虹鱒偽雄魚與正常二倍體群體血清類固醇激素含量的季節(jié)變化

谷偉，徐革鋒，戶國，黃天晴，張玉勇，白慶利，王炳謙

（中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

虹鱒Oncorhynchus mykiss是聯(lián)合國糧食與農業(yè)組織優(yōu)先推薦的世界性養(yǎng)殖魚類。虹鱒全雌三倍體是不育品種，肉品質高、養(yǎng)殖周期長，是鮭鱒魚產業(yè)的主導品種，我國年需卵量約3 000萬粒[1]。偽雄魚制備是虹鱒全雌三倍體規(guī)?；a的關鍵技術之一。虹鱒雌魚染色體型為XX，雄魚為XY型。因此，只要使雌性配子（XX）與含有X染色體的精子（XX）受精，就能大量獲得雌性后代，再通過靜水壓或水溫控制即可獲得全雌三倍體[2]。基于此目的，通過雌核發(fā)育技術獲得全雌二倍體稚魚，在魚苗開始攝取外源性營養(yǎng)階段通過給予雄性激素誘導獲得性轉換雄魚（XX）。17ɑ-甲睪酮應用最為廣泛，需控制好劑量，超量可致激素閹割[3,4]，目前已應用于生產實踐[5-7]。

性類固醇激素的分泌水平與生長、配子發(fā)生和性腺成熟有關[8-11]，測定血清性類固醇激素可了解魚類性腺發(fā)育水平，對生產安排有指導作用。硬骨魚類的生殖過程受性類固醇激素睪酮（T）、11-酮基睪酮（11-KT）和雌二醇（E2）的調節(jié)，繁殖季節(jié)雌魚T和E2、雄魚T和11-KT隨著配子形成而逐漸增加，性腺成熟之后顯著下降[12]。E2在正常雄魚的繁殖中必不可少[13]。目前，已研究了虹鱒、斜帶石斑魚Epinephelus coioides、西伯利亞鱘Acipenser baeri等多種魚類性激素水平的年變化規(guī)律[14-16]，而虹鱒偽雄魚尚未發(fā)現(xiàn)相關研究。

偽雄魚培育周期長，輸精管畸形，需要解剖魚獲取精巢使用。盲目剖魚取精觀察成熟度會導致培育成本大幅增加，造成浪費。本研究按季節(jié)測定了虹鱒偽雄魚親本血清類固醇激素水平，掌握性激素變化狀況，以期為了解偽雄魚生殖狀態(tài)和合理安排生產提供基礎技術資料。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

所選取樣本為2013年3月和2014年3月通過17ɑ-甲睪酮（sigma公司）混合飼料投喂誘導的2批偽雄魚（三、四齡魚平均體質量為2 200 g和3 056 g），以同時期培育的正常二倍體群體為對照（三、四齡平均體質量為2 510g和3 600g），經過3年培育為親本。親魚同池飼育，投喂鮭鱒親魚專用飼料（蛋白質42%，脂肪22%），日投喂量為體質量的1%～2%，日投喂2次。

1.2 組織切片

本研究選取3齡對照組與偽雄魚，每組10尾。性腺樣品采用Bouin’s液固定，常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。通過KD1508型切片機連續(xù)切片，厚度5 000～7 000nm，經H.E染色，中性樹膠封片，用自動數碼顯微攝影系統(tǒng)拍照。

1.3 血清采集及性類固醇激素的測定

每2月采集一次血樣，每次采集正常雌、雄魚、偽雄魚各10尾，每尾魚血樣單獨進行測定。采樣方法：樣本魚放入0.5 mL/L苯氧乙醇水溶液中麻醉2 min，尾靜脈采血，每尾取血量不少于5 mL。血樣在4℃冰箱中靜置2h，然后3 000 r/min離心10 min，分離出血清注入采樣管中，標明日期及性別（均有個體識別標記）。測試前血清保存在超低溫冰箱中，全部樣品集中測定性類固醇激素含量。采用DFM-96型16管放射免疫計數器測定血清中的雌二醇（E2）、睪酮（T）濃度，雙管平行測定。碘[125I]睪酮放射免疫分析藥盒和碘[125I]雌二醇放射免疫分析藥盒由天津九鼎醫(yī)學生物工程有限公司生產。

1.4 數據處理

實驗數據用平均值±標準差（mean±SD）表示，經SAS軟件進行方差分析。用DUNCAN對獲得的數據進行多重比較分析，比較結果用字母標記法，在同一系列中相同字母表示差異不顯著（P＞0.05），不同字母表示差異顯著（P＜0.05），相間字母表示差異極顯著（P＜0.01）。

2 結果與分析

2.1 偽雄魚與正常二倍體雌雄魚解剖學和組織學觀察

解剖觀察發(fā)現(xiàn)，對照組魚精巢呈長條形，性腺飽滿，為白色，血管豐富，輸精管粗壯，精液可順利排出。偽雄魚精巢呈鵝卵石形，性腺飽滿，為白色，血管豐富，輸精管細狹并有結節(jié)，精液無法排出。圖1為偽雄魚與對照組魚的性腺解剖學與組織學觀察結果。從圖1中可以看出，對照組魚的精巢為一對，呈對稱分布。偽雄魚精巢兩側不對稱，其中一側或多或少地缺失一部分。比較發(fā)現(xiàn)，偽雄魚精巢與對照組魚精巢組織細胞結構并未有明顯差異，且偽雄魚的形態(tài)與卵巢相似。

2.2 三齡偽雄魚與正常二倍體雌雄魚血清中E2和T水平的比較

由圖2可知，三齡偽雄魚與對照組魚T含量均在 12月份達到最高，偽雄（7.222±2.889）ng/mL，雄魚 （13.944±3.709）ng/mL，雌魚 （3.610±3.096）ng/mL，雄魚T含量除6月份與雌魚無顯著差異外，其余月份均顯著高于雌性親本（P＜0.05）。偽雄魚T含量4月份降到最低（0.088±0.015）ng/mL，隨后逐漸升高；雄魚和雌魚T含量8月份降到最低，分別為（0.508±0.297）ng/mL和（0.274±0.027）ng/mL。圖3為三齡偽雄魚與對照魚E2含量的周年變化。由圖3可知，對照組雌魚E2含量除12月份與偽雄魚無顯著差異外，其余一年中都顯著高于雄魚和偽雄魚（P＜0.05）；對照組雄魚和雌魚E2含量10月到最高，分別為（82.658±5.777）pg/mL和（969.390±22.561）pg/mL，偽雄魚E2含量則在12月份最高（185.735±29.978）pg/mL。

2.3 四齡偽雄魚與正常二倍體雌雄魚血清中E2和T水平的比較

由圖4可知，四齡對照組雄魚和雌魚T含量均在12月份最高，分別為（12.080±5.834）ng/mL和（2.668±0.763）ng/mL，而偽雄魚T含量則在翌年2月最高（6.109±2.153）ng/mL，8月最低（0.548±0.309）ng/mL，隨后逐漸升高；雄魚和雌魚T含量分別在4月和2月降到最低，分別為（0.244±0.103）ng/mL和（0.051±0.008）ng/mL。圖5為四齡偽雄魚與對照組E2含量的周年變化。結果顯示，對照組雌魚E2含量除12月和2月份外，一年中都顯著高于雄魚和偽雄魚；對照組雌魚E2含量8月最高（1 068.867±64.561）pg/mL，對照組雄魚E2含量10月最高（85.139±37.123）pg/mL，偽雄魚含量 E2含量則在 12月最高（326.118±13.620）pg/mL，與雌魚無顯著差異，卻顯著高于雄魚（P＜0.05）。

圖1 偽雄魚與發(fā)育正常二倍體雌雄魚的性腺比較Fig.1 The gonadal morphology of male-induced and normal diploid male and female rainbow trout

圖2 三齡偽雄魚與對照組T周年變化Fig.2 The annual changes in serum T levels in 3 years old male-induced and control rainbow trout

圖3 三齡偽雄魚與對照組E2周年變化Fig.3 The annual changes in serum E2 levels in 3 years old male-induced and control rainbow trout

圖4 四齡偽雄魚與對照組T周年變化Fig.4 The annual changes in serum T levels in 4 years old male-induced and control rainbow trout

圖5 四齡偽雄魚與對照組E2周年變化Fig.5 The annual changesin serum E2 levels in 4 years old male-induced and control rainbow trout

3 討論

性類固醇激素是一種脂溶性甾體激素，主要功能是調節(jié)促性腺激素合成與釋放，維持魚類性腺發(fā)育和排卵等生理活動[17]。本研究探討了我國重要經濟冷水性魚類虹鱒偽雄魚及二倍體血清性類固醇激素的表達變化規(guī)律和性腺特征等，為虹鱒偽雄魚親魚的人工培育和產業(yè)化應用提供了重要技術依據。

3.1 虹鱒偽雄魚性腺形態(tài)特征

有關虹鱒性腺發(fā)育模式、組織構造等研究已有大量報道[18,19]。本研究比較了偽雄魚和正常二倍體雌、雄魚的性腺組織及形態(tài)，發(fā)現(xiàn)偽雄魚精巢呈鵝卵石形，輸精管卡它性堵塞，要利用偽雄魚需要提取性腺組織，而在組織切片中可以看出偽雄魚精巢保持了雌魚性腺的分化構造。偽雄魚培育中，不能保證所有藥餌均被魚攝入，導致后代出現(xiàn)性腺未發(fā)育、性腺發(fā)育成正常雌魚等[20]。所以，正確掌握偽雄魚性腺形態(tài)，在生產中將起決定性作用。

3.2 性激素含量與性別和性腺發(fā)育的關系

性類固醇激素顯著的影響魚類的生殖過程[21,22],其分泌量可直接反映性腺發(fā)育狀況，還可通過檢測血漿性類固醇激素T的水平較早地鑒別魚的雌雄[23]。本研究通過比較分析3齡和4齡虹鱒偽雄魚、二倍體雄魚及雌魚性類固醇激素T和E2含量,結果顯示三齡偽雄魚與對照組血清T含量均在12月達到最高，偽雄魚血清T含量4月份降到最低，隨后逐漸升高，而雄魚和雌魚血清T含量8月降到最低。這也表明偽雄魚和雄魚T的變化同精巢的發(fā)育基本一致，證明了精子成熟須有較高水平的T才能完成[24]。三齡對照組雌魚血清E2含量除12月與偽雄魚無顯著差異外，其余時間都顯著高于雄魚和偽雄魚；對照組雄魚和雌魚血清E2含量10月最高，偽雄魚血清E2含量則在12月最高。三齡偽雄魚E2含量達峰時間顯著晚于對照組魚，這主要與其發(fā)育遲緩以及生理功能反轉密切相關，偽雄魚的性腺在從雌性向雄性反轉的過程中要耗費很長時間使機體適應與生理相應，因此雌二醇達峰時間相對順延了。4齡偽雄魚和對照組雌雄魚的E2含量峰值都是在它們的T含量達峰之前，這個規(guī)律一致，只是偽雄魚E2和T的含量達峰時間較晚，這主要與其性腺生理結構改變有關。周年變化規(guī)律與對照組不一致，可能主要是與偽雄魚的性腺生理機能退化有關，驗證了E2在促進性細胞成熟中的重要生理功能，與谷偉等[14]對虹鱒選育群體性類固醇激素的研究結果相一致。據此，在繁殖季節(jié)12月利用3齡偽雄魚最佳。

以往研究僅分析了初次產卵魚，而未比較分析經產魚。本研究顯示，四齡對照組雄魚和雌魚血清T含量均在12月達到最高，而偽雄魚血清T含量則在翌年2月最高，8月最低，隨后逐漸升高；四齡對照組雌魚血清E2含量除12月和2月外，一年任何時間都顯著高于雄魚和偽雄魚。偽雄魚血清E2含量則在 12月達最高（326.118±13.620）pg/mL，與雌魚無顯著差異，卻顯著高于雄魚（P＜0.05）。Fostier等[12]認為，雌雄親魚血清中T含量，是因為硬骨魚能合成T，而T可以轉變成E2。本研究中雌魚血清中T含量很高，與林浩然等[25]認為T是雌激素的前體一致。偽雄魚的E2顯著高于雄魚，認為這可能是在偽雄魚培育過程中，未完全抑制雌激素導致。本研究中，偽雄魚血清T含量最高點出現(xiàn)在翌年2月份，與生產中的情況一致，這更加證實了性類固醇激素分泌量可直接反映性腺發(fā)育狀況。因此，在繁殖季節(jié)4齡偽雄魚的最佳利用時間是在翌年2月份。

本研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒偽雄魚的性類固醇激素周年變化規(guī)律在4齡之前與對照組基本一致，但隨著時間推移，偽雄魚的性腺機能顯著退化，其性類固醇激素含量波動很大，沒有規(guī)律性，但由于遺傳及環(huán)境的作用，在生殖季節(jié)還是能產生繁殖生理反應，這些結果可作為虹鱒正常二倍體和偽雄魚親魚性腺發(fā)育成熟、有效利用的重要參考。