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    幾個(gè)理化因素對(duì)哈維氏弧菌生物被膜形成的影響

    2019-02-22 06:46:50吳同壘王洪彬張志強(qiáng)高桂生史秋梅
    水產(chǎn)學(xué)雜志 2019年1期
    關(guān)鍵詞:弧菌菌液菌株

    吳同壘,王洪彬,張志強(qiáng),高桂生,史秋梅

    (河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 秦皇島 066604)

    中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖量占世界總量的65%,為世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)做出了重大貢獻(xiàn)[1]。2005—2015年,中國(guó)的海水養(yǎng)殖面積年均增長(zhǎng)率為3.61%,養(yǎng)殖總產(chǎn)量年均增長(zhǎng)率為3.25%[2]。隨著海水養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展,規(guī)模化、集約化程度加深,海水養(yǎng)殖的病害也逐年增加。其中由致病性弧菌引起的弧菌病一直是海水魚(yú)類(lèi)及貝類(lèi)養(yǎng)殖的“災(zāi)禍之源”[3,4]。近年來(lái),相繼有大黃魚(yú) Larimichthyscrocea、斜帶石斑魚(yú)Epinepheluscoioides、青石斑魚(yú)Epinephelus awoara等養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)及文蛤Meretrix meretrix L.、雜色鮑Haliotis diversicolor、方斑東風(fēng)螺Babylonia areolata等養(yǎng)殖軟體經(jīng)濟(jì)動(dòng)物感染哈維氏弧菌Vibrio harveyi發(fā)病死亡,給世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè),尤其是亞洲、南美洲水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,引起了養(yǎng)殖工作者的重視[5]。

    近年來(lái),水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌的耐藥現(xiàn)象極為普遍,給防控細(xì)菌性疾病帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。疫苗能提高動(dòng)物機(jī)體特異性免疫水平,且符合綠色、健康的養(yǎng)殖要求[6],因此,研制新型疫苗是防控水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病的重要方向。生物被膜指細(xì)菌在代謝過(guò)程中黏附在非生物或生物基質(zhì)的表面,由自身產(chǎn)生的胞外聚合物及基質(zhì)包裹,具有三維結(jié)構(gòu)的細(xì)胞群體,利于細(xì)菌抵抗外界不利因素[7],具有分布廣及多重耐藥性、免疫逃避能力等特點(diǎn)。Karunasagar等[8]報(bào)道,哈維氏弧菌能在不同非生物基質(zhì)表面上形成生物被膜;Yatip等[9]研究了發(fā)酵豆制品納豆提取物對(duì)哈維氏弧菌生物被膜的抑制作用,而有關(guān)哈維氏弧菌生物被膜的其他方面研究較少。本試驗(yàn)以致病性哈維氏弧菌QHD-1菌株為研究對(duì)象,測(cè)定初始菌液濃度、溫度、pH、鹽離子濃度等環(huán)境因素對(duì)QHD-1菌株生物被膜形成能力的影響,以了解不同理化條件下哈維氏弧菌生物被膜形成規(guī)律,為探索其致病機(jī)理及防治措施奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1分離菌株由從患病大菱鲆肝臟中分離得到,經(jīng)分離純化、鑒定及動(dòng)物致病性試驗(yàn),證實(shí)其為致病性菌株?,F(xiàn)保存于本實(shí)驗(yàn)室-80℃超低溫冰箱中。

    主要試劑與儀器:胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)和胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司;結(jié)晶紫購(gòu)自天津市永大化學(xué)試劑有限公司;考馬斯亮藍(lán)G-250購(gòu)自天津市百世化工有限公司;96孔聚苯乙烯板購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自Microplate Autoreader EL311;超低溫冰箱購(gòu)自澳柯瑪股份有限責(zé)任公司;其他與本試驗(yàn)相關(guān)的試劑與儀器均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

    1.2 方法

    1.2.1 菌株活化及菌懸液的配制

    從-80℃超低溫冰箱中,取出哈維氏弧菌QHD-1甘油凍存菌株,于TSA培養(yǎng)基上劃線(xiàn),30℃培養(yǎng);挑取單菌落接種于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%NaCl的TSB 培養(yǎng)液中,30℃培養(yǎng) 10h,6 000r/min 離心15min,收集菌體,用無(wú)菌生理鹽水清洗3次,收集細(xì)菌細(xì)胞,最后用無(wú)菌生理鹽水稀釋至終濃度為1×108cfu/mL。

    1.2.2 理化因子對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響

    生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定:在50mL TSB培養(yǎng)液中加入適量體積對(duì)數(shù)期的哈維氏弧菌QHD-1菌液,于30℃、220r/min搖床中培養(yǎng)。每隔1h取樣一次,以O(shè)D590為縱坐標(biāo),時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

    鹽離子濃度:分別配制0%~8%NaCl的TSB培養(yǎng)液,加入適量對(duì)數(shù)期哈維氏弧菌QHD-1菌液,于30℃、220r/min搖床中培養(yǎng)12 h后,取樣,測(cè)定菌液OD590。以O(shè)D590為縱坐標(biāo),鹽離子為橫坐標(biāo)繪圖。比較鹽離子濃度對(duì)哈維氏弧菌QHD-1生長(zhǎng)的影響。

    溫度:將培養(yǎng)溫度分別設(shè)為4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃,方法同 1.2.2,比較溫度對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響。

    pH:用NaOH和HCl調(diào)節(jié)TSB培養(yǎng)基pH,分別為1~10(間隔1個(gè)單位),方法同1.2.2。比較pH對(duì)哈維氏弧菌QHD-1生長(zhǎng)的影響。

    NH4+濃度:分別在培養(yǎng)基中添加(NH4)2SO4,使含量分別為0%~2.0%,方法同1.2.2。比較NH4+對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響。

    Mg2+濃度:分別在培養(yǎng)基中添加MgSO4,使其含量分別0%~8%,方法同1.2.2。比較Mg2+對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響。

    1.2.3 生物被膜的形成與測(cè)定

    哈維氏弧菌生物被膜的形成與定量測(cè)定參考文獻(xiàn)[10]中報(bào)道的方法進(jìn)行,并略加改動(dòng)。在96孔聚苯乙烯板每孔中加入TSB培養(yǎng)液150μL,加入菌液(濃度1×108cfu/mL)50 μL;將96孔聚苯乙烯板置于濕盒中,30℃中孵育16h;每組做5個(gè)平行孔,以TSB培養(yǎng)基為空白對(duì)照;吸出孔內(nèi)菌液,生理鹽水沖洗3次,去除游離細(xì)菌;將聚苯乙烯孔板干燥固定30min。每孔加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的結(jié)晶紫200μL,常溫下放置10min后吸出染液;用生理鹽水洗板孔3次,干燥;于每孔中加入體積分?jǐn)?shù)為33%的乙酸200μL,溶解結(jié)晶紫,利用酶標(biāo)儀測(cè)定OD590。

    1.2.4 初始菌液濃度對(duì)哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響

    將QHD-1濃度調(diào)至1.0×109cfu/mL,依次倍比稀釋?zhuān)玫骄鷳乙簼舛葹?.0×108~1.0×102cfu/mL,培養(yǎng)方法同1.2.2。

    將孵育溫度設(shè)定為 4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃,pH 為 2~10,NaCl濃度為0%~9%,培養(yǎng)方法同1.2.2。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    結(jié)果以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示(x±s),用excel、SPSS19.0軟件進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 分離菌株QHD-1生長(zhǎng)曲線(xiàn)

    由圖1可知,在30℃時(shí),該菌很快進(jìn)入快速生長(zhǎng)階段,從第1h到8h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,而后在一段時(shí)間內(nèi)維持在較高水平,即穩(wěn)定期,從第9h后進(jìn)入衰退期。

    圖1 V.harveyi QHD-1生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.1 Growth curve of V.harveyi QHD-1

    2.2 不同理化因子對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響

    2.2.1 鹽離子濃度對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響

    由圖2可知,鹽離子濃度為0%~6%時(shí),菌株的生長(zhǎng)速度不同:鹽離子濃度在1%~7%之間時(shí),培養(yǎng)12h后培養(yǎng)液達(dá)到較高的濃度,尤以3%鹽離子濃度時(shí),QHD-1生長(zhǎng)最快;鹽離子濃度在7%~8%之間時(shí),QHD-1濃度較低,而鹽離子濃度為8%時(shí),菌株QHD-1只有少量生長(zhǎng)。這說(shuō)明鹽離子濃度不同對(duì)菌株QHD-1生長(zhǎng)的影響不同。

    圖2 鹽離子濃度對(duì)V.harveyi QHD-1生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of salt ion concentration on the growth of V.harveyi QHD-1

    2.2.2 溫度對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響

    由圖3可知,哈維氏弧菌QHD-1在15~35℃范圍內(nèi),生長(zhǎng)良好;在25℃、30℃和35℃中培養(yǎng)12h后,菌液濃度較高,但差異不顯著;溫度為10℃培養(yǎng)12h,菌株QHD-1生長(zhǎng)較緩,在4℃下培養(yǎng)12h,菌株QHD-1不生長(zhǎng)。這說(shuō)明溫度影響哈維氏弧菌菌株QHD-1的生長(zhǎng)。

    圖3 溫度對(duì)V.harveyi QHD-1生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of temperature on the growth of V.harveyi QHD-1

    2.2.3 pH對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響

    由圖4可知,不同pH對(duì)哈維氏弧菌QHD-1的生長(zhǎng)影響差異較明顯。當(dāng)pH在6~9之間時(shí),菌株生長(zhǎng)良好;在pH<4或pH>10時(shí),菌株生長(zhǎng)較緩,甚至不生長(zhǎng)。

    圖4 pH對(duì)V.harveyi QHD-1生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of pH value on the growth of V.harveyi QHD-1

    2.2.4 NH4+對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響

    結(jié)果顯示,不同NH4+含量對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響不同。當(dāng) TSB培養(yǎng)基中添加(NH4)2SO4時(shí),NH4+促進(jìn)了菌株QHD-1的生長(zhǎng);當(dāng)(NH4)2SO4含量為0.05%時(shí),促生長(zhǎng)作用最佳。這說(shuō)明NH4+能促進(jìn)哈維氏弧菌QHD-1的生長(zhǎng)。

    2.2.5 Mg2+對(duì)QHD-1生長(zhǎng)的影響

    結(jié)果顯示,不同Mg2+含量對(duì)菌株QHD-1生長(zhǎng)的影響不同。當(dāng)Mg2+含量在0%~8%之間時(shí),均能促進(jìn)菌株QHD-1的生長(zhǎng),尤其是Mg2+含量為1%時(shí),對(duì)菌株QHD-1促生長(zhǎng)作用最明顯。這說(shuō)明Mg2+能促進(jìn)哈維氏弧菌QHD-1的生長(zhǎng)。

    2.3 培養(yǎng)條件對(duì)哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物被膜的影響

    2.3.1 初始菌液濃度對(duì)哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響

    由圖5可知,菌液濃度為1.0×102~1.0×109cfu/mL時(shí),生物被膜形成量逐漸升高;當(dāng)菌液濃度<1.0×107cfu/mL時(shí),生物被膜形成量少;初始菌液濃度低于該濃度時(shí),生物被膜的形成量之間無(wú)顯著差異;當(dāng)初始菌濃度達(dá)到1.0×108cfu/mL~1.0×109cfu/mL時(shí),細(xì)菌生物被膜成膜量顯著增加,與其他初始菌濃度下的生物被膜形成量差異極顯著(P<0.01)。這說(shuō)明初始菌液濃度影響菌株生物被膜的形成。

    2.3.2 不同溫度對(duì)哈維氏弧菌成膜的影響

    由圖6可知,當(dāng)培養(yǎng)溫度在4~20℃之間時(shí),菌株QHD-1生物被膜形成量較低;當(dāng)培養(yǎng)溫度在25~35℃之間時(shí),菌株生物被膜形成量較高,且維持較高水平;30℃時(shí),菌株QHD-1生物被膜形成量達(dá)峰值,與其他溫度下菌株生物被膜形成量差異極顯著(P<0.01);當(dāng)溫度為40℃時(shí),生物被膜形成量較低。

    圖5 初始菌液濃度對(duì)哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響Fig.5 Effect of initial bacterial concentration on the biofilm formation of V.harveyi QHD-1

    圖6 培養(yǎng)溫度對(duì)哈維氏弧菌成膜形成的影響Fig.6 Effect of incubation temperature on the film formation of V.harveyi QHD-1

    2.3.3 pH對(duì)哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響

    由圖7可知,當(dāng)pH為7~8時(shí),菌株QHD-1生物被膜形成量最大,與其他組差異顯著(P<0.05);當(dāng)pH<4時(shí),菌株QHD-1生物被膜的形成量較低;而當(dāng)pH升高到5~9時(shí),則逐漸升高,pH為8時(shí),形成量最大。這說(shuō)明pH影響菌株QHD-1生物被膜的形成。

    圖7 pH對(duì)V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響Fig.7 Effect of pH value on the biofilm formation of V.harveyi QHD-1

    2.3.4 鹽離子濃度對(duì)哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響

    由圖8可知,當(dāng)NaCl含量在1%~5%時(shí),該菌生物被膜形成量逐漸增加,且NaCl濃度在5%時(shí),生物被膜形成量最大,與其他NaCl含量生物被膜的形成量差異極顯著(P<0.01);當(dāng)NaCl含量>5%時(shí),菌株QHD-1生物被膜形成量下降;NaCl含量在0%和8%時(shí),菌株QHD-1幾乎不形成生物被膜。

    圖8 鹽離子濃度對(duì)V.harveyi QHD-1生物膜形成的影響Fig.8 Effect of salt ion concentration on the formation of V.harveyi QHD-1 biofilm

    3 討論

    引起魚(yú)類(lèi)疾病的原因有很多,主要包括環(huán)境、傳染性病原等,如病毒、寄生蟲(chóng)、細(xì)菌等[11]。一些致病性弧菌引起的細(xì)菌病在水產(chǎn)養(yǎng)殖中頻發(fā),給海水養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

    生物被膜形成能力是細(xì)菌致病性和耐藥性強(qiáng)弱的重要影響因素。生物被膜的形成是個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程,不同階段生化特性不同,且受多種因素的影響[12,13]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1能形成生物被膜,且受多種因素的影響,其中與起始菌液濃度關(guān)系最密切。當(dāng)菌液濃度在1.0×102~1.0×107cfu/mL時(shí),對(duì)該菌生物被膜的形成量影響不大,原因可能與游離菌密度較低時(shí),細(xì)菌初期黏附在聚苯乙烯板上的細(xì)菌量少有關(guān);當(dāng)菌液濃度為1.0×108~1.0×109cfu/mL時(shí),生物被膜形成量較大,與李海平等[14]研究結(jié)果一致。陳強(qiáng)等[15]的研究結(jié)果也表明細(xì)菌的粘附量與菌液濃度關(guān)系密切,且呈正比關(guān)系。因此,可認(rèn)為細(xì)菌黏附促進(jìn)了其生物被膜的形成,而細(xì)菌的黏附量會(huì)隨著菌液濃度的升高而增加。細(xì)菌起始濃度高有利于生物被膜的形成,溫度也影響細(xì)菌生物被膜的形成。本研究中,在 4℃、10℃、40℃時(shí),菌株 V.harveyi QHD-1 生物被膜形成量較少,25~35℃之間是形成生物被膜的最適溫度,與菌株V.harveyi QHD-1的最適生長(zhǎng)溫度接近,這表明哈維氏弧菌在活力最好時(shí)形成生物被膜最強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,pH為2~10時(shí),哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1菌株均能形成生物膜,而pH8時(shí),形成的生物膜量最大,這與李海平等[14]研究結(jié)果一致。滲透壓顯著影響生物被膜的形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%~8%時(shí),均可形成生物被膜;當(dāng)NaCl含量在0時(shí),幾乎不能形成生物被膜,這與李海平等[14]研究結(jié)果一致。鄢慶枇等[16]、尹清干等[13]研究發(fā)現(xiàn),NaCl濃度為0時(shí),細(xì)菌形成生物被膜的效果很差,可能與細(xì)菌在介質(zhì)上粘附量有關(guān)。黏附是細(xì)菌成膜的第一步,無(wú)法黏附在基質(zhì)上就難以形成生物被膜;當(dāng)NaCl濃度過(guò)高時(shí),抑制細(xì)菌形成生物被膜的原因可能是細(xì)菌受到環(huán)境生存壓力較大,影響了細(xì)菌的生長(zhǎng)。

    綜上所述,哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1形成生物膜與外界環(huán)境因子變化關(guān)系密切,而初始菌液濃度、溫度、pH、鹽度等各種環(huán)境因子均能顯著影響哈維氏弧菌V.harveyi QHD-1生物被膜的形成。

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