性評價，大鼠單劑量5 000mg·kg－1·d－1灌胃，觀察14d，未見毒性反應及死亡；亞急性毒性試驗，大鼠以5 000mg·kg－1·d－1劑量灌胃，連續(xù)28d，給藥組與對照組各項指標比較，均無明顯差別[15]。Muhammad等用沙門氏菌微粒體試驗和小鼠骨髓微核測試均證明，腎茶水提取物不會致突變，不構(gòu)成基因毒性風險[16]。因此腎茶水提取物毒性小，使用安全，特別適用于健腎、改善腎功能。本研究為腎茶進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

[1]Huang W C，Wu J N.Blunted renal responses to atrial natriuretic peptide and its reversal by unclipping in one－kidney，one clip Goldblant hypertensive rats[J].JHypertension，1997，15（2）：181－189.

[2]謝麗萍，向彩春，史 偉，等.貓須草治療慢性腎小球腎炎蛋白尿43例臨床研究[J].江蘇中醫(yī)，2012，44（2）：21.

[3]王立強，盂萍萍，智 利，等.腎茶提取物防治大鼠慢性腎功能衰竭的實驗研究[J].中國醫(yī)藥科學，2011，1（1）：33－35.

[4]尚雁君，黃才國，蔣三好，等.迷迭香酸對黃嘌呤氧化酶的抑制作用[J].第二軍醫(yī)大學學報，2006，27（2）：191.

[5]Yuliana N D，Khatib A，Link－Struensee A M，etal.Adenosine Al receptor binding activity of methoxy flavonoids from Orthosiphon stamineus[J].PlantaMed，2009，75（2）：132－136.

[6]黃榮桂，沈文通，鄭興中，等.腎茶對尿路結(jié)石的治療作用[J].福建醫(yī)科大學學報，1999，33（4）：402－405.

[7]Templar J，Kon S P，Milligan T P，etal.Increased plasma malodialdehyde levels in glomerular disease as determined by a fully validated HPLC method[J].NephrolDialTransplant，1999，14（4）：946.

[8]劉耕陶.丹參的7種酚類成分對生物膜過氧化損傷的保護作用[J].中國藥理學與毒理學雜志，1992，6（1）：77.

[9]Yoshimasa Nakamura，Yoshimi Ohto，Akira Murakami.Superoxide scavenging activity of roismarinic acid from perilla frutescens britton Var.acuta f.viridis[J].JAgricFood Chem，1998，46（11）：4545－4550.

[10]Kelm M A，Nair M G，Strasburg G M，etal.Antioxidant and cyclooxygennase inhibitory phenolic compounds from Ocimum santum Linn[J].Phytomedicine，2000，7（1）：7－13.

[11]Hsu C L，Hong B H，Yu Y S，etal.Antioxidant and antiinflammatory effects of orthosiphon aristatus and its bioactive compounds[J].JAgricFoodChem，2010，58（4）：2150－2156.

[12]劉廣建，黃榮桂，鄭興中，等.腎茶對糖尿病大鼠腎臟的保護作用及其機制研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2007，8（1）：32－34.

[13]韋 穎，樊均明，潘麗萍，等.堿性成纖維細胞生長因子對人腎成纖維細胞的影響[J].中華腎病雜志，2002，18（2）：135－136.

[14]Jocks T，Zahner G，F(xiàn)reudenberg J，etal.Prostaglandin Elreduces the glomerular mRNA expression of monocytechemoattractant protein－1in anti－thymocyte antibody－induced glomerular injury[J].JAmSocNephro，1996，7：897－905.

[15]Mohamed E A，Lim C P，Ebrika O S，etal.Toxicity evaluation of a standardised 50%ethanol extract ofOrthosiphon stamineus[J].JEthnopharmacol，2011，133（2）：358－363.

[16]Muhammad H，Gomes－Carneiro M R，Poca K S，etal.Evaluation of the genotoxicity of Orthosiphon stamineus aqueous extract[J].JEthnopharmacol，2011，133（2）：647－653.