芪靈扶正清解顆粒對(duì)人HepG2肝癌細(xì)胞ras基因蛋白表達(dá)的影響

章尤權(quán)，王清泰，魏建威，王素清，陳旭征，杜 建

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州350003；2.福州大學(xué)校醫(yī)院，福建 福州 350002；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122）

芪靈扶正清解顆粒是福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院的院內(nèi)制劑（批號(hào)：閩藥制字Z20120004），主要在消化道腫瘤患者圍手術(shù)期和圍放化療期使用，在提高腫瘤患者免疫功能、減少放化療毒副反應(yīng)、控制瘤體生長(zhǎng)等方面療效顯著。前期的研究我們發(fā)現(xiàn)芪靈扶正清解顆粒能夠誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）亞族 P38磷酸化蛋白的表達(dá)從而誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡［1］。本研究基于P38MAPK通路的上游關(guān)鍵因子ras，初步研究芪靈扶正清解顆粒對(duì)人HepG2肝癌細(xì)胞增殖的影響及對(duì)ras基因和蛋白表達(dá)的影響，為芪靈扶正清解顆?？鼓[瘤作用提供有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶（美國(guó) Hyclone Co.）；Trizol試劑（美國(guó) Invitrogen Co.）；SYBR GreenⅠ熒光染料（美國(guó) Applied Biosystems Co.）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；抗人ras抗體（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；Cycletest Plus DNA試劑盒（美國(guó)Becton Dickinson Co.）；7500型熒光定量PCR儀（美國(guó) Applied Biosystems Co.）；DM4000B型顯微鏡（德國(guó) Leica Microsystems Co.）；150 型 CO2培養(yǎng)箱（德國(guó) HERA-cell Co.）；FASCalibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó) Becton Dickinson Co.）。

1.2 細(xì)胞、藥材與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人肝癌細(xì)胞株HepG2由福建省腫瘤醫(yī)院提供，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中；芪靈扶正清解顆粒由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院制劑室提供；體重（200±20）g的雄性SD大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證號(hào)：SCXK（滬）2009-0005。所有動(dòng)物被飼養(yǎng)在溫度和濕度相對(duì)恒定的環(huán)境下，實(shí)驗(yàn)通過(guò)福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)認(rèn)可。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 含藥血清的制備 按照隨機(jī)數(shù)字表法則將大鼠隨機(jī)分為4組：高劑量組、中劑量組、低劑量組和空白組，每組7只。根據(jù)大鼠與人體間等效劑量的換算原則，分別灌胃相當(dāng)于成人臨床每日推薦劑量的 12 倍、6 倍和 3 倍的中藥顆粒， 即 5.4 g／（kg·d）、2.7 g／（kg·d）、1.35 g／（kg·d）劑量的中藥顆粒及等體積生理鹽水，連續(xù)灌服7 d，1 d 2次。末次灌胃1 h后腹主動(dòng)脈取血，分離血清，0.22 μm抽濾除菌，56℃滅活，得到各組含藥血清和空白血清。用RPMI-1640培養(yǎng)基1∶5稀釋得到20%的含藥血清和空白血清，作為干預(yù)細(xì)胞的劑量。

1.3.2 細(xì)胞周期檢測(cè) HepG2細(xì)胞以1×105個(gè)／mL的密度接種在6孔板中，20%含藥血清和20%空白血清干預(yù)24 h后消化細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液。細(xì)胞周期檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照Cycletest Plus DNA試劑盒的說(shuō)明書操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。CellQuest軟件獲取10000個(gè)細(xì)胞，ModFit軟件分析細(xì)胞各個(gè)期的百分含量，并計(jì)算增殖指數(shù)（proliferating index，PI）：

PI＝（S＋G2／M）／（G0／G1＋S＋G2／M）×100%。

1.3.3 相對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)k-ras、h-ras和n-ras mRNA水平 20%空白血清和中劑量含藥血清作用細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。k-ras、h-ras和 n-ras引物序列見表 1。20 μL PCR反應(yīng)體系中分別加入SYBR GreenⅠMix，cDNA，上下游引物和 H2O。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：50℃2 min，95℃預(yù)變性 10 min，95℃變性 15 s，60℃退火及延伸1 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，60℃延伸時(shí)采集熒光信號(hào)，熔解曲線考查引物特異性。Ras mRNA的基因表達(dá)量（RQ）用 2-△△Ct表示，其中 Ct表示擴(kuò)增基因熒光強(qiáng)度達(dá)到一定閾值的循環(huán)數(shù)，參照文獻(xiàn)［2］。

用超純水代替cDNA模板進(jìn)行擴(kuò)增作為實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照。

表1 k-ras、h-ras、n-ras和 GAPDH引物序列

1.3.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色分析ras蛋白的表達(dá) 細(xì)胞爬片，置于冷丙酮固定20 min，10%羊血清封閉15 min，加入ras抗體，4℃過(guò)夜孵育，洗滌，加入二抗孵育2 h，DAB顯色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色，表達(dá)部位在細(xì)胞漿上。用PBS代替ras抗體作為陰性對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，細(xì)胞周期結(jié)果采用單因素方差分析，ras基因結(jié)果采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 芪靈扶正清解顆粒對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力的影響，見圖1和表2。芪靈扶正清解顆粒含藥血清干預(yù)人HepG2細(xì)胞后，G0／G1期細(xì)胞的百分含量較空白組明顯升高，S期細(xì)胞的百分含量較空白組明顯減少，PI指數(shù)也明顯降低，并呈現(xiàn)劑量依賴性?？梢娷戊`扶正清解顆粒能將肝癌細(xì)胞阻滯在G0／G1期，抑制DNA合成。

圖1 4組肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞周期典型圖

表2 4組間肝癌細(xì)胞株HepG2各個(gè)時(shí)期百分含量比較（±s）%

表2 4組間肝癌細(xì)胞株HepG2各個(gè)時(shí)期百分含量比較（±s）%

注：與空白組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與低劑量組比較，3） P＜0.05，4） P＜0.01；與中劑量組比較，5） P＜0.05，6） P＜0.01。

PI 39.20±1.4335.68±0.931）34.07±0.602）32.33±0.532）3）組 別空白組低劑量組中劑量組高劑量組G0／G160.74±1.3764.33±0.931）65.93±0.602）67.67±0.532）3）S 24.50±1.1323.97±0.4421.56±0.311）16.68±0.622）4）6）G2／M 14.69±0.4611.71±0.8612.51±0.4415.65±0.294）5）

2.2 芪靈扶正清解顆粒對(duì)ras基因家族成員k-ras、h-ras和n-ras mRNA水平的影響 見圖2。芪靈扶正清解顆粒干預(yù)HepG2細(xì)胞24 h后，h-ras、k-ras和n-ras mRNA水平平均下降了 81.1%、43.3%和70.7%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果有顯著性差異（P＜0.01）。可見芪靈扶正清解顆粒能顯著下調(diào) k-ras、h-ras和 n-ras mRNA的表達(dá)。

圖2 空白組與中劑量組k-ras、h-ras和n-ras mRNA水平比較

2.3 芪靈扶正清解顆粒對(duì)P21ras蛋白表達(dá)的影響，見圖3。P21ras表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色，表達(dá)部位在細(xì)胞漿上。經(jīng)中劑量含藥血清干預(yù)后可見P21ras陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞明顯減少，可見芪靈扶正清解顆粒能顯著下調(diào)P21ras蛋白的表達(dá)。

圖3 空白組與中劑量組P21ras蛋白水平比較

3 討 論

據(jù)統(tǒng)計(jì)肝癌在我國(guó)惡性腫瘤死因中位列第二［3］。肝癌的臨床治療手段有限，結(jié)合中醫(yī)藥治療成為臨床肝癌防治的重要手段之一。芪靈扶正清解顆粒主要由黃芪、女貞子、靈芝、山藥、白花蛇舌草和夏枯草組成?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：這六味藥中含有多糖類、皂苷類、黃酮類、三萜類、蒽醌類、甾體類等多種成分，不僅能夠提高圍手術(shù)期和圍放化療期腫瘤患者的體液免疫和細(xì)胞免疫功能，還可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制增殖和血管新生［4-9］，是值得研究和開發(fā)的抗癌輔助用藥。

眾所周知，細(xì)胞周期的啟動(dòng)、運(yùn)行和終止的異常均可引起細(xì)胞失控性生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因此阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程可有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。本文應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)首先調(diào)查了芪靈扶正清解顆粒含藥血清對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞周期的影響。研究發(fā)現(xiàn)芪靈扶正清解顆粒含藥血清干預(yù)人HepG2細(xì)胞后，G0／G1期細(xì)胞的百分含量明顯升高，S期細(xì)胞的百分含量明顯減少，且呈現(xiàn)劑量依賴性，說(shuō)明芪靈扶正清解顆粒含藥血清能將人肝癌細(xì)胞株HepG2阻滯在G0／G1期，阻止損傷細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA的合成，影響了G1／S轉(zhuǎn)換的進(jìn)程，有效地抑制了HepG2的過(guò)度增殖。

為進(jìn)一步探討芪靈扶正清解顆粒阻滯細(xì)胞周期的機(jī)制，我們調(diào)查了與G1／S轉(zhuǎn)換進(jìn)程密切相關(guān)的ras基因和蛋白的表達(dá)。ras癌基因是人類腫瘤中最常見的癌基因，有三個(gè)家族成員，分別是h-ras、k-ras和n-ras［10］。當(dāng)這些基因異常表達(dá)或突變時(shí)，可引起其編碼的ras蛋白的異?；罨?。ras蛋白是一種膜結(jié)合型的GTP／GDP結(jié)合蛋白，定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，因其分子量為21千道爾頓，故又叫P21ras蛋白。研究發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性肝癌的發(fā)生中，位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的ras癌基因處于高度激活狀態(tài)，進(jìn)而活化ras蛋白。持續(xù)活化的ras蛋白激活其下游的效應(yīng)蛋白raf-1，使得MAPK的激酶MEK磷酸化而活化，進(jìn)而磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)的蛋白激酶ERK、C-Jun N端激酶JUK／應(yīng)激激活蛋白激酶SAPK和p38MAPK，激活下游底物 AP-1、ELK-1、SAP、C-Jun、C-fos和 c-myc， 參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖、分化等多種生理過(guò)程，并在腫瘤惡變中起重要作用［11］。已證實(shí)ras基因和P21ras蛋白的異常表達(dá)均可導(dǎo)致原發(fā)性肝癌的發(fā)生和發(fā)展［12］。而ras抑制劑能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡，降低ERK磷酸化水平，說(shuō)明ras可作為原發(fā)性肝癌治療的潛在靶點(diǎn)［13］。有研究表明：ras參與了Cdk2和Cdk4的活化，進(jìn)而調(diào)控Cdk2-cyclin-E2F信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而影響細(xì)胞周期G1／S轉(zhuǎn)換的進(jìn)程［14］。本研究發(fā)現(xiàn)：芪靈扶正清解顆粒顯著下調(diào)HepG2細(xì)胞k-ras、h-ras和n-ras mRNA和P21ras蛋白的表達(dá)水平。由此我們猜想，芪靈扶正清解顆粒抑制HepG2增殖可能的作用機(jī)制與其可以顯著抑制肝癌細(xì)胞ras基因和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制Cdk2-cyclin-E2F信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響G1／S轉(zhuǎn)換的進(jìn)程有關(guān)。

［1］CHEN XZ，LI JN，ZHANG YQ，et al.Fuzheng Qingjie recipe induces apoptosis in HepG2 cells via P38 MAPK activation and the mitochondria-dependent apoptotic pathway［J］.Mol Med Rep，2014，9（6）：2381-2387.

［2］LIVAK K J，SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C［T］） method［J］.Methods，2001，25（4）：402-408

［3］陳建國(guó)，張思維，陳萬(wàn)青.中國(guó)2004-2005年全國(guó)死因回顧抽樣調(diào)查肝癌死亡率分析［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，44（5）：383-389.

［4］劉明華，任美萍，陳健平，等.黃芪皂苷抗腫瘤活性研究［J］.中藥藥理與臨床，2009，25（2）：68-70.

［5］張金玲，王小虎，鄧振濤，等.中藥女貞子化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，22（36）：4100-4101.

［6］鄧海林，昊佩穎，王建新.靈芝的研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2005，16（2）：141-143.

［7］劉悅，宋少江，徐綏緒.夏枯草的化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展［J］.沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，20（1）：55-59.

［8］袁書林.山藥的化學(xué)成分和生物活性作用研究進(jìn)展［J］.食品研究與開發(fā)，2008，29（3）：176-179.

［9］張創(chuàng)峰，楊友亮，劉普，等.白花蛇舌草化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展［J］.西北藥學(xué)雜志，2012，27（4）：379-382.

［10］何太平，嚴(yán)衛(wèi)紅，梁念慈.Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)：臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，2004，25（1）：74-76.

［11］徐艷朋，俞松.Ras信號(hào)傳導(dǎo)通路與腫瘤的關(guān)系［J］.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，36（3）：272-276.

［12］隋德國(guó).原發(fā)性肝癌發(fā)生與ras基因突變及法呢基轉(zhuǎn)移酶過(guò)量表達(dá)的關(guān)系研究［D］.濟(jì)南：山東大學(xué)，2012：41-67.

［13］楊件新，施超.阻斷Ras在肝癌靶向治療中的意義［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2013，22（1）：25-27.

［14］AKTAS H，CAI H，COOPER G M.Ras links growth factor signaling to the cell cycle machinery via regulation of cyclin D1 and the Cdk inhibitor p27KIP1［J］.Mol Cell Biol，1997，17（7）：3850-3857.