甌江唇魚骨全人工繁殖與胚胎發(fā)育研究

練青平，宓國強*，姚子亮，胡廷尖，李 倩，劉士力，王雨辰

(1.浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江 湖州 313001;2.浙江省麗水市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，浙江 麗水 323000)

唇魚骨(Hemibarbus labeo)俗稱鞠旦，隸屬鯉形目，鯉科，鮈亞科，魚骨屬［1］。其分布廣，除西部高原地區(qū)之外，我國南北各大水系、浙江省內(nèi)各水系都有分布［1］。而棲息在甌江的唇魚骨是甌江干流重要經(jīng)濟(jì)種類之一，以其肉質(zhì)鮮美，深受浙南地區(qū)人們喜愛，但由于近年來捕撈強度過大和生態(tài)環(huán)境惡化，野生唇魚骨已經(jīng)十分珍稀。為了甌江野生唇魚骨資源的恢復(fù)及唇魚骨養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展需要，本課題組于2006 年成功突破了唇魚骨的全人繁殖技術(shù)，使其達(dá)到生產(chǎn)規(guī)模，很好的解決了唇魚骨養(yǎng)殖和人工放流的苗種的問題。近些年來學(xué)者也對唇魚骨進(jìn)行了一系列的研究［2-14］，但未見詳細(xì)描述在人工養(yǎng)殖條件下的全人繁殖及胚胎發(fā)育。本文報道了人工養(yǎng)殖唇魚骨的親魚在池塘養(yǎng)殖成熟后，進(jìn)行人工催產(chǎn)，獲得魚苗，進(jìn)行胚胎發(fā)育觀察，旨在為唇魚骨的規(guī)?；N提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 親魚

唇魚骨父母本來源于浙江麗水池塘養(yǎng)殖，個體質(zhì)量在150～200 g，年齡為3 齡，試驗時直接從養(yǎng)殖池塘中挑選，試驗前一年冬季放入池塘培育，試驗時從塘中挑選。

1.2 催產(chǎn)、人工授精與孵化

催產(chǎn)劑為馬來酸地歐酮(DOM)、促黃體素釋放激素2 號(LHRH-A2)和絨毛膜促性腺激素(HCG)的混合激素。劑量為5 mgDOM+10 μg LHRH-A2+1 000 HCG/kg，雄魚(唇魚骨)減半。采用1 次注射，注射后將雌雄親本放在不同網(wǎng)箱內(nèi)，用流速0.1～0.2 m/s 的水流刺激，促使發(fā)情、排卵。2005—2012 年，采用常規(guī)人工干法授精獲得唇魚骨受精卵。大部分在水泥池中靜水孵化，只取部分受精卵在塑料盆中孵化，受精卵孵化為水溫(20±1)℃。

1.3 授精率、孵化率、出苗率的計算及胚胎發(fā)育觀察觀察方法

授精率、孵化率、出苗率計算參照練青平等［15］計算要求進(jìn)行計算，計算公式如下:

利用ZOOM645S 連續(xù)變倍體視顯微鏡對整個胚胎發(fā)育過程進(jìn)行連續(xù)活體觀察，每次隨機觀察取樣30 粒卵以上，記錄胚胎發(fā)育各個階段的形態(tài)特征及發(fā)育時間，胚胎發(fā)育時間以50%以上的受精卵明顯進(jìn)入該發(fā)育階段為準(zhǔn)。

2 結(jié)果分析

2.1 甌江唇魚骨的全人工繁殖

在繁殖季節(jié)，唇魚骨雌性成熟個體腹部膨大而柔軟，腹腔近肛門處隆起，泄殖孔紅潤且向外突出，吻部和胸鰭處光滑;雄性成熟個體在吻部和胸鰭處布滿“追星”，手摸上去有明顯粗糙、刺手的感覺，輕壓腹部就能擠出有白色精液，且精液入水既散開。

唇魚骨的全人工繁殖技術(shù)人工催產(chǎn)情況見表1，野外捕撈成熟的野生魚，對其注射催產(chǎn)劑為馬來酸地歐酮(DOM)、促黃體素釋放激素2 號(LHRH-A2)和絨毛膜促性腺激素(HCG)的混合激素，在水溫17～22 ℃下，效應(yīng)時間為20～22 h，使其產(chǎn)卵。2007 年后，采用池塘養(yǎng)殖的親本進(jìn)行人工繁殖，其催產(chǎn)率、受精率和孵化率情況見表2，2005—2012 年，共計獲得受精卵為1 635萬粒，平均催產(chǎn)率、受精率和孵化率分別為86.8%，71.4%和90.9%。

表1 甌江唇魚骨的全人工繁殖催產(chǎn)情況Tab.1 Artificially induced spawning with hormone for Hemibarbus labeo in Oujiang River

表2 甌江唇魚骨的全人工繁殖催產(chǎn)情況催產(chǎn)率、受精率和孵化率Tab.2 Induced spawning rate，fertilization rate，hatching rate under artifical propagation condition of Hemibarbus labeo in Oujiang River

2.2 胚胎發(fā)育

人工養(yǎng)殖的唇魚骨成熟卵有淡綠色的和橙黃色的，卵徑為1.55～1.95 mm。甌江唇魚骨胚胎在(18～20)℃條件下，整個胚胎發(fā)育過程歷時約88 h20 min，所需積溫A=1 678.33(h·℃)。從受精卵到出膜各個發(fā)育時期的時序及特征見表1。

圖版Ⅰ 唇魚骨的胚胎發(fā)育Plate Ⅰ Embryonic development of Hemibarbus labeo

2.2.1 受精卵胚盤形成階段 成熟卵子受精后，受精卵遇水迅速膨脹并快速產(chǎn)生粘性粘附在附著物上，同時出現(xiàn)卵周隙，卵膜在水中粘附雜質(zhì)后變得不透明，很難觀察到胚胎(圖版Ⅰ-1)。受精后1 h40 min，積溫為30.00(h·℃)時，由于原生質(zhì)不斷向動物極聚集，在動物極隆起形成一盤狀的結(jié)構(gòu)，為胚盤，此時進(jìn)入胚盤期(圖版Ⅰ-2)，胚盤的形成是卵裂階段的基礎(chǔ)。

2.2.2 卵裂階段 受精后2 h10 min，積溫為39.00(h·℃)，受精卵進(jìn)行第一次分裂，此時胚盤經(jīng)裂成2 個大小相等的分裂小球，此時胚胎進(jìn)入2細(xì)胞期(圖版Ⅰ-3);接著繼續(xù)分裂，且第二次與第一次分裂溝相垂直，把胚胎分裂成4 個分裂球，進(jìn)入4 細(xì)胞期。隨著卵裂繼續(xù)進(jìn)行，胚胎進(jìn)入8細(xì)胞(圖版Ⅰ-2)、16 細(xì)胞、32 細(xì)胞、64 細(xì)胞……分裂的細(xì)胞數(shù)越來越多(圖版Ⅰ-4～6);受精后5 h35 min，積溫為106.08(h·℃)，分裂小球越分越小，大小不一致且形狀不規(guī)則，逐漸形成多細(xì)胞的胚體，形似桑椹，此時進(jìn)入桑椹期(圖版Ⅰ-7)。

2.2.3 囊胚階段 受精后5 h55 min，積溫為118.33(h·℃)，桑椹期后，分裂球越來越小，但細(xì)胞界限不清晰，有許多分裂球組成高囊胚如帽狀，大小約占卵徑的2/5，此時胚胎進(jìn)入囊胚早期(圖版Ⅰ-8);受精后7 h30 min，積溫為150.0(h·℃)，隆起的高囊胚的高度有所降低，且囊胚開始向四周擴(kuò)散下包，此時胚胎進(jìn)入囊胚中期(圖版Ⅰ-9);受精后8 h，積溫為160.00(h·℃)，囊胚繼續(xù)下包高度降低，且囊胚的表面細(xì)胞開始向卵黃下包，胚環(huán)逐漸形成，此時胚胎進(jìn)入囊胚晚期(圖版Ⅰ-10)。

2.2.4 原腸胚階段 受精后9 h，積溫為180.00(h·℃)，胚層下包卵黃達(dá)1/4，胚環(huán)出現(xiàn)，此時胚胎進(jìn)入原腸早期(圖版Ⅰ-11);受精后11 h10 min，積溫為212.17(h·℃)，胚層下包卵黃達(dá)1/2，胚環(huán)明顯，胚盾出現(xiàn)，此時胚胎進(jìn)入原腸中期(圖版Ⅰ-12);受精后14 h50 min，積溫為267.00(h·℃)，胚層下包卵黃達(dá)3/4，卵黃體由圓形變橢圓形，出現(xiàn)雛形胚體，此時胚胎進(jìn)入原腸晚期(圖版Ⅱ-1)。

2.2.5 神經(jīng)胚形成階段 受精后18 h，積溫為324.00(h·℃)，胚層進(jìn)一步下包達(dá)4/5，而未被包裹的卵黃栓外露，囊胚呈不對稱形狀，胚體開始側(cè)臥，胚體輪廓顯現(xiàn)，此時進(jìn)入神經(jīng)胚期(圖版Ⅱ-2)。受精后21 h，積溫為378.00(h·℃)，背唇、腹唇和側(cè)唇在胚孔處匯合而將胚孔關(guān)閉，此刻胚層完全包圍卵黃囊，此時胚胎進(jìn)入胚孔封閉期(圖版Ⅱ-3)。

2.2.6 器官形成階段 受精后23 h，積溫為437.00(h·℃)，胚體側(cè)臥后，在胚體中部出現(xiàn)2 對肌節(jié)，胚體前部隆起，此時胚胎進(jìn)入肌節(jié)出現(xiàn)期(圖版Ⅱ-4);受精后25 h30 min，積溫為484.50(h·℃)，在前腦2 側(cè)出現(xiàn)一對腎形的突起為眼的原基，且肌節(jié)增加到4～5 對，此時胚胎進(jìn)入眼基出現(xiàn)期;受精后27 h，積溫為540.00(h·℃)，眼基中央出現(xiàn)裂縫，并形成長橢圓形的眼囊，且肌節(jié)出現(xiàn)7～8對，此時胚胎進(jìn)入眼囊期。受精后29 h10 min，積溫為583.33(h·℃)，在胚體后端腹面隆起為尾芽，呈圓錐狀，且肌節(jié)出現(xiàn)18～19 對，此時胚胎進(jìn)入尾芽期(圖版Ⅱ-5);受精后38 h40 min，積溫為734.67(h·℃)，在眼杯口出現(xiàn)圓形眼晶體，卵黃囊成腎形，肌節(jié)為25～26 對，此時胚胎進(jìn)入眼晶體出現(xiàn)期(圖版Ⅱ-6);受精后43 h30 min，積溫為783.00(h·℃)，胚體開始表現(xiàn)輕微的顫動，然后形成比較穩(wěn)定的肌肉收縮，此時胚胎進(jìn)入肌肉效應(yīng)期，標(biāo)志著胚胎活動的開始(圖版Ⅱ-7);受精后46 h，積溫為828.00(h·℃)，在耳囊內(nèi)出現(xiàn)1 對透亮的耳石，尾芽伸直，胚體擺動頻率不斷增加，此時肌節(jié)出現(xiàn)31～32 對，胚體扭動頻率15 次/min，此時胚胎進(jìn)入耳石出現(xiàn)期(圖版Ⅱ-8);受精后48 h50 min，積溫為927.83(h·℃)，在卵黃囊前下方出現(xiàn)管狀心臟原基，此時胚胎進(jìn)入心臟原基出現(xiàn)期;受精后51 h，積溫為969.00(h·℃)，心臟已經(jīng)形成，位于卵黃囊頭端，已開始作微弱的搏動，然后收縮繼而加強，此時胚胎進(jìn)入心跳期(圖版Ⅱ-9)。受精后53 h，積溫為1 060.00(h·℃)，眼囊腹面出現(xiàn)出現(xiàn)黑色，然后逐漸加深，心臟進(jìn)一步發(fā)育，此時胚胎進(jìn)入眼色素出現(xiàn)期。受精后58 h20 min，積溫為1 108.33(h·℃)，在胚體的卵黃囊表面出現(xiàn)淡淡的黃色圓斑狀的孵化腺細(xì)胞，此時卵膜的透明度增高，肌節(jié)出現(xiàn)34～36 對，此時胚胎進(jìn)入孵化腺細(xì)胞出現(xiàn)期(圖版Ⅱ-10)，這是唇魚骨所特有的。受精后73 h30 min，積溫為1 396.50(h·℃)，在卵黃囊的背部靠頭部處兩側(cè)出現(xiàn)一度泡狀胸鰭原基，此時胚胎進(jìn)入胸鰭原基出現(xiàn)期。

圖版Ⅱ 唇魚骨的胚胎發(fā)育Plate Ⅱ Embryonic development of Hemibarbus labeo

表3 唇魚骨的胚胎發(fā)育情況Tab.3 Embryo development of Hemibarbus labeo in Oujiang River

2.2.7 孵化出膜階段 受精后88 h20 min，積溫1 678.33(h·℃)，仔魚開始出膜，此時大部分胚胎的卵膜開始變薄薄，且卵膜變得透明，可見胚體在出膜前進(jìn)行著劇烈的顫動。出膜主要有2 種方式，第一種為尾部率先出膜，繼而繼續(xù)扭動，至整個身體脫膜而出;第二種為頭部先出膜，繼而整個身體出膜的。第二種出膜方式比較迅速，輕盈。出膜期較長，可持續(xù)12 h，若是遇到出膜環(huán)境不適合，則推遲出膜孵化時間。

2.3 初孵仔魚形態(tài)特征及活動情況

剛出膜的仔魚身體透明且無黑色素;卵黃囊呈棒狀，前大后小，占整個魚體的1/2;全長6.0～6.80 mm，肌節(jié)為38～43。耳囊中可見清晰的左右耳石。初孵仔魚游泳功能較弱，只能間隙性運動，需臥底或者貼壁休息。眼色素較明顯，呈灰黑色(圖版Ⅱ-11)。

3 討論

3.1 唇魚骨全人工繁殖的特點

同種魚類的繁殖季節(jié)因為分布在不同地理水域的水溫季節(jié)變化不同而不同，本研究認(rèn)為在浙江地區(qū)的甌江唇魚骨繁殖時間為3 月下旬開始至4 月上旬結(jié)束，水溫在17 ℃以上即可;而涪江下游唇魚骨繁殖季節(jié)為每年的3—4 月，水溫為12～24 ℃，此種群與甌江種群繁殖時間上相似。徐偉等［16］研究認(rèn)為烏蘇里江唇魚骨的繁殖季節(jié)在每年的6 月，水溫在22 ℃以上，可能是烏蘇里江地區(qū)的冬天水溫比較低，性腺發(fā)育緩慢。甌江唇魚骨的繁殖季節(jié)較早，為每年初春，與其“四大家魚”和翹嘴紅鲌繁殖季節(jié)分別在4月底直7 月初、5 至7 月，同屬的花魚骨也為4 月中旬至下旬，造成這樣不同的是本來在野外環(huán)境的不同，為山溪溪流性魚類，而“四大家魚”、翹嘴紅鲌和花魚骨為江河湖泊性魚類。

3.2 唇魚骨胚胎發(fā)育的特點

本研究認(rèn)為甌江唇魚骨胚胎在(18～20)℃條件下，整個胚胎發(fā)育過程歷時約88 h20 min，所需積溫A=1 678.33(h·℃)。馮曉宇等［4］研究認(rèn)為唇魚骨受精卵在水溫18～21 ℃條件下，唇魚骨受精卵經(jīng)過90～120 h 仔魚孵化出膜。賀吉勝［2］認(rèn)為涪江下游唇魚骨受精卵在12.5～18.5 ℃下歷時195 h。本研究基本和馮曉宇等研究相似，但是與賀吉勝［4］認(rèn)為涪江下游唇魚骨胚胎發(fā)育時間不同，這可能與地理種群及孵化水溫有關(guān)。

浙江地區(qū)我們多采用靜水孵化唇魚骨的方法，即受精卵撣粘在用聚乙烯塑料網(wǎng)片或者棕梠片做成的架子上，放在水泥池中孵化，這樣有效提高了孵化率，徐偉等［16］認(rèn)為此種靜水孵化不方便和不易管理，而是通過泥漿水脫粘的方法進(jìn)行脫粘后，把受精卵放入“四大家魚”孵化缸進(jìn)行孵化。

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