在體單向灌流法研究厄貝沙坦的大鼠腸吸收

師云才，蔣曙光，周建平，袁 靜，周湘穎

(1.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198;2.University of Liverpool，UK)

厄貝沙坦是一種血管緊張素Ⅱ受體的拮抗劑，主要用于治療輕中度的高血壓，其不良反應(yīng)較少、耐受性較高，療效好。厄貝沙坦不僅能有效的降低血壓［1－3］，還有保護患者器官、防止器官損傷的作用［4－7］。本研究參考有關(guān)文獻［8－11］，應(yīng)用大鼠在體腸灌流模型考察厄貝沙坦在大鼠各腸段的吸收情況，及濃度和溶液pH值對藥物吸收的影響，為進一步研究其藥代動力學(xué)、藥效學(xué)及厄貝沙坦相關(guān)制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑 Krebs-Ringer緩沖液(自行配制，1 000 mL 內(nèi)含有 NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO4·2H2O 0.416 g、MgCl2·6H2O 42.7 mg、葡萄糖 1.40 g)，烏拉坦(20%)，樂氏生理鹽水(自行配制，1 000 mL中有NaCl 9.0 g，NaHCO30.2 g，KCl 0.42 g，CaCl20.24 g)，酚紅，厄貝沙坦原料藥，甲醇，乙腈，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 依利特P1201型高效液相色譜儀(依利特 P1201二元泵，UV1201紫外-可見檢測器，EC2006色譜數(shù)據(jù)處理工作站)，HL-2恒流泵(上海滬西分析儀器廠有限公司)，752型紫外可見分光光度計(上海舜宇恒平)，恒溫水浴鍋HH-2(上海特成機械設(shè)備有限公司)，雷磁PHS-25數(shù)顯型 pH計(上海精科)，ACCULAB型電子天平(北京賽多利斯)。

1.3 實驗動物 健康雄性 SD大鼠，(250±20)g，江蘇大學(xué)scxk(蘇)2013－0011。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備 含酚紅的Krebs-Ringer液:精密稱量 CaCl20.37 g，葡萄糖 1.4 g，加少量蒸餾水使其完全溶解，再精密稱取 NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO4·2H2O 0.416 g、MgCl2·6H2O 0.0427 g，加蒸餾水使其完全溶解，加酚紅20 mg溶解，稀釋后與上述溶液混合并定容至1 000 mL。

藥物灌流液:分別精密稱取50、100、150 mg厄貝沙坦原料藥，含酚紅的Krebs-Ringer液溶解并稀釋至 1 000 mL，即得 50、100、150 mg·L－1的藥物灌流液。

空白腸灌流液:取含酚紅的Krebs-Ringer液，按照“2.2”節(jié)大鼠在體腸灌流實驗方法進行實驗，得空白腸灌流液。

2.2 大鼠在體腸灌流實驗方法 取體重為(250±20)g的大鼠，禁食12 h，不禁水。腹腔注射20%烏拉坦進行麻醉(1 g·kg－1)，將大鼠固定在手術(shù)臺上，紅外燈保溫。手術(shù)剪沿腹中白線打開腹腔，依次小心的分離出十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸。十二指腸為幽門下約2 cm處開始向下數(shù)約10 cm;空腸為幽門下約15 cm處，向下數(shù)約10 cm;回腸為盲腸上約2 cm處向上數(shù)約10 cm;結(jié)腸為盲腸后端緊鄰盲腸開始向下量取，盡可能多取。分別于腸段兩端切口插管，小心縫合結(jié)扎，用37°C樂氏生理鹽水沖洗，排出腸段內(nèi)容物，然后泵入空氣排去生理鹽水。取37°C的供試藥液先以1.0 mL·min－1的流速灌流，使藥液充滿腸段，保持10 min。再以0.2 mL·min－1的速度灌流，平衡30 min后開始接受灌流液，以15 min作為一個時間段，共收集4個時間段的灌流液。實驗過程中用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋傷口處，并不時滴加生理鹽水保濕。移液管精密移取0.5 mL接受液，檢測酚紅濃度，剩余的接受液用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，進樣檢測藥物濃度。

2.3 厄貝沙坦的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱:Hedera ODS-2色譜柱(5 μm，4.6 mm ×150 mm)，流動相:pH 3.2 磷酸鹽緩沖液—乙腈(55∶45)，流速 1.0 mL·min－1，進樣量25 μL，檢測波長245 nm，柱溫30℃。

2.3.2 方法專屬性考察 分別取空白腸灌流液、厄貝沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液，含藥灌流液分別進樣測定，考察方法專屬性。色譜圖見圖1，由圖1可知，空白灌流液對藥物的測定沒有干擾。

圖1 高效液相色譜圖

2.3.3 藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密配制濃度分別為 20、40、60、80、100、120、140 mg·L－1的厄貝沙坦K-R溶液，0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液進樣25 μL，得峰面積。以藥物濃度C對峰面積A進行線性回歸，得藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=38.324X －124.86，R2=0.998(n=7)，線性范圍為 20 ～140 mg·L－1，最低定量 10 mg·L－1。

分別精確配制 40、80、120 mg·L－1的藥物 K-R溶液，考察標(biāo)曲回收率及精密度(n=5)。結(jié)果回收率均在98.5%到101%之間，日內(nèi)RSD和日間RSD均在4%以內(nèi)，說明本方法回收率較高，精密度較好。

2.3.4 藥物在K-R溶液及空白腸灌流液中的穩(wěn)定性 分別用K-R液和空白腸灌流液配制50、100、150 mg·L－1的厄貝沙坦原料藥溶液，37℃水浴中放置，分別于0、2、4 h取樣，檢測藥物含量。結(jié)果3個藥物濃度的溶液在各時間點測得的峰面積基本相同，RSD均在3%以內(nèi)，表明厄貝沙坦在K-R液及空白腸灌流液中較為穩(wěn)定。

2.4 酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密配制濃度為5、10、15、20、30、40、60 mg·L－1的酚紅 K-R 溶液，各精密移取1 mL置于10 mL容量瓶，加NaOH溶液(1 mol·L－1)2 mL，K-R 液稀釋至刻度，搖勻后在558 nm可見光下測定各濃度溶液的吸光度，以酚紅濃度C對溶液吸光度A線性回歸，得酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=0.0151X+0.0436，R2=0.999 8(n=8)，線性范圍為5 ～60 mg·L－1。

分別精確配制10、10、60 mg·L－1的酚紅 K-R 溶液，考察標(biāo)曲回收率及精密度(n=5)。結(jié)果回收率均在98%到100.5%之間，日內(nèi)RSD和日間RSD均在5%以內(nèi)，說明本方法回收率較高，精密度較好。

2.5 數(shù)據(jù)處理方法 酚紅法校正灌流液體積變化，校正公式為:

Cout(corrected)為流出液校正后的藥物濃度，Cout為實際測得的藥物濃度，PRout為流出液中酚紅的濃度，PRin為灌流液入口處酚紅的濃度。

藥物有效滲透系數(shù)(Peff)和吸收速率常數(shù)(Ka)分別用公式(2)、(3)計算得到:

Cin為灌流液入口處藥物濃度，Q為灌流液流速，本實驗為 0.02 mL·min－1，r為在體實驗?zāi)c段的腸道半徑，L為在體實驗?zāi)c段的長度。

經(jīng)公式(1)、(2)和(3)計算得到不同濃度、不同pH值以及不同腸段Ka和Peff，使用SPSS19.0軟件LSD檢驗法進行單因素方差分析，以P＜0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.6 厄貝沙坦腸吸收影響因素的考察

2.6.1 腸段及濃度對厄貝沙坦腸吸收的影響 取50、100、150 mg·L－1的藥物灌流液，按照“2.2”節(jié)的試驗方法對大鼠的十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸同時進行單腸灌流實驗，按照“2.4”節(jié)數(shù)據(jù)處理方法對測定的數(shù)據(jù)進行處理，結(jié)果見表1和圖2，結(jié)果顯示厄貝沙坦在各腸段吸收較好，為全腸道吸收藥物。

表1 不同濃度的厄貝沙坦溶液在不同腸段的吸收速率常數(shù)

經(jīng)方差分析，當(dāng)灌流液中藥物濃度為50、100 mg·L－1時，十二指腸的吸收速率常數(shù)Ka與空腸、回腸以及結(jié)腸的Ka差異有顯著性，空腸、回腸和結(jié)腸之間的Ka差異無顯著性;當(dāng)灌流液中藥物濃度為150 mg·L－1時四腸段的Ka均差異無顯著性。十二指腸50 和 100 mg·L－1的 Ka都與 150 mg·L－1的 Ka差異有顯著性，空腸、回腸和結(jié)腸三個濃度間均差異無顯著性。方差分析結(jié)果顯示厄貝沙坦在空腸、回腸和結(jié)腸的吸收以被動擴散為主，而在十二指腸中的吸收是以被動擴散和主動轉(zhuǎn)運相結(jié)合的方式進行。

圖2 不同濃度的厄貝沙坦溶液在不同腸段的有效滲透系數(shù)

2.6.2 灌流液pH值對藥物吸收的影響 按照本節(jié)“2.1”藥物灌流液配制方法制備 100 mg·L－1的厄貝沙坦腸灌流液，用NaOH、HCl分別調(diào)節(jié)pH值，得 pH 值分別為6.0、6.8、7.4 的藥物灌流液，分別按照“2.2”大鼠在體單向腸灌流的實驗方法進行實驗，考察不同pH值的灌流液中藥物的吸收情況。結(jié)果見表2和圖3，經(jīng)方差分析，各腸段中，不同pH值灌流液之間的Ka和Peff差異無顯著性，表明灌流液pH值對藥物的吸收沒有影響。

表2 不同pH值灌流液的藥物吸收速率常數(shù)

圖3 不同pH值灌流液的藥物有效滲透系數(shù)

3 討論

本研究采用在體單向腸灌流法考察藥物厄貝沙坦在大鼠十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸四個腸段的吸收速率常數(shù)Ka和有效滲透系數(shù)Peff，以及濃度和pH值對藥物吸收的影響，在體單向腸灌流法與離體法相比能夠更加真實地反映出藥物在大鼠腸道的吸收情況，與循環(huán)腸灌流法相比，其吸收速率穩(wěn)定，實驗對大鼠腸壁造成損傷較小，與人體相關(guān)性較好。本研究的結(jié)果顯示厄貝沙坦為全腸道吸收的藥物，且以十二指腸為主要吸收腸段，腸道pH對藥物的吸收沒有影響。

考慮到厄貝沙坦為生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)Ⅱ類藥物［12］，本研究也證明了厄貝沙坦在腸道有較好的吸收，因此在制備厄貝沙坦藥物制劑時，可以通過提高厄貝沙坦的溶解度來提高藥物的生物利用度，增強藥物的治療效果。

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