紅霉素對生物膜內(nèi)銅綠假單胞菌藥敏的影響＊

西電集團(tuán)醫(yī)院（西安710077） 孫安志 溫紅俠 王曉輝

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P．a(chǎn)）是有引起有基礎(chǔ)病變患者社區(qū)獲得性感染和醫(yī)院獲得性感染的重要條件致病菌。由于P．a(chǎn)易形成生物被膜（Biofilm，BF），因此該感染具有一定的難治性，且易轉(zhuǎn)化為慢性感染，并對危重患者造成了一定的生命威脅。已有多項資料研究證明14、15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素如紅霉素、阿奇霉素等可以抑制和破壞P．a(chǎn) BF的作用，阿奇霉素與其他有抗銅綠假單胞菌活性抗生素有協(xié)同作用。但亦有報道由于阿奇霉素的廣泛使用，導(dǎo)致多重耐藥菌株的產(chǎn)生［1］。但對紅霉素（Erythromycin，EM）長期作用后BF內(nèi)P．a(chǎn)的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)尚未見報道，因此本研究對EM在抑制BF形成的同時，是否影響B(tài)F內(nèi)P．a(chǎn)藥物敏感性進(jìn)行探討。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1 將聚氯乙烯氣管導(dǎo)管（上海景年醫(yī)療器械有限公司）制成1cm×1cm，經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌備用。

1．2 菌株：PAO1由丹麥哥本哈根大學(xué)臨床微生物科提供。質(zhì)控菌株為P．a(chǎn) ATCC 27853，由廣西醫(yī)科大學(xué)一附院臨床實(shí)驗(yàn)中心細(xì)菌室提供。

1．3 主要試劑：EM 標(biāo)準(zhǔn)粉劑（批號：130307－200215）均購自中國藥品生物制品檢驗(yàn)所。LB培養(yǎng)基和戊二醛（Sigma公司）。

2 研究方法

2．1 采用試管二倍稀釋法測定EM對實(shí)驗(yàn)菌的最 低 抑 菌 濃 度 （Minimal inhibitory concentration，MIC）：平行測定質(zhì)控菌株ATCC 27853的 MIC作質(zhì)量控制。

2．2 P．a(chǎn)BF模型的建立：采用文獻(xiàn)［2］方法并改良。將培養(yǎng)過夜的PA01，調(diào)至0．5麥?zhǔn)蠁挝唬儆蒙睇}水1∶200稀釋，每試管加入5ml，每管置入滅菌BF載體1片，37℃培養(yǎng)24h后換液，以后每48h用50%LB換液。

2．3 抑制P．a(chǎn)生物膜形成實(shí)驗(yàn)：分為空白對照組、EM組。開始建模時，加入藥物EM（1／8MIC）。于建模第7d采用連續(xù)稀釋法［2］法行活菌計數(shù)，并于第3d、第7d行生物膜半定量測定，每組2個標(biāo)本，每次測定均重復(fù)測定3次取平均值，另取分別1個標(biāo)本行SEM觀察，以上實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

2．4 BF細(xì)菌藥敏實(shí)驗(yàn)：分別于建模3d和7d，生理鹽水沖洗去掉載體表面浮游菌，載體置于2ml生理鹽水，漩渦震蕩，取生物膜細(xì)菌，然后參照［3］采用Kirby－Bauer（K－B）紙片擴(kuò)散法行阿米卡星、美羅培南、哌拉西林、哌拉西林三唑坦、慶大霉素、舒普深、頭孢吡肟、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢他啶和氨曲南11種抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)。

2．5 SEM觀察BF形成：滅菌生理鹽水沖洗去掉浮游菌后用2．5%戊二醛固定，pH7．4的PBS漂洗3次，依次用50%、70%、80%、90%、100%酒精脫水，真空條件下鍍金粉，SEM觀察。

2．6 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS13．0，藥物抑制P．a(chǎn)形成BF作用的細(xì)菌數(shù)和各藥物組內(nèi)不同作用時間的細(xì)菌存活數(shù)比較用單因素方差分析；P．a(chǎn)早期或成熟BF經(jīng)藥物作用后BF內(nèi)細(xì)菌存活數(shù)比較用重復(fù)測量數(shù)據(jù)方差分析。

結(jié) 果

1 MIC EM 對P．a(chǎn)實(shí)驗(yàn)菌株及質(zhì)控菌株ATCC 27853的 MIC均為128μg／ml。

2 抑制P．a(chǎn) BF形成實(shí)驗(yàn)

2．1 建模3d實(shí)驗(yàn)結(jié)果：SEM觀察觀察，空白對照組可見均勻、密布堆積的稀薄生物膜，可見細(xì)菌輪廓及細(xì)菌間黏液樣物質(zhì)。EM組可見散在的早期BF，分布較空白對照組稀疏。EM組載體表面生物膜半定量和空白對照組比較，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異有顯著性意義（P＜0．01）。提示EM組載體表面形成的生物膜少于空白對照組。

2．2 建模7d后實(shí)驗(yàn)結(jié)果：SEM觀察，空白對照組載體表面可見濃厚黏液樣物質(zhì)，菌體輪廓模糊不清，BF呈立體結(jié)構(gòu)，而EM組僅見稀少的薄層生物膜。載體表面活菌計數(shù)結(jié)果顯示EM組低于空白對照組（P＜0．01）。載體表面生物膜半定量檢測發(fā)現(xiàn)，EM組和空白對照組比較，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異有顯著性（P＜0．01），提示EM組載體表面生物膜少于空白對照組。

3 EM對BF內(nèi)細(xì)菌藥敏影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)EM作用后，對所檢測的抗生素均敏感，但和空白對照組比較，對于早期BF細(xì)菌，環(huán)丙沙星抑菌圈增大（P＜0．05），頭孢他啶和氨曲南抑菌圈亦增大（P＜0．01），見表1。對于晚期BF細(xì)菌，頭孢吡肟、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星抑菌圈直徑明顯小于空白對照組（P＜0．01），而頭孢他啶組明顯增大（P＜0．05），見表2。

表1 紅霉素干預(yù)3d后生物膜細(xì)菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

表1 紅霉素干預(yù)3d后生物膜細(xì)菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

注：△與空白對照組比較，P＜0．01，＊與空白對照組比較，P＜0．05

空白對照組（mm） 紅霉素組（mm）27．0±0．5 27．8±0．4美羅培南 27．1±0．6 27．3±0．7哌拉西林 29．1±0．8 28．9±0．6哌拉西林三唑坦 28．2±0．4 28．2±0．4慶大霉素 25．3±0．5 26．4±0．8舒普深 26．3±1．1 25．6±0．5頭孢吡肟 28．7±0．5 29．2±1．0左氧氟沙星 25．1±0．3 25．7±1．1環(huán)丙沙星 31．9±0．3 33．1±1．1＊頭孢他啶 27．4±0．5 28．3±0．5△氨曲南 24．3±0．5 26±0阿米卡星△

表2 紅霉素干預(yù)7d后生物膜細(xì)菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

表2 紅霉素干預(yù)7d后生物膜細(xì)菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

注：△與空白對照組比較，P＜0．01，＊與空白對照組比較，P＜0．05

空白對照組（mm） 紅霉素組（mm）27．3±0．9 27．6±2．6氨曲南 24．2±0．2 26．3±2．6美羅培南 26．7±0．1 26．2±2．0哌拉西林 28．6±1．9 29．4±1．0哌拉西林三唑坦 28．3±1．6 29．6±1．0慶大霉素 25．9±0．8 27．3±2．4舒普深 26．6±0．9 26．8±1．6頭孢吡肟 28．2±0．7 23．8±0．7△頭孢他啶 27．6±1．1 28．9±0．8＊環(huán)丙沙星 31．6±0．9 26．5±1．1△左氧氟沙星 24．6±1．0 18．8±1．2阿米卡星△

討 論

BF是細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境、有利于生存而特有的生命現(xiàn)象，系指細(xì)菌吸附于惰性物體如生物醫(yī)學(xué)材料或機(jī)體黏膜表面后，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等多糖蛋白復(fù)合物，形成網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)，使細(xì)菌相互粘連并將其自身克隆聚集纏繞其中形成的膜樣物。BF的形成和發(fā)展大致經(jīng)歷了粘附期、種殖期、生長期、成熟期、播散期幾個時期。成熟的P．a(chǎn)生物膜由蘑菇樣或柱樣亞單位組成，每個亞單位又互相交錯成網(wǎng)狀，菌體之間互相粘連附著于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的表面，外層系碳?xì)浠衔锉荒?。P．a(chǎn)生物被膜這種特殊結(jié)構(gòu)，堅實(shí)、穩(wěn)定，作為一保護(hù)屏障，不易被破壞，保護(hù)細(xì)菌避免與抗生素和免疫攻擊物接觸。有報道［4］顯示，由于細(xì)菌生物膜的立體結(jié)構(gòu)，形成一定的滲透屏障，延緩了抗生素對BF的滲透。

目前研究顯示十四（EM、羅紅霉素、克拉酶素）、十五元環(huán)（阿奇霉素）的大環(huán)內(nèi)酯抗生素能抑制藻酸鹽合成的關(guān)鍵酶－GMD的活性，顯著減少藻酸鹽的合成，抑制BF的形成，臨床實(shí)踐也證實(shí)［5］：低劑量紅霉素能改善支氣管擴(kuò)張并銅綠簡單胞菌生物膜感染患者肺功能的急性加重的次數(shù)，但可能增加對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性。但是對于其他抗生素的敏感性尚無報道。

本研究顯示，在EM作用3d時，SEM觀察發(fā)現(xiàn)載體表面僅形成散在、稀疏的早期BF，而空白對照組可見均勻、密布堆積的稀薄生物膜，可見細(xì)菌輪廓及細(xì)菌間黏液樣物質(zhì)。BF半定量測定發(fā)現(xiàn)，EM組明顯少于空白對照組。EM作用7d后，EM組載體表面僅見稀少的薄層生物膜，而空白對照組載體表面可見濃厚黏液樣物質(zhì)，菌體輪廓模糊不清，BF呈立體結(jié)構(gòu)。載體表面活菌計數(shù)結(jié)果顯示EM組低于空白對照組。載體表面生物膜半定量檢測發(fā)現(xiàn)，EM組載體表面生物膜少于空白對照組。以上研究結(jié)果顯示，1／8MICEM可以抑制P．a(chǎn)生物膜的形成。

另有多項研究顯示［6，7］，亞抑菌濃度抗生素長期連續(xù)作用于P．a(chǎn)后，可誘發(fā)細(xì)菌耐藥和交叉耐藥產(chǎn)生。但是，目前尚未見到，關(guān)于長期連續(xù)使用亞抑菌濃度的EM對BF內(nèi)P．a(chǎn)抗生素敏感性影響的相關(guān)報道。因此本實(shí)驗(yàn)就1／8MICEM連續(xù)作用3d和7d，在抑制P．a(chǎn)生物膜形成同時，是否會影響頭孢他啶、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星和氨曲南等11種抗生素對BF內(nèi)P．a(chǎn)的敏感度進(jìn)行探討。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，根據(jù)參考文獻(xiàn)［3］，不論是早期還是晚期BF，空白對照組P．a(chǎn)對所檢測的抗生素均敏感。單獨(dú)應(yīng)用敏感抗生素并不能完全清除BF內(nèi)P．a(chǎn)，但是和能破壞BF的EM聯(lián)合使用后，卻產(chǎn)生良好的協(xié)同殺菌作用，該結(jié)果提示，BF對抗生素的滲透限制在細(xì)菌耐藥方面有著重要的作用。

EM作用3d后，和空白對照組比較，對于早期BF細(xì)菌，環(huán)丙沙星抑菌圈直徑增大，頭孢他啶和氨曲南抑菌圈直徑亦增大，其他抗生素抑菌圈直徑大小無差異。但隨著EM連續(xù)作用時間延長至7d時，盡管頭孢吡肟、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星依然對P．a(chǎn)敏感，但是所形成的抑菌圈直徑卻明顯小于空白對照組。同時觀察不同藥物作用時間點(diǎn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中環(huán)丙沙星抑菌圈直徑由EM作用3d時的33．1±1．1mm，降低至作用7d時的26．5±1．1mm，左氧氟沙星抑菌圈直徑由EM作用3d時的25．7±1．1mm，降低至作用7d時的18．8±1．2mm，頭孢吡肟抑菌圈直徑由EM作用3d時的29．2±1．0mm，降低至作用7d時的23．8±0．7mm。提示隨著1／8MICEM作用時間的延長，環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和頭孢吡肟對P．a(chǎn)的敏感性呈下降趨勢，并且以左氧氟沙星顯著，甚至臨近敏感標(biāo)準(zhǔn)（18mm）。但是頭孢他啶抑菌圈直徑較空白對照組明顯增大，觀察EM作用不同時間點(diǎn)抑菌圈的大小發(fā)現(xiàn)，頭孢他啶抑菌圈直徑由EM作用3d時的28．3±0．5mm，增大至作用7d時的28．9±0．8mm，盡管兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但仍有一定的增大趨勢。

經(jīng)分析以上結(jié)果顯示，亞抑菌濃度EM可以抑制早期和晚期P．a(chǎn)生物膜形成的同時，隨著藥物作用時間的延長，EM使頭孢他啶對P．a(chǎn)的抑菌圈有增大趨勢，但卻使環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和頭孢吡肟對P．a(chǎn)的敏感性呈下降趨勢，并且以左氧氟沙星顯著，甚至臨近敏感標(biāo)準(zhǔn)（18mm）。

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