MUC13腹瀉抗性純合杜洛克種群的選育研究

阮國榮，何曉芳，黃 晶，肖石軍，陳金雄，李軍山，劉亞軒，孫耀華，陳福珍，林國忠

(1.福建農業(yè)職業(yè)技術學院，福建 福州 350119;2.上海農業(yè)科學院 畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106;3.江西農業(yè)大學生物技術國家重點實驗室培育基地，江西 南昌 330045;4.福建省廈門國壽種豬開發(fā)有限公司，福建 廈門 350021;5.福建省光華百斯特生態(tài)農牧有限公司，福建 尤溪 365100)

仔豬腹瀉是造成仔豬死亡的重要原因。據(jù)調查，因腹瀉死亡的仔豬占仔豬死亡總數(shù)的38.9%［1］。目前應對仔豬腹瀉的常見辦法主要是飼料中加大抗生素劑量或使用疫苗預防，但防治效果欠佳、且會產生耐藥而影響后期生長、甚至導致抗生素殘留超標，對食品安全造成影響。為此，改變疾病頻發(fā)的最好措施是實施抗病選育，從源頭上加以改變，培育出先天性抵抗腹瀉的種豬品種。

研究表明，產腸毒素大腸桿菌F4(ETEC F4)是引發(fā)新生和斷奶前仔豬腹瀉病的最主要致病菌［2-4］。ETEC F4有3種血清型:F4ab，F(xiàn)4ac和F4ad，其最主要的血清型為F4ac［5］。ETEC F4的致病性取決于其是否能與豬小腸上皮細胞表面刷狀緣的受體特異性結合，無受體豬表現(xiàn)為抵抗型，有受體豬則表現(xiàn)為易感型。豬ETEC F4受體是由單基因控制的，呈顯隱性遺傳模式。攜帶顯性等位基因的豬對ETEC F4的侵染易感，隱性等位基因純合子豬則表現(xiàn)為抵抗型［6-7］。因此，F(xiàn)4ac受體基因的定位和鑒別是抗腹瀉育種的關鍵。在ETEC F4受體基因的精細定位和主效基因鑒別方面，瑞士Peter Vogeli小組將其精細定位于SW207-MUC4之間［8］，黃路生院士［8-12］研究組采用一系列現(xiàn)代遺傳分析手段最終鑒別到了編碼ETEC F4ac受體的目的基因-MUC13基因，發(fā)現(xiàn)了能準確鑒別F4ac易感個體和抗性個體的分子標記(準確率＞97%)。而種豬性能測定及BLUP遺傳評估選育技術是近20年來國內外豬育種界公認的提高生產性能的有效方法，國內外諸多種豬企業(yè)應用該方法進行種豬選育，均取得明顯效果［13-16］。為此，將仔豬抗腹瀉分子標記育種技術結合種豬性能測定及BLUP遺傳評估選育技術開展抗腹瀉育種有望培育出生產性能優(yōu)異的抗腹瀉病新品系。

在國外引進瘦肉型豬品種中，杜洛克品種的抗性有利基因頻率相對較高［17-18］，經少數(shù)幾代選育將有可能育成抗性品系;而且在商品豬生產上杜洛克常被用作終端父本，具有影響面廣的特點。為此，本研究選取兩家具有開展性能測定的條件和經驗的國家級育種核心場，對其杜洛克種群開展MUC13抗性純合與性能測定的綜合選育研究，希冀培育出生產性能較好的抗F4ac腹瀉病豬專門化新品系。

1 材料與方法

1.1 材料

根據(jù)血緣、生產性能及體型外貌等表現(xiàn)，分別組建兩個杜洛克豬育種核心群，其中廈門國壽220頭(20♂、200♀)、光華百斯特55頭(5♂、50♀)，合計275頭(25♂、250♀)。組群后均同步按方案逐代進行檢測、測定和選育。兩豬場飼養(yǎng)管理相同，營養(yǎng)水平一致。期間兩豬場間先后有6頭公豬血緣交流。

1.2 選育方案

在兩場原有選育群的基礎上重新確定育種核心群(25♂，250♀)。記錄育種群配種受胎及產仔、哺育個體情況，根據(jù)同窩及個體本身表現(xiàn)，對育種群斷奶仔豬進行初選(剔除出現(xiàn)遺傳疾患的窩別外，其余每窩選擇 1～2♂、2～3♀)。

對入選測定(常規(guī)性能測定)的仔豬個體進行采樣，并進行基因檢測。根據(jù)生長發(fā)育測定結果，經BLUP法計算個體育種值，對綜合選擇指數(shù)高、抗性基因型有利的個體進行外貌鑒定，按指數(shù)高低，選留體型外貌符合品種特征的優(yōu)秀個體留作下一世代育種核心群;允許部分世代重疊。

實施連續(xù)3年的反復檢測、選留，比較育種群選育前后的生產性能指標變化，以及育種群與未經選育的擴繁群仔豬腹瀉的差異。

1.3 MUC13 基因檢測

1.3.1 樣品采集與保存 按要求對育種核心群每世代選留測定的后代進行耳樣采集，以鑒別個體MUC13基因型。

采樣部位和方法:用耳號鉗在豬耳朵上打下一小塊耳組織，放入裝有體積分數(shù)75%酒精的樣品采集管內，擰緊管蓋并在管壁和管蓋上用標記筆作好耳號記錄。

樣品保存:采集好的耳組織樣品，及時(半天之內)放置在-20℃冰箱內，以防樣品腐爛變質。

1.3.2 DNA提取 依照標準酚/氯仿抽提、乙醇沉淀的方法提取，經Nanodrop ND-1000全波長紫外/可見光掃描分光光度計(熱電，美國)測定DNA濃度和質量合格后，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 基因判別 根據(jù)江西農業(yè)大學研發(fā)的鑒別腹瀉易感/抗性個體MUC13分子標記專利技術，委托上海生工生物有限公司合成PCR-Snapshot引物。PCR引物序列(5'-3')為Fp:GGA GAG ACC AAA CCC ACA GA，Rp:CTC CTC ACC AGC TCC TTA GC，目的片段280 bp。PCR反應體系總體積為20 μL，包括模板 DNA 40 ng、10×buffer 2.0 μL、25 mmol/L MgCl21.2 μL、10 mmol/L dNTP 0.3 μL、Fp 0.4 μL、Rp 0.4 μL、Taq聚合酶 0.5 μL、超純水 13.2 μL。PCR 循環(huán)參數(shù):94 ℃變性 3 min，94 ℃ 30 s，退火溫度61℃ 30 s，72℃延伸45 s，共36個循環(huán)。

SNaPshot判型:采用PCR-SNaPshot判定 MUC13基因型。取1.5 μL純化后 PCR產物，加入2 μL SNaPshot multiplex mix(含 Taq 聚合酶和熒光標記的 dd-NTPs)、1.2 μL 去離子水和 0.3 μL SNaPshot引物(引物序列為:TTT TTT TTT TTT TTT CCA TGT ACA TTT CAG AGT CTG AGG GAT)。混合均勻后進行SNaPShot反應，反應參數(shù)為96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 30 s，25個循環(huán)。反應結束后在 SNaPshot反應產物中加 0.57 μL 1 × NEB buffer和0.1 μL CIP(NEB，美國)，37 ℃ 60 min，75 ℃15 min，進行再次純化，以清除熒光標記的ddNTPs并滅活純化酶。最后進行毛細管電泳檢測分型，方法是:每1 μL SNaPshot反應產物加入8 μL上樣變性劑(由Hi-Di formamide和GeneScan 120 LIZ size standard以20∶1混合而成)95℃變性5 min;然后迅速轉置冰水浴中2 min;冷卻離心后上樣于3130XL遺傳分析儀(ABI，美國)進行電泳檢測，最后使用GeneMapper 4.0軟件(ABI，美國)進行判型分析。判型標準如圖1。

圖1 MUC13基因的PCR-SnaPshot檢測圖Fig.1 SNapshot genotyping patterns at the MUC13 locus

1.4 仔豬腹瀉觀察

在兩場分別選取相同胎齡的核心群與擴繁群杜洛克母豬各10對，安排在相同欄舍，以觀察核心群與擴繁群同期出生的仔豬腹瀉發(fā)生情況。觀察實驗要求對同期出生(相近1周內)的仔豬記錄母豬耳號、分娩日期、同窩仔豬數(shù)量，并仔細登記有發(fā)生腹瀉的每頭仔豬耳號、腹瀉發(fā)生日齡、腹瀉延續(xù)時間、治療康復時間等，計算腹瀉比例和成活率。

1.5 生長性能測定

根據(jù)國家《種豬性能測定技術規(guī)程》標準(NY/T 822—2004)要求，剔除繁殖性能低、發(fā)生遺傳疾患等情況的整窩仔豬外，將每世代斷奶、保育選留的待測小豬(每窩選留1～2♂、2～3♀)轉入測定舍，按常規(guī)飼養(yǎng)到85～105 kg體質量時進行稱量、同時用ALOKA 500 B超儀進行活體背膘測量。所有測定數(shù)據(jù)輸入GBS軟件，并校正到100 kg體質量時日齡、活體背膘厚。

1.6 不同MUC13基因型個體的生長性能比較

根據(jù)個體的生長性能測定結果和MUC13基因型檢測結果，分析兩場3批計525頭杜洛克仔豬MUC13 3種基因型對生長性能的影響效應。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，腹瀉發(fā)生率與仔豬成活率使用Chi-square test模塊;生長發(fā)育數(shù)據(jù)使用One-Way Anova及Post Hoc模塊分析。

2 結果與分析

2.1 MUC13 基因檢測

由表1可見，通過3個世代的基因檢測和篩選，腹瀉抗性有利基因G頻率逐代明顯提高，而不利基因A則在核心群中逐代降低，直至完全剔除。

表1 三世代MUC13基因檢測結果Tab.1 Genotyping patterns at the MUC13 locus of the three generations pigs

2.2 仔豬腹瀉發(fā)生情況及哺乳期成活率

由表2可見，在同胎次相同飼養(yǎng)管理條件下，核心群與擴繁群仔豬腹瀉發(fā)生率分別為8.7%和18.4%，兩組間仔豬腹瀉發(fā)生率差異極顯著(P=0.006)。核心群發(fā)生腹瀉的仔豬治療后較快康復，擴繁群腹瀉仔豬在采取同樣治療措施情況下，腹瀉延續(xù)時間多需3～4 d以上，兩組的腹瀉致死率分別為12.5%和16.7%，但差異不顯著(P＞0.05);哺乳期仔豬成活率分別為94.57%和92.23%，差異也未達到顯著水平(P＞0.05)。

2.3 生長發(fā)育測定選育結果

通過3年來的性能測定與BLUP指數(shù)選育，生長速度和活體背膘均有一定改善，其中校正達100 kg體質量日齡由181.34 d降低到177.48 d，但經SPSS 13.0統(tǒng)計分析，各年度間(P＞0.05)，未達顯著水平;而活體背膘由12.23 mm降低到10.77 mm，經分析并比較，2010年與2012年間差異達到顯著水平(P＜0.05)。

表2 育種核心群與普通擴繁群仔豬腹瀉比例Tab.2 Diarrhea rate of piglets in the core breeding group and propagation population

表3 育種群3個世代生長性能Tab.3 Growth performance in the three generations of breeding pigs

2.4 MUC13基因型與生長性能的關聯(lián)性

從表4發(fā)現(xiàn)，易感純合基因型AA豬只達100 kg體質量日齡較抗性純合基因型GG豬只平均增加1.56 d，背膘厚也平均增加0.36 mm;易感雜合基因型GA豬只達100 kg體質量日齡較抗性純合基因型GG豬只平均增加1.34 d，背膘厚也平均增加0.27 mm。但經SPSS 13.0統(tǒng)計分析，均未達到顯著水平(P＞0.05)，說明MUC13各基因型豬只間在生長速度和活體背膘上沒有顯著差別。

表4 不同基因型豬群生長性能Tab.4 Growth performance in different genotyping patterns of pigs

3 討論與結論

3.1 MUC13抗性基因型純合群體的選育

通過連續(xù)3個世代的MUC13基因檢測篩選以及性能測定后的BLUP指數(shù)選擇，受試育種群MUC13抗腹瀉有利基因G頻率由0.86提高到1，有利基因型GG頻率由0.75提高到1，實現(xiàn)了抗腹瀉有利基因的純合。同時，生長速度和活體背膘均有一定改善，校正達100 kg體質量日齡由181.34 d降低到177.48 d，減少3.86 d，不過仍未達顯著水平;但活體背膘則由12.23 mm降低到10.77 mm，減少1.46 mm，且達到顯著水平(P＜0.05)。經分析，由于場內測定受實際生產時間影響，豬群入測時間達6個月，且測定個體表現(xiàn)也有較大差異，雖然BLUP模型計算選擇指數(shù)時能夠校正場、年、季等造成的誤差，但進行SPSS統(tǒng)計分析時仍有一定影響，為此，在后續(xù)的選育測定工作中，應將核心群母豬配種安排在盡可能短時間完成，以減少因時間跨度長而造成的影響。此外，選育群體要能維持腹瀉抗性基因的純合，首先應該堅持在本群體內選留后備種豬;如需要引進血緣時，必須對引進個體進行MUC13基因檢測，防止導入易感等位基因。

3.2 MUC13抗性純合群體與哺乳仔豬腹瀉的關系

造成哺乳仔豬腹瀉的因素眾多，腸毒素大腸桿菌則是引起仔豬腹瀉的主要因素。通過MUC13基因型判定與腸毒素大腸桿菌黏附的受體有無，從而確定仔豬對大腸桿菌引起腹瀉的抗性或易感，已由江西農大團隊相繼研發(fā)和驗證［9-12，19-20］，并獲得國家發(fā)明專利(專利號:200810136425)。經普查，杜洛克群體自然選擇情況下，MUC13抗性純合程度已達70%～80%，因而，本項目通過對育種核心群與未經選育的擴繁群仔豬在相同胎次和飼養(yǎng)管理情況下的腹瀉情況觀察、統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)核心群與擴繁群斷奶前仔豬腹瀉發(fā)生率分別為8.7%和18.4%，經SPSS 13.0 Chi-square test分析，差異極顯著(P＜0.01);核心群與擴繁群哺乳仔豬斷奶成活率分別為94.6%和92.3%，提高2.3個百分點，但經統(tǒng)計分析，未達顯著水平。本次測試核心群和擴繁群數(shù)量均僅20窩，所得結果雖有一定參考價值，但有待于在更大范圍進行試驗、統(tǒng)計，以進一步驗證MUC13抗性純合與斷奶前仔豬腹瀉的關系。

3.3 MUC13抗性純合基因型與豬生產性能的關系

MUC13抗性純合基因型能減少仔豬腹瀉的發(fā)生，但抗性個體的純合對其他生產性能是否具有不利影響，此前尚未見報道。本研究通過對不同基因型的個體進行生長發(fā)育性能測定，發(fā)現(xiàn)抗性純合基因型(GG)、雜合基因型(GA)及易感純合基因型(AA)個體達100 kg體質量日齡平均分別為181.25，182.59，182.81 d，達100 kg體質量校正背膘分別為11.50，11.77，11.86 mm，經SPSS 13.0統(tǒng)計分析，各組間差異均不顯著(P＞0.05)，說明MUC13基因型抗性純合選育對生長速度和背膘厚性能沒有影響。

通過3年的分子檢測與性能測定綜合選育研究，驗證了MUC13基因抗性純合有利于降低斷奶前仔豬腹瀉的發(fā)生;生長發(fā)育性能測定及BLUP指數(shù)評估能有效降低活體背膘;而且MUC13不同基因型選擇對生長發(fā)育沒有明顯影響。

致謝:感謝江西農業(yè)大學任軍研究員對基因檢測實驗的指導和論文修改。

［1］王明福，彭羽，肖光明.論溶菌酶防治仔豬大腸桿菌性腹瀉推廣應用前景［J］.中國畜禽種業(yè)，2009(3):132-135.

［2］Guerin G，Duval-Iflah Y，Bonnean M，et al.Evidence for linkage between k88ab，k88ac intestinal receptors to Escherichia coli and transferring loci in pigs［J］.Anim Genet，1993，24:393-396.

［3］Moon H W，Hoffman.Prevalence of some virulence genes among Escherichia coli isolates from swine presented to a diagnostic laboratory in Iowa［J］.J Vet Diagn Invest，1999，11:557-560.

［4］陳螺眉，郭金森，黃瑜，等.福州地區(qū)哺乳仔豬腹瀉防制研究Ⅱ、致病性大腸桿菌的分離及血清型鑒定［J］.福建畜牧獸醫(yī)，2002(6):8.

［5］Guinée P A M，Jansen W H.Behavior of Escherichia coli antigens K88ab，K88ac，and K88ad in immunoelectrophoresis，double diffusion，and hemagglutination［J］.Infect Immun，1979，23:700-705.

［6］Sellwood R，Gibbons R A.Adhesion of enteropathogenic Escherichia coli to pig intestinal brush borders:the existence of two pig phenotypes［J］.J Med Microbiol，1975，8:405-411.

［7］Gibbons R A，Sellwood R，Burrows，et al.Inheritance of resistance to neonatal E.coli iarrhea in the pig:examination of the genetic system［J］.Theor Appl Genet，1977，51:65-70.

［8］Joller D，J?rgensen C B，Bertschinger H U，et al.Refined localization of the Escherichia coli F4ab/F4ac receptor locus on pig chromosome 13［J］.Anim Genet，2009，40:749-752.

［9］Peng Q L，Ren J，Yan X M，et al.The g.243A＞G mutation in intron 17 of MUC4 is significantly associated with susceptibility/resistance to ETEC F4ab/ac infections in pigs［J］.Anim Genet，2007，38:397-400.

［10］Wang Y，Ren J，Lan L，et al.Characterization of polymorphisms of ransferring receptor and their association with susceptibility to ETEC F4ab/ac in pigs［J］.J Anim Breed Genet，2007，124:225-229.

［11］Zhang B，Ren J，Yan X，et al.Investigation of the porcine MUC13 gene:isolation，expression，polymorphisms and strong association with susceptibility to enterotoxigenic Escherichia coli F4ab/ac［J］，Animal Genetics，2008，39:258-266.

［12］Ren J，Tang H，Yan X M，et al.A pig-human comparative RH map comprising 20 genes on pig chromosome 13q41 that harbours the ETEC F4ac receptor locus［J］.Journal of Animal Breeding and Genetics，2009，126:30-36.

［13］劉敬順，劉小紅.全自動種豬性能測定系統(tǒng)(F.I.R.E)在豬育種中的研究和應用［J］.今日養(yǎng)豬業(yè)，2004(3):72-74.

［14］肖煒.豬育種新技術及其應用現(xiàn)狀［J］.豬業(yè)科學，2006，10:12-15.

［15］Rothschild M F.Genetic and genomic technologies from A-Z，Pig Genetics Workshop［G］.2010:25-38.

［16］孫德林，云鵬.2011年中國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展研究報告［R］.中國種豬信息網(wǎng)，2012-09-26.

［17］阮國榮，肖石軍，徐盼，等.福建省商業(yè)豬種MUC13、IGF2、和RYR1基因主效位點的遺傳變異分析［J］.江西農業(yè)大學學報，2012，34(5):997-1002.

［18］Ruan G R，Xing Y Y，F(xiàn)an Y，et al.Genetic variation at RYR1，IGF2，F(xiàn)UT1，MUC13，and KPL2 mutations affecting production traits in Chinese commercial pig breeds［J］，Czech J Anim Sci，2013，58(2):65-70.

［19］晏學明.豬腸毒素大腸桿菌F4流行病學調查及其受體的遺傳學研究［D］.南昌:江西農業(yè)大學，2008.

［20］Ren J，Yan X，Ai H，et al.Susceptibility towards enterotoxigenic Escherichia coli F4ac diarrhea is governed by the MUC13 gene in pigs［J］.PLoS One，2012，7:e44573.