• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    幾個(gè)理化因素對(duì)哈維氏弧菌生物被膜形成的影響

    2019-02-22 06:46:50吳同壘王洪彬張志強(qiáng)高桂生史秋梅
    水產(chǎn)學(xué)雜志 2019年1期
    關(guān)鍵詞:弧菌菌液菌株

    吳同壘,王洪彬,張志強(qiáng),高桂生,史秋梅

    (河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 秦皇島 066604)

    中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖量占世界總量的65%,為世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)做出了重大貢獻(xiàn)[1]。2005—2015年,中國(guó)的海水養(yǎng)殖面積年均增長(zhǎng)率為3.61%,養(yǎng)殖總產(chǎn)量年均增長(zhǎng)率為3.25%[2]。隨著海水養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展,規(guī)模化、集約化程度加深,海水養(yǎng)殖的病害也逐年增加。其中由致病性弧菌引起的弧菌病一直是海水魚(yú)類(lèi)及貝類(lèi)養(yǎng)殖的“災(zāi)禍之源”[3,4]。近年來(lái),相繼有大黃魚(yú) Larimichthyscrocea、斜帶石斑魚(yú)Epinepheluscoioides、青石斑魚(yú)Epinephelus awoara等養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)及文蛤Meretrix meretrix L.、雜色鮑Haliotis diversicolor、方斑東風(fēng)螺Babylonia areolata等養(yǎng)殖軟體經(jīng)濟(jì)動(dòng)物感染哈維氏弧菌Vibrio harveyi發(fā)病死亡,給世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè),尤其是亞洲、南美洲水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,引起了養(yǎng)殖工作者的重視[5]。

    近年來(lái),水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的耐藥現(xiàn)象極為普遍,給防控細(xì)菌性疾病帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。疫苗能提高動(dòng)物機(jī)體特異性免疫水平,且符合綠色、健康的養(yǎng)殖要求[6],因此,研制新型疫苗是防控水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病的重要方向。生物被膜指細(xì)菌在代謝過(guò)程中黏附在非生物或生物基質(zhì)的表面,由自身產(chǎn)生的胞外聚合物及基質(zhì)包裹,具有三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞群體,利于細(xì)菌抵抗外界不利因素[7],具有分布廣及多重耐藥性、免疫逃避能力等特點(diǎn)。Karunasagar等[8]報(bào)道,哈維氏弧菌能在不同非生物基質(zhì)表面上形成生物被膜;Yatip等[9]研究了發(fā)酵豆制品納豆提取物對(duì)哈維氏弧菌生物被膜的抑制作用,而有關(guān)哈維氏弧菌生物被膜的其他方面研究較少。本試驗(yàn)以致病性哈維氏弧菌QHD-1菌株為研究對(duì)象,測(cè)定初始菌液濃度、溫度、pH、鹽離子濃度等環(huán)境因素對(duì)QHD-1菌株生物被膜形成能力的影響,以了解不同理化條件下哈維氏弧菌生物被膜形成規(guī)律,為探索其致病機(jī)理及防治措施奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1分離菌株由從患病大菱鲆肝臟中分離得到,經(jīng)分離純化、鑒定及動(dòng)物致病性試驗(yàn),證實(shí)其為致病性菌株?,F(xiàn)保存于本實(shí)驗(yàn)室-80℃超低溫冰箱中。

    主要試劑與儀器:胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)和胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司;結(jié)晶紫購(gòu)自天津市永大化學(xué)試劑有限公司;考馬斯亮藍(lán)G-250購(gòu)自天津市百世化工有限公司;96孔聚苯乙烯板購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自Microplate Autoreader EL311;超低溫冰箱購(gòu)自澳柯瑪股份有限責(zé)任公司;其他與本試驗(yàn)相關(guān)的試劑與儀器均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.2 方法

    1.2.1 菌株活化及菌懸液的配制

    從-80℃超低溫冰箱中,取出哈維氏弧菌QHD-1甘油凍存菌株,于TSA培養(yǎng)基上劃線(xiàn),30℃培養(yǎng);挑取單菌落接種于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%NaCl的TSB 培養(yǎng)液中,30℃培養(yǎng) 10h,6 000r/min 離心15min,收集菌體,用無(wú)菌生理鹽水清洗3次,收集細(xì)菌細(xì)胞,最后用無(wú)菌生理鹽水稀釋至終濃度為1×108cfu/mL。

    1.2.2 理化因子對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響

    生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定:在50mL TSB培養(yǎng)液中加入適量體積對(duì)數(shù)期的哈維氏弧菌QHD-1菌液,于30℃、220r/min搖床中培養(yǎng)。每隔1h取樣一次,以O(shè)D590為縱坐標(biāo),時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

    鹽離子濃度:分別配制0%~8%NaCl的TSB培養(yǎng)液,加入適量對(duì)數(shù)期哈維氏弧菌QHD-1菌液,于30℃、220r/min搖床中培養(yǎng)12 h后,取樣,測(cè)定菌液OD590。以O(shè)D590為縱坐標(biāo),鹽離子為橫坐標(biāo)繪圖。比較鹽離子濃度對(duì)哈維氏弧菌QHD-1生長(zhǎng)的影響。

    溫度:將培養(yǎng)溫度分別設(shè)為4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃,方法同 1.2.2,比較溫度對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響。

    pH:用NaOH和HCl調(diào)節(jié)TSB培養(yǎng)基pH,分別為1~10(間隔1個(gè)單位),方法同1.2.2。比較pH對(duì)哈維氏弧菌QHD-1生長(zhǎng)的影響。

    NH4+濃度:分別在培養(yǎng)基中添加(NH4)2SO4,使含量分別為0%~2.0%,方法同1.2.2。比較NH4+對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響。

    Mg2+濃度:分別在培養(yǎng)基中添加MgSO4,使其含量分別0%~8%,方法同1.2.2。比較Mg2+對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響。

    1.2.3 生物被膜的形成與測(cè)定

    哈維氏弧菌生物被膜的形成與定量測(cè)定參考文獻(xiàn)[10]中報(bào)道的方法進(jìn)行,并略加改動(dòng)。在96孔聚苯乙烯板每孔中加入TSB培養(yǎng)液150μL,加入菌液(濃度1×108cfu/mL)50 μL;將96孔聚苯乙烯板置于濕盒中,30℃中孵育16h;每組做5個(gè)平行孔,以TSB培養(yǎng)基為空白對(duì)照;吸出孔內(nèi)菌液,生理鹽水沖洗3次,去除游離細(xì)菌;將聚苯乙烯孔板干燥固定30min。每孔加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的結(jié)晶紫200μL,常溫下放置10min后吸出染液;用生理鹽水洗板孔3次,干燥;于每孔中加入體積分?jǐn)?shù)為33%的乙酸200μL,溶解結(jié)晶紫,利用酶標(biāo)儀測(cè)定OD590。

    1.2.4 初始菌液濃度對(duì)哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響

    將QHD-1濃度調(diào)至1.0×109cfu/mL,依次倍比稀釋?zhuān)玫骄鷳乙簼舛葹?.0×108~1.0×102cfu/mL,培養(yǎng)方法同1.2.2。

    將孵育溫度設(shè)定為 4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃,pH 為 2~10,NaCl濃度為0%~9%,培養(yǎng)方法同1.2.2。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    結(jié)果以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示(x±s),用excel、SPSS19.0軟件進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 分離菌株QHD-1生長(zhǎng)曲線(xiàn)

    由圖1可知,在30℃時(shí),該菌很快進(jìn)入快速生長(zhǎng)階段,從第1h到8h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,而后在一段時(shí)間內(nèi)維持在較高水平,即穩(wěn)定期,從第9h后進(jìn)入衰退期。

    圖1 V.harveyi QHD-1生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.1 Growth curve of V.harveyi QHD-1

    2.2 不同理化因子對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響

    2.2.1 鹽離子濃度對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響

    由圖2可知,鹽離子濃度為0%~6%時(shí),菌株的生長(zhǎng)速度不同:鹽離子濃度在1%~7%之間時(shí),培養(yǎng)12h后培養(yǎng)液達(dá)到較高的濃度,尤以3%鹽離子濃度時(shí),QHD-1生長(zhǎng)最快;鹽離子濃度在7%~8%之間時(shí),QHD-1濃度較低,而鹽離子濃度為8%時(shí),菌株QHD-1只有少量生長(zhǎng)。這說(shuō)明鹽離子濃度不同對(duì)菌株QHD-1生長(zhǎng)的影響不同。

    圖2 鹽離子濃度對(duì)V.harveyi QHD-1生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of salt ion concentration on the growth of V.harveyi QHD-1

    2.2.2 溫度對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響

    由圖3可知,哈維氏弧菌QHD-1在15~35℃范圍內(nèi),生長(zhǎng)良好;在25℃、30℃和35℃中培養(yǎng)12h后,菌液濃度較高,但差異不顯著;溫度為10℃培養(yǎng)12h,菌株QHD-1生長(zhǎng)較緩,在4℃下培養(yǎng)12h,菌株QHD-1不生長(zhǎng)。這說(shuō)明溫度影響哈維氏弧菌菌株QHD-1的生長(zhǎng)。

    圖3 溫度對(duì)V.harveyi QHD-1生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of temperature on the growth of V.harveyi QHD-1

    2.2.3 pH對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響

    由圖4可知,不同pH對(duì)哈維氏弧菌QHD-1的生長(zhǎng)影響差異較明顯。當(dāng)pH在6~9之間時(shí),菌株生長(zhǎng)良好;在pH<4或pH>10時(shí),菌株生長(zhǎng)較緩,甚至不生長(zhǎng)。

    圖4 pH對(duì)V.harveyi QHD-1生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of pH value on the growth of V.harveyi QHD-1

    2.2.4 NH4+對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響

    結(jié)果顯示,不同NH4+含量對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響不同。當(dāng) TSB培養(yǎng)基中添加(NH4)2SO4時(shí),NH4+促進(jìn)了菌株QHD-1的生長(zhǎng);當(dāng)(NH4)2SO4含量為0.05%時(shí),促生長(zhǎng)作用最佳。這說(shuō)明NH4+能促進(jìn)哈維氏弧菌QHD-1的生長(zhǎng)。

    2.2.5 Mg2+對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響

    結(jié)果顯示,不同Mg2+含量對(duì)菌株QHD-1生長(zhǎng)的影響不同。當(dāng)Mg2+含量在0%~8%之間時(shí),均能促進(jìn)菌株QHD-1的生長(zhǎng),尤其是Mg2+含量為1%時(shí),對(duì)菌株QHD-1促生長(zhǎng)作用最明顯。這說(shuō)明Mg2+能促進(jìn)哈維氏弧菌QHD-1的生長(zhǎng)。

    2.3 培養(yǎng)條件對(duì)哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物被膜的影響

    2.3.1 初始菌液濃度對(duì)哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響

    由圖5可知,菌液濃度為1.0×102~1.0×109cfu/mL時(shí),生物被膜形成量逐漸升高;當(dāng)菌液濃度<1.0×107cfu/mL時(shí),生物被膜形成量少;初始菌液濃度低于該濃度時(shí),生物被膜的形成量之間無(wú)顯著差異;當(dāng)初始菌濃度達(dá)到1.0×108cfu/mL~1.0×109cfu/mL時(shí),細(xì)菌生物被膜成膜量顯著增加,與其他初始菌濃度下的生物被膜形成量差異極顯著(P<0.01)。這說(shuō)明初始菌液濃度影響菌株生物被膜的形成。

    2.3.2 不同溫度對(duì)哈維氏弧菌成膜的影響

    由圖6可知,當(dāng)培養(yǎng)溫度在4~20℃之間時(shí),菌株QHD-1生物被膜形成量較低;當(dāng)培養(yǎng)溫度在25~35℃之間時(shí),菌株生物被膜形成量較高,且維持較高水平;30℃時(shí),菌株QHD-1生物被膜形成量達(dá)峰值,與其他溫度下菌株生物被膜形成量差異極顯著(P<0.01);當(dāng)溫度為40℃時(shí),生物被膜形成量較低。

    圖5 初始菌液濃度對(duì)哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響Fig.5 Effect of initial bacterial concentration on the biofilm formation of V.harveyi QHD-1

    圖6 培養(yǎng)溫度對(duì)哈維氏弧菌成膜形成的影響Fig.6 Effect of incubation temperature on the film formation of V.harveyi QHD-1

    2.3.3 pH對(duì)哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響

    由圖7可知,當(dāng)pH為7~8時(shí),菌株QHD-1生物被膜形成量最大,與其他組差異顯著(P<0.05);當(dāng)pH<4時(shí),菌株QHD-1生物被膜的形成量較低;而當(dāng)pH升高到5~9時(shí),則逐漸升高,pH為8時(shí),形成量最大。這說(shuō)明pH影響菌株QHD-1生物被膜的形成。

    圖7 pH對(duì)V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響Fig.7 Effect of pH value on the biofilm formation of V.harveyi QHD-1

    2.3.4 鹽離子濃度對(duì)哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響

    由圖8可知,當(dāng)NaCl含量在1%~5%時(shí),該菌生物被膜形成量逐漸增加,且NaCl濃度在5%時(shí),生物被膜形成量最大,與其他NaCl含量生物被膜的形成量差異極顯著(P<0.01);當(dāng)NaCl含量>5%時(shí),菌株QHD-1生物被膜形成量下降;NaCl含量在0%和8%時(shí),菌株QHD-1幾乎不形成生物被膜。

    圖8 鹽離子濃度對(duì)V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響Fig.8 Effect of salt ion concentration on the formation of V.harveyi QHD-1 biofilm

    3 討論

    引起魚(yú)類(lèi)疾病的原因有很多,主要包括環(huán)境、傳染性病原等,如病毒、寄生蟲(chóng)、細(xì)菌等[11]。一些致病性弧菌引起的細(xì)菌病在水產(chǎn)養(yǎng)殖中頻發(fā),給海水養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

    生物被膜形成能力是細(xì)菌致病性和耐藥性強(qiáng)弱的重要影響因素。生物被膜的形成是個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程,不同階段生化特性不同,且受多種因素的影響[12,13]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1能形成生物被膜,且受多種因素的影響,其中與起始菌液濃度關(guān)系最密切。當(dāng)菌液濃度在1.0×102~1.0×107cfu/mL時(shí),對(duì)該菌生物被膜的形成量影響不大,原因可能與游離菌密度較低時(shí),細(xì)菌初期黏附在聚苯乙烯板上的細(xì)菌量少有關(guān);當(dāng)菌液濃度為1.0×108~1.0×109cfu/mL時(shí),生物被膜形成量較大,與李海平等[14]研究結(jié)果一致。陳強(qiáng)等[15]的研究結(jié)果也表明細(xì)菌的粘附量與菌液濃度關(guān)系密切,且呈正比關(guān)系。因此,可認(rèn)為細(xì)菌黏附促進(jìn)了其生物被膜的形成,而細(xì)菌的黏附量會(huì)隨著菌液濃度的升高而增加。細(xì)菌起始濃度高有利于生物被膜的形成,溫度也影響細(xì)菌生物被膜的形成。本研究中,在 4℃、10℃、40℃時(shí),菌株 V.harveyi QHD-1 生物被膜形成量較少,25~35℃之間是形成生物被膜的最適溫度,與菌株V.harveyi QHD-1的最適生長(zhǎng)溫度接近,這表明哈維氏弧菌在活力最好時(shí)形成生物被膜最強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,pH為2~10時(shí),哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1菌株均能形成生物膜,而pH8時(shí),形成的生物膜量最大,這與李海平等[14]研究結(jié)果一致。滲透壓顯著影響生物被膜的形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%~8%時(shí),均可形成生物被膜;當(dāng)NaCl含量在0時(shí),幾乎不能形成生物被膜,這與李海平等[14]研究結(jié)果一致。鄢慶枇等[16]、尹清干等[13]研究發(fā)現(xiàn),NaCl濃度為0時(shí),細(xì)菌形成生物被膜的效果很差,可能與細(xì)菌在介質(zhì)上粘附量有關(guān)。黏附是細(xì)菌成膜的第一步,無(wú)法黏附在基質(zhì)上就難以形成生物被膜;當(dāng)NaCl濃度過(guò)高時(shí),抑制細(xì)菌形成生物被膜的原因可能是細(xì)菌受到環(huán)境生存壓力較大,影響了細(xì)菌的生長(zhǎng)。

    綜上所述,哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1形成生物膜與外界環(huán)境因子變化關(guān)系密切,而初始菌液濃度、溫度、pH、鹽度等各種環(huán)境因子均能顯著影響哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物被膜的形成。

    猜你喜歡
    弧菌菌液菌株
    菌株ZYRH-19的篩選鑒定及其合成韋蘭膠的特性研究
    灰樹(shù)花工廠化瓶栽菌株篩選試驗(yàn)
    食用菌(2023年6期)2023-11-28 06:03:32
    銷(xiāo)量增長(zhǎng)200倍!“弧菌克星”風(fēng)靡行業(yè),3天殺滅98%弧菌
    多糖微生物菌液對(duì)油菜吸收養(yǎng)分和土壤氮磷淋失的影響
    菌株出馬讓畜禽污染物變廢為寶
    副溶血弧菌檢測(cè)方法的研究進(jìn)展
    Bonfire Night
    鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中通過(guò)吸光度值測(cè)定菌液濃度的方法研究
    如何有效防控對(duì)蝦養(yǎng)殖中的弧菌病
    復(fù)合微生物菌液對(duì)黃瓜生長(zhǎng)和抗病蟲(chóng)性效應(yīng)研究
    上海蔬菜(2015年2期)2015-12-26 05:03:40
    九九热线精品视视频播放| 麻豆国产97在线/欧美| 天堂√8在线中文| 深爱激情五月婷婷| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲第一电影网av| 欧美人与善性xxx| 日本黄色视频三级网站网址| 在线观看一区二区三区| 露出奶头的视频| 亚洲无线在线观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 日韩精品中文字幕看吧| 国产一区二区三区av在线 | 少妇的逼好多水| 国产成人a∨麻豆精品| 午夜激情福利司机影院| 免费一级毛片在线播放高清视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 神马国产精品三级电影在线观看| 天堂√8在线中文| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 免费一级毛片在线播放高清视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 免费av毛片视频| 男女之事视频高清在线观看| 免费看av在线观看网站| 国产午夜精品论理片| 亚洲电影在线观看av| 欧美bdsm另类| 日韩av在线大香蕉| 成人亚洲精品av一区二区| 国产大屁股一区二区在线视频| 亚洲精品456在线播放app| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 成人三级黄色视频| 日本五十路高清| www日本黄色视频网| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲自偷自拍三级| 日韩强制内射视频| 日本免费a在线| 最近视频中文字幕2019在线8| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| av在线观看视频网站免费| 国产精品一区二区性色av| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 午夜a级毛片| 日韩欧美免费精品| 国产麻豆成人av免费视频| 国产大屁股一区二区在线视频| 免费无遮挡裸体视频| 国产真实伦视频高清在线观看| 久久精品综合一区二区三区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日韩大尺度精品在线看网址| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲最大成人手机在线| 成人综合一区亚洲| 亚洲成人久久性| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲精品影视一区二区三区av| 免费看日本二区| 免费av观看视频| 亚洲成人久久性| 精品午夜福利在线看| 97热精品久久久久久| 亚洲av不卡在线观看| 久久久久久久久久成人| 日本色播在线视频| 69av精品久久久久久| 性欧美人与动物交配| 免费av观看视频| 久久精品人妻少妇| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 99久久精品一区二区三区| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲av熟女| 免费看av在线观看网站| 色综合色国产| 久久久成人免费电影| 欧美激情在线99| 一级av片app| 国产伦一二天堂av在线观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 欧美另类亚洲清纯唯美| 九九在线视频观看精品| 97超视频在线观看视频| 午夜爱爱视频在线播放| 欧美日本视频| 午夜福利在线在线| 乱人视频在线观看| 久99久视频精品免费| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 寂寞人妻少妇视频99o| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产69精品久久久久777片| 少妇的逼水好多| 日韩一本色道免费dvd| 少妇的逼好多水| 亚洲国产精品成人久久小说 | 一区二区三区高清视频在线| 嫩草影院精品99| 三级毛片av免费| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 日韩欧美 国产精品| 少妇的逼好多水| 国产人妻一区二区三区在| 99热精品在线国产| 又粗又爽又猛毛片免费看| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 看十八女毛片水多多多| 久久久久久久久久黄片| 亚洲最大成人手机在线| 午夜日韩欧美国产| 精华霜和精华液先用哪个| 观看美女的网站| 又爽又黄无遮挡网站| 一个人看视频在线观看www免费| 日韩欧美精品v在线| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 国产私拍福利视频在线观看| 国产真实乱freesex| 免费人成在线观看视频色| 91久久精品电影网| 观看美女的网站| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 久久精品国产自在天天线| 天天躁日日操中文字幕| 国产色婷婷99| 欧美日本亚洲视频在线播放| 观看美女的网站| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产黄片美女视频| 亚洲精品色激情综合| 在线免费十八禁| 99久久精品一区二区三区| 日日啪夜夜撸| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 老司机福利观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 一本一本综合久久| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲最大成人手机在线| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 久久亚洲精品不卡| 国产亚洲精品久久久com| 国产探花在线观看一区二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 久久精品国产亚洲av天美| 高清午夜精品一区二区三区 | 久久久国产成人免费| 可以在线观看毛片的网站| 97碰自拍视频| 久久韩国三级中文字幕| 欧美一级a爱片免费观看看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 乱人视频在线观看| 国产在视频线在精品| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| av免费在线看不卡| 热99re8久久精品国产| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲精品成人久久久久久| 久久韩国三级中文字幕| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 人人妻人人澡欧美一区二区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲成人久久性| 中文字幕熟女人妻在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 大型黄色视频在线免费观看| 69人妻影院| 在线播放国产精品三级| 波多野结衣高清无吗| 一个人免费在线观看电影| 成年av动漫网址| 国产视频一区二区在线看| 国产男人的电影天堂91| 一级av片app| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 在线免费观看不下载黄p国产| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 免费av毛片视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 午夜免费男女啪啪视频观看 | av在线老鸭窝| 成人三级黄色视频| 国产片特级美女逼逼视频| 99久久精品一区二区三区| 午夜福利18| 中国美女看黄片| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲精品亚洲一区二区| 国产成人a∨麻豆精品| 黄色欧美视频在线观看| 欧美bdsm另类| 久久精品夜色国产| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲高清免费不卡视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 美女大奶头视频| 97热精品久久久久久| 99久久精品一区二区三区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 欧美色视频一区免费| 中国美白少妇内射xxxbb| 草草在线视频免费看| 日韩亚洲欧美综合| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 成人永久免费在线观看视频| 国产成年人精品一区二区| 久久人人爽人人片av| 黄色一级大片看看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 中文字幕免费在线视频6| 寂寞人妻少妇视频99o| 18禁在线播放成人免费| 99久久成人亚洲精品观看| 久久热精品热| 日韩高清综合在线| 国产成人一区二区在线| 亚洲av成人av| 国产精品久久电影中文字幕| 国产高潮美女av| 九色成人免费人妻av| 韩国av在线不卡| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产成人福利小说| 如何舔出高潮| 中文字幕av成人在线电影| 一个人免费在线观看电影| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产av在哪里看| 国产精品久久视频播放| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲综合色惰| 久久草成人影院| 亚洲欧美精品自产自拍| 搡老妇女老女人老熟妇| av专区在线播放| 五月伊人婷婷丁香| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲综合色惰| 91精品国产九色| 日本-黄色视频高清免费观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲在线自拍视频| 精华霜和精华液先用哪个| 国产欧美日韩一区二区精品| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 久久久成人免费电影| 热99re8久久精品国产| 国语自产精品视频在线第100页| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲成人久久性| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 青春草视频在线免费观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产片特级美女逼逼视频| 黄色配什么色好看| 亚洲最大成人av| 亚洲第一电影网av| 一级a爱片免费观看的视频| 日本欧美国产在线视频| 白带黄色成豆腐渣| 偷拍熟女少妇极品色| 成人美女网站在线观看视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 99热6这里只有精品| 国产高清不卡午夜福利| 我要搜黄色片| 日韩一区二区视频免费看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲专区国产一区二区| 男女之事视频高清在线观看| 99久久精品一区二区三区| 久久久成人免费电影| 桃色一区二区三区在线观看| 国产高潮美女av| 毛片一级片免费看久久久久| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久久精品94久久精品| 亚洲av成人精品一区久久| 2021天堂中文幕一二区在线观| 给我免费播放毛片高清在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲av免费在线观看| 三级毛片av免费| 全区人妻精品视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产精品不卡视频一区二区| АⅤ资源中文在线天堂| 国产色爽女视频免费观看| www日本黄色视频网| 亚洲人与动物交配视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲精品影视一区二区三区av| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 男女下面进入的视频免费午夜| 热99re8久久精品国产| 国产精品久久久久久久电影| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久久久精品国产欧美久久久| av在线观看视频网站免费| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲丝袜综合中文字幕| 此物有八面人人有两片| 在线观看午夜福利视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 村上凉子中文字幕在线| 国产成人aa在线观看| 欧美区成人在线视频| 69人妻影院| 麻豆一二三区av精品| 日韩三级伦理在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| av国产免费在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 熟女电影av网| 午夜福利在线观看吧| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 午夜a级毛片| 久久九九热精品免费| 色综合色国产| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲在线观看片| 欧美日韩精品成人综合77777| 成人av在线播放网站| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 69av精品久久久久久| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲av美国av| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产 一区精品| 在线免费十八禁| 精品不卡国产一区二区三区| 露出奶头的视频| 国产综合懂色| 国产一区二区三区av在线 | 久久久a久久爽久久v久久| 国产一区二区三区av在线 | 一级毛片aaaaaa免费看小| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 日本黄色片子视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲国产色片| 婷婷精品国产亚洲av| а√天堂www在线а√下载| 天堂影院成人在线观看| 日韩精品有码人妻一区| 午夜激情欧美在线| 又粗又爽又猛毛片免费看| 天天躁日日操中文字幕| 国内精品一区二区在线观看| 波多野结衣高清作品| 久久精品国产亚洲av天美| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 人妻少妇偷人精品九色| 国产精品综合久久久久久久免费| 俺也久久电影网| 亚洲专区国产一区二区| а√天堂www在线а√下载| 97超碰精品成人国产| 欧美精品国产亚洲| 99热精品在线国产| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 亚洲精品456在线播放app| 午夜影院日韩av| 国产片特级美女逼逼视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 免费搜索国产男女视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 丰满乱子伦码专区| 成人综合一区亚洲| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 高清毛片免费看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美成人精品欧美一级黄| av天堂在线播放| 免费在线观看成人毛片| 身体一侧抽搐| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美3d第一页| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产麻豆成人av免费视频| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 91狼人影院| 久久久久久国产a免费观看| 青春草视频在线免费观看| 日本 av在线| 一级av片app| 日韩一本色道免费dvd| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 91久久精品国产一区二区成人| 天天一区二区日本电影三级| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲欧美日韩东京热| 男女边吃奶边做爰视频| 97超碰精品成人国产| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久久欧美国产精品| 久久精品影院6| 成人综合一区亚洲| 床上黄色一级片| 观看免费一级毛片| 色吧在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 最近2019中文字幕mv第一页| 中文亚洲av片在线观看爽| 69av精品久久久久久| 免费无遮挡裸体视频| 观看美女的网站| 国产精品99久久久久久久久| 日韩欧美免费精品| 婷婷亚洲欧美| 一夜夜www| 日韩一区二区视频免费看| 长腿黑丝高跟| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 天堂动漫精品| 99热这里只有是精品50| 国产黄a三级三级三级人| 看片在线看免费视频| 亚洲熟妇熟女久久| 欧美高清成人免费视频www| 欧美精品国产亚洲| 成人欧美大片| a级毛片a级免费在线| 波多野结衣巨乳人妻| 麻豆国产97在线/欧美| 国产伦精品一区二区三区四那| 男女边吃奶边做爰视频| 麻豆一二三区av精品| 欧美性猛交黑人性爽| 国产av麻豆久久久久久久| 成年女人永久免费观看视频| 欧美高清成人免费视频www| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 国产单亲对白刺激| 久久人人精品亚洲av| 欧美成人免费av一区二区三区| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲av不卡在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 人妻久久中文字幕网| 国产一区二区在线观看日韩| 日韩欧美国产在线观看| 在线免费观看的www视频| 久久久精品大字幕| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产av麻豆久久久久久久| 有码 亚洲区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 看黄色毛片网站| 精品午夜福利在线看| 99热精品在线国产| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 精品人妻熟女av久视频| av中文乱码字幕在线| 国产单亲对白刺激| 色综合亚洲欧美另类图片| 级片在线观看| 国产亚洲91精品色在线| 在线国产一区二区在线| 嫩草影院新地址| 一个人看视频在线观看www免费| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲国产精品合色在线| 97热精品久久久久久| 亚洲av五月六月丁香网| videossex国产| 99久久九九国产精品国产免费| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美日韩综合久久久久久| 最近手机中文字幕大全| 国内精品美女久久久久久| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产高清激情床上av| 天堂网av新在线| 十八禁网站免费在线| 久久亚洲国产成人精品v| 91在线精品国自产拍蜜月| 波野结衣二区三区在线| 久久九九热精品免费| 国产乱人视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 婷婷色综合大香蕉| 国产在视频线在精品| 天堂动漫精品| 国产激情偷乱视频一区二区| 免费大片18禁| 亚洲性久久影院| 国产精品久久视频播放| 1000部很黄的大片| 久久久国产成人精品二区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产色爽女视频免费观看| 露出奶头的视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 在线观看午夜福利视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品无大码| 国产精品久久久久久久久免| 精品乱码久久久久久99久播| 啦啦啦韩国在线观看视频| 日韩强制内射视频| h日本视频在线播放| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产高清视频在线播放一区| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 99久国产av精品| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 高清日韩中文字幕在线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日韩欧美免费精品| 中文亚洲av片在线观看爽| 美女 人体艺术 gogo| 国产一区二区三区av在线 | 成人特级黄色片久久久久久久| 在现免费观看毛片| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 91精品国产九色| www.色视频.com| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 中国国产av一级| h日本视频在线播放| 能在线免费观看的黄片| 国产精品一区二区性色av| 成人二区视频| 香蕉av资源在线| 成人欧美大片| 亚洲av一区综合| 精品福利观看| 成人av在线播放网站| 婷婷色综合大香蕉| 观看免费一级毛片| 成人漫画全彩无遮挡| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 最近在线观看免费完整版| 无遮挡黄片免费观看| 中文字幕免费在线视频6| 久久久久久久久大av| 少妇的逼水好多| 免费看美女性在线毛片视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产亚洲av嫩草精品影院| 蜜臀久久99精品久久宅男| 日韩欧美国产在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲色图av天堂| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 一a级毛片在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 日韩欧美免费精品| 成人亚洲欧美一区二区av| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产伦精品一区二区三区视频9| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日本免费a在线| 免费av不卡在线播放| 久久人人爽人人片av| 日韩中字成人| 久久久久久久久久久丰满| 成年女人永久免费观看视频| 国产黄片美女视频| 久久久色成人| 日韩中字成人| 国产精品野战在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲精品456在线播放app| 97超视频在线观看视频|