復(fù)發(fā)性口腔潰瘍大鼠模型免疫功能與血清因子的變化分析＊

西安醫(yī)學院口腔醫(yī)學系口腔修復(fù)正畸學教研室 （西安710021）

周 芳 李 東▲ 王丹楊△ 郭 娜＃ 王 琳＃ 左艷萍

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍是臨床上常見的口腔黏膜病。復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的誘因主要為局部創(chuàng)傷、精神緊張、食物、藥物、激素水平改變等，而感染因素、系統(tǒng)性疾病因素及環(huán)境因素等對復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)生發(fā)展起到重要作用［1，2］。對于免疫因素來說，復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者存在細胞免疫功能下降和T淋巴細胞亞群失衡，表明人類復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)生與自身免疫相關(guān)［3］。血清因子是影響患者機體狀況的重要因素，其中血清氧自由基在復(fù)發(fā)性口腔潰瘍活動期及恢復(fù)期的發(fā)生中有重要作用。但這些細胞因子及免疫系統(tǒng)在復(fù)發(fā)性口腔潰瘍中的作用及機制目前尚處在探索階段。本文為此通過動物實驗分析了復(fù)發(fā)性口腔潰瘍大鼠模型免疫功能與血清因子的變化，希望為分析復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)生與發(fā)展機制提供參考。

材料與方法

1 實驗材料 SD清潔級大鼠60只，雄性30只，雌性30只，體重180～200g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX）和丙二醛（MDA）等試劑盒來自南京建成生物工程研究所，完全費氏佐劑來自美國Sigma公司，生理鹽水、PBS緩沖液、蒸餾水、無水乙醇、二甲苯等來自本實驗室；兔抗鼠CD4單克隆抗體和兔抗鼠CD8單克隆抗體來自美國Beckman Coulter公司；左旋咪唑來自武漢合中化工制造有限公司。

2 實驗設(shè)備 高速離心機由北京京立離心機有限公司生產(chǎn)、組織勻漿器由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)、流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司、可見光分光光度計購自上海精密科學儀器有限公司、生物組織石蠟切片機購自沈陽譽德電子儀器有限公司。

3 實驗方法

3．1 動物分組：將60只SD清潔級大鼠隨機均分為正常對照組、模型組及左旋咪唑組3組，每組20只，雌雄平分，體重也為180～200g。所有大鼠同室分籠飼養(yǎng)，嚴格按照動物實驗中心的要求進行操作，飼養(yǎng)1周適應(yīng)實驗室環(huán)境后開始進行實驗。

3．2 動物造模：將大鼠麻醉后剝?nèi)】谇火つぃ尤?．1mol／L，pH7．4的PBS緩沖液制成組織勻漿。免疫動物時，將組織勻漿與弗氏佐劑等比例混合，嚴格按照說明書操作制成抗原乳化劑。將模型組和左旋咪唑組的大鼠脊柱兩側(cè)剪去鼠毛，碘伏消毒后每側(cè)皮下注射0．1ml抗原乳化劑，每周注射1次，注射周期為3次。觀察大鼠口腔黏膜變化，沒有注射抗原大鼠為正常對照組。經(jīng)過觀察，在第3次注射抗原乳化液1周后所有大鼠模型均出現(xiàn)口腔潰瘍，而正常對照組大鼠的口腔則未有明顯的變化。同時手術(shù)刀片切取模型組口腔潰瘍黏膜組織及正常對照組大鼠的口腔黏膜組織，進行病理觀察。

3．3 給藥方法：在口腔潰瘍模型制作完成后進行給藥，正常對照組及模型組大鼠均給予正常飲食水，左旋咪唑組采用20mg／kg劑量灌胃，以上給藥或給誰均每日1次，共治療30d。

3．4 樣本采集：正常對照組和模型組于第3次注射免疫1周后出現(xiàn)口腔潰瘍后采集外周血，于用藥后第30天對左旋咪唑組進行采集。從各組大鼠眼眶采血，常規(guī)抗凝后離心，取上清的血清，裝入高溫已滅菌的EP管，－70℃冰箱中保存待測。

4 觀察指標 密切觀察并記錄模型組及左旋咪唑組大鼠發(fā)生潰瘍的持續(xù)時間、數(shù)目及間隔時間。同時采用直接免疫熒光標記全血溶血法流式細胞儀檢測CD3與CD4的表達情況，采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性，采用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量。

5 統(tǒng)計學方法 采用SAS12．0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)采用±s表示，對比采用LSD－t檢驗，P＜0．05代表差異顯著。

結(jié) 果

1 潰瘍相關(guān)指標對比 經(jīng)過觀察，模型組大鼠發(fā)生口腔潰瘍的數(shù)據(jù)明顯多于左旋咪唑組大鼠發(fā)生潰瘍的數(shù)目，同時潰瘍間隔時間延長、持續(xù)時間縮短，兩組對比差異明顯，有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），見表1。

表1 不同組別潰瘍持續(xù)時間、發(fā)生數(shù)目及間隔時間的變化（±s）

表1 不同組別潰瘍持續(xù)時間、發(fā)生數(shù)目及間隔時間的變化（±s）

注：與對照組相比＊P＜0．05

組 別 n 潰瘍數(shù)目 持續(xù)時間 間隔時間（d）20 19．25±3．12 3．00±0．64 2．05±0．16左旋咪唑組 20 9．63±3．00＊2．21±0．55＊ 8．80±0．20模型組＊

2 T淋巴細胞亞群的變化 經(jīng)過觀察，與對照組相比，模型組的大鼠外周血中的CD4＋細胞比例明顯降低，而左旋咪唑組的大鼠外周血中的CD4＋細胞比例高于模型組，對比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；3組的大鼠外周血中的CD8＋細胞比例對比差異都無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），見表2。

表2 不同組別外周血中T淋巴細胞亞群的變化（%，±s）

表2 不同組別外周血中T淋巴細胞亞群的變化（%，±s）

注：與對照組相比＊P＜0．05，與模型組相比＃P＜0．05

組 別 n CD4＋ CD8＋20 49．50±3．52 19．62±3．40模型組 20 41．43±4．63＊ 17．68±2．36左旋咪唑組 20 55．89±4．00＃對照組20．27±2．99

3 血清因子的變化 經(jīng)過觀察，與對照組相比，模型組的大鼠血清中SOD活性降低，MDA含量升高，對比差異都有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。左旋咪唑組與模型組相比，大鼠血清中SOD活性升高，MDA含量降低，對比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），見表3。

表3 不同組別血清SOD和MDA的變化（±s）

表3 不同組別血清SOD和MDA的變化（±s）

注：與對照組相比＊P＜0．05，與模型組相比＃P＜0．05

組 別 n SOD（U／ml） MDA（nmol／ml）20 328．62±40．58 5．58±0．18模型組 20 230．50±51．23＊ 8．26±0．21＊左旋咪唑組 20 230．25±45．36＃ 8．10±0．19對照組＃

討 論

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍是最常見的口腔黏膜病，臨床表現(xiàn)為口腔黏膜反復(fù)出現(xiàn)孤立的圓形或橢圓形的淺表潰瘍，有自愈性、周期性、復(fù)發(fā)性的特點。其中免疫、遺傳和環(huán)境可能是復(fù)發(fā)性口腔潰瘍發(fā)病的“三聯(lián)因素”［4］。

研究表明復(fù)發(fā)性口腔潰瘍會造成患者的淋巴細胞功能降低及T淋巴細胞亞群失衡，其中T淋巴細胞亞群異常對復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)生發(fā)展有重要作用［5］。其中T淋巴細胞按其功能可分為CD8＋和CD4＋兩個亞群，其中CD8＋為T殺傷－抑制亞群，而CD4＋為T輔助－誘導(dǎo)亞群，當其數(shù)量和功能發(fā)生異常時，機體會發(fā)生免疫紊亂從而導(dǎo)致發(fā)病。有學者研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性口腔潰瘍患者外周血中的CD4＋／CD8＋下降，CD4＋細胞數(shù)量下降，而CD8＋細胞數(shù)量正常，因此細胞免疫功能低下是復(fù)發(fā)性口腔潰瘍發(fā)病和發(fā)展的關(guān)鍵因素之一［6］。本文結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組的大鼠外周血中的CD4＋細胞比例明顯降低，而左旋咪唑組的大鼠外周血中的CD4＋細胞比例高于模型組，對比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；3組的大鼠外周血中的CD8＋細胞比例對比無統(tǒng)計學差異（P＞0．05）。該結(jié)果與之前研究的結(jié)果基本一致，說明本實驗中的動物模型可作為免疫失衡的動物模型。

研究證實，氧自由基可能是連接復(fù)發(fā)性口腔潰瘍各種致病因素的共同樞紐環(huán)節(jié)，氧自由基在體內(nèi)的聚集可降解為MDA，可對細胞中核酸、蛋白質(zhì)及透明質(zhì)酸等產(chǎn)生廣泛的損傷作用。不過人體內(nèi)存在著一套完備的抗氧化防御系統(tǒng)，其中每種抗氧化劑的活性高低都可以間接評價氧自由基的活動?，F(xiàn)代藥理研究表明左旋咪唑具有增強機體免疫力的作用，其可以增強機體的非特異性及特異性免疫功能［7］。且左旋咪唑抗氧化作用很強，可顯著提高小鼠的非特異性免疫能力，且存在一定劑量效應(yīng)。對混合淋巴細胞中的T細胞有增強作用，并能促進大鼠脾細胞分泌相關(guān)白介素細胞因子［8］。本文結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組的大鼠血清中MDA含量升高，SOD活性降低，對比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。而左旋咪唑組與模型組相比，大鼠血清中SOD活性升高，MDA含量降低，對比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。

總之，T淋巴細胞亞群的失衡和血清相關(guān)因子在復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用，左旋咪唑可以有效的治療大鼠復(fù)發(fā)性口腔潰瘍，具體機制在于調(diào)節(jié)免疫功能與細胞因子的變化。

［1］ 房 棟，趙東盈．蒙脫石散與琥珀酸氫化可的松聯(lián)合保留灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎60例［J］．陜西醫(yī)學雜志，2013，42（11）：1558－1559．

［2］ 陳永梅，周作華，趙 穎，等．脂氧素受體激動劑BML－111對左向右分流大鼠肺動脈壓力影響及其機制的研究［J］．陜西醫(yī)學雜志，2013，42（5）：518－520．

［3］ 郎江蓉，武云霞．復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍患者唾液及血清中TNF－α的表達及其相關(guān)性研究［J］．實用口腔醫(yī)學雜志，2010，26（3）：353－355．

［4］ 孫勤國，江 波，崔曉燕，等．口瘍清方對復(fù)發(fā)性口腔潰瘍模型大鼠免疫功能的研究［J］．中西醫(yī)結(jié)合研究，2013，5（2）：66－68．

［5］ 龐世權(quán)，陳 茵，余海清，等．長春瑞濱加醛氫葉酸和大劑量氟尿嘧啶治療晚期三陰性乳腺癌［J］．中國現(xiàn)代醫(yī)生，2013，51（34）：75－76．

［6］ 程 茜，劉建國，郭玉書，等．實驗性SD大鼠ROU模型的建立［J］．臨床口腔醫(yī)學雜志，2008，24（9）：563－565．

［7］ 石展鵬．復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的中醫(yī)治療與研究進展［J］．陜西中醫(yī)，2011，32（2）：247－250．

［8］ 祁 晶，余占海，劉 燕，等．免疫法建立SD大鼠RAU模型［J］．口腔醫(yī)學研究，2010，26（6）：816－819．