不同催產(chǎn)劑型對(duì)人工培育巴馬擬纓魚性腺及性激素水平的影響

程蔓，麻艷群*，程光平，2，司楠，古昌輝，韋云勇

（1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2. 廣西海洋研究所有限責(zé)任公司，廣西 北海 536000）

巴馬擬纓魚（Pseudocrossocheilus bamaensis），屬鯉形目（Cyprinformes）、鯉科（Cyprinidae）、野鯪亞科（Labeoninae）、擬纓魚屬（Pseudocrossocheilus）[1]，又稱巴馬油魚。主要分布在廣西境內(nèi)巴馬縣的盤陽河和紅水河都安段，喜穴居，一般晨昏活動(dòng)，于洞穴越冬，春末夏初洪水期繁殖，在自然水域多以固著藻類為食[2]。巴馬擬纓魚個(gè)體小，體肥，肉質(zhì)細(xì)嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，是廣西土著小型經(jīng)濟(jì)特色魚類之一。研究表明，巴馬擬纓魚肌肉中蛋白含量高，脂肪含量適中，富含各類氨基酸及不飽和脂肪酸，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3]。

利用外源激素處理，是常見的促進(jìn)魚類性腺發(fā)育成熟及產(chǎn)卵的方法[4]。不同的外源激素對(duì)性腺作用不同，通過注射絨毛膜促性腺素（Chorionic Gonadotropic Hormone, HCG）和促黃體生成素釋放激素（Luteinizing Hormone Releasing Hormone, LHRH），能夠促進(jìn)卵巢迅速發(fā)育并完成物質(zhì)積累[5]。而多潘立酮（Domperidone, DOM），常被認(rèn)為是促黃體素釋放激素（Luteinizing Releasing Hormone, LRH）的增強(qiáng)物。

近年來，在巴馬擬纓魚的形態(tài)、分布、年齡與生長(zhǎng)特性、肌肉營(yíng)養(yǎng)成分和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值方面已有研究報(bào)道，但對(duì)其在不同劑型催產(chǎn)劑作用下的性激素水平變化方面的研究鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)旨在探索不同劑型催產(chǎn)劑對(duì)巴馬擬纓魚血液性激素含量的影響，以期為巴馬擬纓魚生理生態(tài)學(xué)，以及規(guī)?；斯し敝逞芯刻峁┛茖W(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 時(shí)間與地點(diǎn)

2021年7月。試驗(yàn)地位于廣西大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地。

1.2 材料

巴馬擬纓魚采自紅水河都安江段，于廣西大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地人工培育1年，平均體質(zhì)量（38.16±1.08）g。

催產(chǎn)激素為L(zhǎng)HRH-A3、HCG、DOM 和購(gòu)自上海生物科技有限公司的魚用高效催產(chǎn)劑（DOM, HCG,LRH-A2混合劑）。產(chǎn)卵桶為高80 cm、直徑60 cm的圓形塑料桶，每桶裝水量200 L。桶內(nèi)懸吊1 個(gè)用篩絹網(wǎng)制作、高15 cm、直徑35 cm 并加蓋的圓形產(chǎn)卵箱（箱底鋪設(shè)約相當(dāng)于箱底面積1/5 的礫石層）。各產(chǎn)卵桶水深20 cm，同穴居環(huán)境。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

催產(chǎn)前所采集雌雄魚樣本作為對(duì)照組（M），各6 尾；設(shè)置A、B、C、D 4 個(gè)劑量處理組，2 個(gè)重復(fù)。4 尾雌魚、4 尾雄魚為1 組，安置于1 個(gè)產(chǎn)卵桶內(nèi)。A 組（LHRH-A315 μg+HCG 3 000 IU+DOM 15 mg）/kg、B 組（LHRH-A39 μg+HCG 2 000 IU+DOM 10 mg）/kg、C 組（LHRH-A33 μg+HCG 1 000 IU+DOM 5 mg）/kg和D 組（魚用高效魚用催產(chǎn)劑800 活性單位+HCG 2 500 IU）/kg；各組雄魚催產(chǎn)劑量為雌魚劑量的1/2，注射量0.3 mL/尾。

1.4 催產(chǎn)

2022年8月8日開始催產(chǎn)試驗(yàn)。從養(yǎng)殖群體中選擇腹部較大的個(gè)體作樣本群，從樣本群中區(qū)分雌雄個(gè)體作為雌、雄樣本群。催產(chǎn)前，從雌、雄樣本群中各隨機(jī)抽樣3 尾，分別采集血樣，測(cè)定體質(zhì)量、全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、性腺質(zhì)量、空殼質(zhì)量和主要性激素等指標(biāo)，作為催產(chǎn)前初值。然后從雌、雄樣本群中隨機(jī)抽取雌、雄個(gè)體，按設(shè)定催產(chǎn)劑型注射催產(chǎn)劑后放入產(chǎn)卵桶的產(chǎn)卵箱內(nèi)。每個(gè)產(chǎn)卵箱放被注射激素的親魚4 組（4 雌4 雄）。

每個(gè)產(chǎn)卵桶用空壓機(jī)持續(xù)增氧，保持ρ（溶解氧）＞5 mg/L。每6～8 h 換出原裝水1/3。每3 h 觀察1 次催產(chǎn)親魚發(fā)情情況。試驗(yàn)期內(nèi)，產(chǎn)卵桶水溫28～29 ℃。

1.5 催產(chǎn)親魚血樣采集

注射催產(chǎn)劑48 h 后，未觀察到親魚發(fā)情及產(chǎn)卵。取各組催產(chǎn)雌、雄親魚分別采血樣，測(cè)定與“催產(chǎn)前”相同的性狀指標(biāo)及激素水平，比較分析不同催產(chǎn)劑的劑型對(duì)性腺及性激素水平的影響。各組催產(chǎn)后親魚先用含間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽（MS-222）麻醉8～10 min，再采用尾椎取血法采血，4 ℃靜置1 h，3 500 r/min 離心10 min，后吸取上清液保存，用于激素測(cè)定。

1.6 激素測(cè)定

用廣西君奇生物科技有限公司Elisa 酶聯(lián)免疫試劑盒，測(cè)定樣本魚血清激素水平。具體測(cè)定程序，按照試劑盒說明書。

1.7 指標(biāo)計(jì)算

計(jì)算臟體比、肥滿度（KSI）和性腺成熟系數(shù)（GSI）。計(jì)算公式如下:

式中:W——體質(zhì)量，g；

W0——空殼體質(zhì)量，g；

W1——內(nèi)臟團(tuán)質(zhì)量，g；

W2——性腺質(zhì)量，g；

L——體長(zhǎng)，cm。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（Oneway ANOVA），顯著水平為0.05。采用Origin2022繪制Pearson 相關(guān)性熱圖。試驗(yàn)結(jié)果均采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同催產(chǎn)劑對(duì)巴馬擬纓魚性腺的影響

2.1.1 性腺成熟系數(shù)

巴馬擬纓魚催產(chǎn)前和催產(chǎn)后各組親魚性腺成熟系數(shù)見圖1。由圖1 可見，雌魚催產(chǎn)前E 組GSI 為1.63%，催產(chǎn)后A、B、C、D 組GSI 分別為1.62%，1.64%，1.32%和1.54%。與催產(chǎn)前M 組相比，GSI 除B 組略微上升外，其余各組均呈下降趨勢(shì)，C 組下降幅度最大（19.02%），但差異不顯著（P＞0.05）。此外，催產(chǎn)后雌魚GSI 組間差異均不顯著（P＞0.05）；雄魚催產(chǎn)前M 組GSI 為0.03%，催產(chǎn)后A、B、C、D 組GSI 分別為0.44%，0.03%，0.04%和0.06%。與催產(chǎn)前M 組相比，除B 組外，各組雄魚催產(chǎn)后GSI 均呈上升趨勢(shì)，其中A 組上升幅度最大（136.7%），且差異顯著（P＜0.05），其余各組差異不顯著（P＞0.05）。雄魚GSI 水平，催產(chǎn)后A 組與其余各催產(chǎn)組及催產(chǎn)前M 組差異顯著（P＜0.05），B、C 和D 組間差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 不同催產(chǎn)劑注射前后各組親魚性腺成熟系數(shù)

2.1.2 性腺時(shí)相

親魚催產(chǎn)前后性腺發(fā)育時(shí)相變化見表1。由表1可見，各組雌雄魚催產(chǎn)前E 組為共同群樣本，雌魚卵巢以II 期（50%）和III 期（50%）為主，無IV 期卵巢；雄魚僅出現(xiàn)II 期精巢（100%），無III 期和IV 期精巢。催產(chǎn)后，各組雌魚均出現(xiàn)IV 期卵巢，均無V期卵巢，A、B、C 和D 組的IV 期卵巢占比分別為16.67%，22.22%，25.00%和16.67%?；贗V 期卵巢出現(xiàn)率的評(píng)價(jià)，B 和C 組的催產(chǎn)劑的劑型為較佳劑型；與催產(chǎn)前E 組相比，雄魚催產(chǎn)后僅A 組出現(xiàn)IV期精巢，占比12.50%，各組II 期精巢比例均下降，A、B、C 和D 組分別降低了50.00%，25.00%，50.00%和60.00%，組間差異不顯著?；贗V 期精巢出現(xiàn)率的評(píng)價(jià)，A 組的劑型為雄魚較佳催產(chǎn)劑的劑型。

表1 親魚催產(chǎn)前后性腺發(fā)育時(shí)相變化%

2.2 不同催產(chǎn)劑對(duì)巴馬擬纓魚性激素水平的影響

2.2.1 雌魚性激素水平

巴馬擬纓魚雌魚催產(chǎn)前后性激素變化見表2。由表2 可見，4 組雌性巴馬擬纓魚催產(chǎn)前共同樣品的雌二醇（E2）、雌三醇（E3）、雌酮（E1）和孕酮（P）含量分別為40.24，38.62 ng/L 和43.0，35.92 pmol/L。

表2 不同催產(chǎn)劑注射前后雌魚性激素水平①

（1）E2 水平:A 組、B 組、C 組和D 組分別為52.77，42.19，43.07 和42.56 ng/L，A 組最高，B 組最低，且差異顯著（P＜0.05），B 組、C 組和D 組間差異不顯著（P＞0.05）。與催產(chǎn)前比較，各組E2 含量均有所升高，其中A 組升高了31.14%，差異顯著；B組、C 組和D 組E2 與催產(chǎn)前差異不顯著。分析表明，A 組催產(chǎn)劑的劑型較有助于促進(jìn)巴馬擬纓魚雌魚體內(nèi)E2 的分泌。

（2）E3 水平:A 組、B 組、C 組和D 組分別為46.26，38.79，38.07 和37.75 ng/L，A 組最高，D 組最低，且差異顯著（P＞0.05），B 組、C 組和D 組間差異不顯著（P＞0.05）。與催產(chǎn)前比較，A 組和B 組E3 含量均有所升高，其中A 組升高了19.78%，差異顯著（P＜0.05），C 組和D 組有所降低，但差異均不顯著（P＞0.05）。分析表明，A 組催產(chǎn)劑的劑型較有助于促進(jìn)巴馬擬纓魚雌魚體內(nèi)E3 的分泌。

（3）E1 水平:A 組、B 組、C 組和D 組分別為42.64，48.50，42.84 和43.31 pmol/L，B 組最高，A 組最低，且差異顯著（P＜0.05），B 組、C 組和D 組間差異不顯著（P＞0.05）。與催產(chǎn)前比較，B 組和D 組E1均顯示升高，其中B 組升高了12.66%，差異顯著（P＜0.05），A 組和C 組有所降低，但差異均不顯著（P＞0.05）。分析表明，B 組催產(chǎn)劑的劑型較有助于促進(jìn)巴馬擬纓魚雌魚體內(nèi)E1 的分泌。

（4）P 水平:A 組、B 組、C 組和D 組分別為30.00，30.71，30.55 和33.85 pmol/L，其中D 組最高，A 組最低，但差異不顯著（P＞0.05），A 組、B 組和C 組間差異不顯著（P＞0.05）。與催產(chǎn)前比較，各組P 含量均有所降低，A 組、B 組、C 組和D 組分別降低了16.48%，14.50%，14.95%和5.76%。分析表明，4 種催產(chǎn)劑型對(duì)巴馬擬纓魚雌魚體內(nèi)P 的分泌均有一定的抑制作用。

2.2.2 雄魚性激素水平

由表2 可見，4 組雄性巴馬擬纓魚催產(chǎn)前后來自共同群體，催產(chǎn)前睪酮（T）含量為16.32 nmol/L，催產(chǎn)后A 組、B 組、C 組和D 組T 含量分別為14.85，13.41，13.64 和12.61 nmol/L，A 組最高，D 組最低。與催產(chǎn)前相比，各組雄魚催產(chǎn)后T 含量均下降，且差異性顯著（P＜0.05）。A 組、B 組、C 組和D 組分別下降了9.01%，17.83%，16.42%和22.73%，其中A組T 含量降幅最小，與其余組差異顯著（P＜0.05），D組T 含量顯著低于A 組和C 組。分析表明，這4 種催產(chǎn)劑的劑型均抑制人工養(yǎng)殖巴馬擬纓魚雄魚體內(nèi)T 的分泌，且D 組劑型抑制效果最明顯。

3 討論

3.1 催產(chǎn)劑對(duì)巴馬擬纓魚性腺發(fā)育的影響

魚類的生殖活動(dòng)受外環(huán)境因素和神經(jīng)內(nèi)分泌的雙重調(diào)節(jié)[6]。下丘腦產(chǎn)生的促性腺激素釋放激素（GnRH）作用于垂體，刺激垂體產(chǎn)生促性腺激素（GtH）作用于性腺，促使性腺組織產(chǎn)生類固醇激素，進(jìn)而引起生殖細(xì)胞的發(fā)育和成熟[7]。齊飄飄等[8]利用高溫和皮質(zhì)醇共同作用，誘導(dǎo)雌性黃顙魚雄性化。

使用外源激素可誘導(dǎo)魚類由雌性向雄性轉(zhuǎn)變，也可發(fā)生由雄性向雌性的逆轉(zhuǎn)。李廣麗等[9]常通過添加芳香化酶抑制劑和17α-甲基睪酮[10]，誘導(dǎo)赤點(diǎn)石斑魚雌魚性腺中卵細(xì)胞退化、精巢結(jié)構(gòu)發(fā)育成熟，達(dá)到促進(jìn)赤點(diǎn)石斑魚性逆轉(zhuǎn)的目的；韓建等[11]利用17α-甲基睪酮誘導(dǎo)雌性劍尾魚性逆轉(zhuǎn)；王成龍等[12]利用17-β 雌二醇誘導(dǎo)XY 黃顙魚雌性化。有研究表明，E2 在魚體性腺發(fā)育過程中對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟具有重要作用，本研究中，4 種催產(chǎn)劑均在一定程度上促進(jìn)人工養(yǎng)殖的巴馬擬纓魚雌魚卵巢卵母細(xì)胞發(fā)育，并抑制雄魚精巢的發(fā)育，這可能是因?yàn)榉枷慊复呋承┬坌约に貫榇萍に?，不利于精巢生殖?xì)胞的發(fā)育成熟[7]。郭學(xué)鳴等[13]研究表明，乙炔基雌二醇（EE2）可能通過抑制相關(guān)基因的表達(dá)和減數(shù)分裂，從而抑制斑馬魚卵子的發(fā)育和成熟。

3.2 催產(chǎn)劑對(duì)巴馬擬纓魚性激素水平的影響

文獻(xiàn)[13-14]表明，20β 雙羥孕酮（DHP）在魚類卵巢的早期發(fā)育中，卵原細(xì)胞的增殖有重要作用。文獻(xiàn)[15]表明，E2 在魚體性腺發(fā)育過程中，對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育成熟具有重要作用。洪磊等[16]研究證明，人工養(yǎng)殖美洲鰣卵巢GSI 與血漿中E2 水平，表現(xiàn)出性腺發(fā)育協(xié)同一致的變化規(guī)律。本試驗(yàn)雌魚A組催產(chǎn)劑的劑型對(duì)E2、E3 的促進(jìn)作用最優(yōu)，這可能是因?yàn)镋2 與E3 同屬性類固醇衍生物，二者的轉(zhuǎn)化生成有一定關(guān)聯(lián)。

腦下垂體和性腺是影響魚類性腺發(fā)育最重要的內(nèi)分泌腺，下丘腦分泌的LRH、垂體分泌貯存的GTH、性腺或腎上腺分泌的性激素，除了正反饋調(diào)節(jié)外，還存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制[17]。張青海等[18]在不同劑量GnRH 和DOM 對(duì)爪哇倒刺魚生殖性能的研究中發(fā)現(xiàn)，爪哇倒刺魚受精率隨著GnRH 和DOM濃度的升高而升高。徐文剛等[19]研究表明，200 IU/kg HCG 能誘導(dǎo)黑邊石斑魚排卵成功，但500 IU/kg HCG 處理排卵失敗。本試驗(yàn)中，A 組注射的（LHRH-A3+HCG+DOM）催產(chǎn)劑濃度最高，且雌魚血清中E2 和E3 水平，顯著高于催產(chǎn)前及其他催產(chǎn)組，催產(chǎn)后親魚血清中E2 和E3 含量，可能存在催產(chǎn)劑劑量依賴性。覃志彪等[20]對(duì)泥鰍注射LHRHa 后，雌魚血清中P 水平隨著時(shí)間變化，呈現(xiàn)先增再減后趨于平緩的趨勢(shì)，雄魚血清中T 水平同雌魚P 變動(dòng)趨勢(shì)一致。本試驗(yàn)各組雌魚P 水平在催產(chǎn)后72～96 h，基本與催產(chǎn)前持平，這可能是因?yàn)殡S著注射后時(shí)間的延長(zhǎng)，血漿中P 代謝降低至基礎(chǔ)水平；雄魚在72～96 h 低于催產(chǎn)前雄魚T 水平，這可能是因?yàn)門 作為芳香化酶的底物轉(zhuǎn)化為E2[21]，也可能與抽樣群體數(shù)量較少有關(guān)。

鄒忠義等[22]研究發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)大鯢的E2 含量達(dá)到一定的閾值后進(jìn)行催產(chǎn)試驗(yàn)，才能刺激其產(chǎn)卵。蔡智鳴等[23]利用DOM 對(duì)麥鯪催產(chǎn)，研究表明麥鯪的卵巢在Ⅳ期初時(shí)人工催產(chǎn)無效，只有發(fā)育到Ⅳ期期中最好是Ⅳ期期末催產(chǎn)才能成功。本試驗(yàn)在注射D 組催產(chǎn)劑后，D 組E2、E3、P 均低于其余催產(chǎn)組，說明人工養(yǎng)殖的巴馬擬纓魚雌性親本對(duì)D 組催產(chǎn)劑的劑型敏感度低于A、B、C 組。

本試驗(yàn)在巴馬擬纓魚性腺尚未完全成熟的情況下進(jìn)行試催產(chǎn)，人工注射后將親魚放置在靜水環(huán)境下，催產(chǎn)對(duì)象未產(chǎn)卵排精；在巴馬擬纓魚產(chǎn)地紅水河觀察到河水溫度低于試驗(yàn)環(huán)境，流速較高，這可能是影響巴馬擬纓魚產(chǎn)卵排精刺激的重要因素。催產(chǎn)對(duì)象精巢尚未成熟，成功的“人工繁殖”還有待進(jìn)一步研究。