丹參地上部分抗動(dòng)脈粥樣硬化活性部位中齊墩果酸和熊果酸的含量測(cè)定研究

李 彧 ，曾榮潔 ，歐惠根 ，陳建忠

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建省高校中醫(yī)藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122）

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的根及根莖。其性苦，微寒，歸心、心包、肝經(jīng)，是常用的活血化瘀中藥［1］。丹參因其獨(dú)特的藥用價(jià)值被眾多醫(yī)藥生產(chǎn)企業(yè)和醫(yī)療單位所青睞，藥材需用量逐年增加，種植面積也隨之增大。我國(guó)是世界上最主要的丹參出產(chǎn)國(guó)，在提供大量根及根莖時(shí)，地上部分均被廢棄，且整株植物地上部分干重約為地下部分的 3～5倍，棄之十分可惜［2］。

近年來，丹參同屬中其它植物的三萜類化合物以其毒副作用小、療效明確成為歐美及中亞地區(qū)植物化學(xué)工作者研究熱點(diǎn)之一［3］。越來越多新的活性，特別是心血管活性、抗心律不齊［4］、抗動(dòng)脈粥樣硬化［5－6］以及腫瘤抑制活性［7］被人們所認(rèn)識(shí)。我們前期通過預(yù)實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)調(diào)研，發(fā)現(xiàn)丹參地上部分的主要成分除了類似地下根及根莖的酚酸類成分外，另有大量三萜類化合物，主要有熊果酸、齊墩果酸和薔薇酸等［8］。同時(shí)，張琴等研究亦證實(shí)丹參地上部分的乙酸乙酯提取部位和一些單體三萜類化合物具有良好的抗動(dòng)脈粥樣硬化活性，有很好的開發(fā)利用前景［8－9］。

因此，本實(shí)驗(yàn)以齊墩果酸和熊果酸為指標(biāo)性成分，采用超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS），建立丹參地上部分乙酸乙酯活性部位中齊墩果酸和熊果酸的含量測(cè)定方法，為丹參地上部分活性部位提取物的質(zhì)量控制提供方法，而且該結(jié)果對(duì)丹參地上部分資源綜合開發(fā)利用具有重要意義。

1 儀器與藥品

Waters ACQUITY UPLC-MS／MS超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters，Milford，USA）；VDRTEX-5型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4（國(guó)華電器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000A（上海亞榮生化儀器廠）；DLSB-5／20低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；BSA系列十萬分之一分析天平（德國(guó)塞多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

熊果酸和齊墩果酸對(duì)照品（純度≥98%，批號(hào)20140102，由上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心提供）；甲醇和甲酸（色譜純，德國(guó)默克公司）；95%乙醇、石油醚和乙酸乙酯均為分析純；水為超純水。丹參地上部分采自陜西西安，經(jīng)鑒定為丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的地上部位。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參地上部分乙酸乙酯活性部位的制備 根據(jù)文獻(xiàn)［8］，我們制備了6批次丹參地上部分的乙酸乙酯活性部位。方法如下：取丹參地上部分藥材適量，粉碎，置于5 L圓底燒瓶，加8倍量95%乙醇加熱回流提取1.5 h，提取3次，過濾并合并濾液，回收乙醇；濃縮液溶解在水中，先用石油醚萃取，取水層，再用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層，減壓回收溶劑，水浴干燥，得黑色浸膏，即為乙酸乙酯活性部位提取物，4℃冰箱存儲(chǔ)備用。

2.2 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱 （2.1×100 mm，1.7 μm，美國(guó) Waters公司）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸水（87∶13，v／v），等度洗脫；流速為 0.2 mL／min，柱溫為 25℃，進(jìn)樣量為 5 μL。在上述色譜條件下，齊墩果酸和熊果酸的保留時(shí)間分別為6.51 min和6.81 min，兩者分離度大于1.4，樣品中其他成分不影響測(cè)定，見圖1、圖2。

圖1 混合對(duì)照品的UPLC-MS色譜圖

圖2 樣品的UPLC-MS色譜圖

2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），毛細(xì)管電壓：3.20 kV；錐孔電壓：50 V；離子源溫度：110℃；去溶劑溫度：350℃；去溶劑氣體流速：600 L／h；錐孔氣體流速：50 L／h；檢測(cè)方式：負(fù)離子模式；掃描方式為選擇離子反應(yīng)檢測(cè)（SIR）模式；用于定量分析的目標(biāo)離子均為去質(zhì)子化的準(zhǔn)分子離子峰［M-H］-：m／z 455.56（齊墩果酸）和 m／z 455.58（熊果酸）。

2.4 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸對(duì)照品1.90 mg和熊果酸對(duì)照品2.10 mg，分別置于2 mL容量瓶中，加甲醇制成濃度分別為0.95 mg／mL齊墩果酸對(duì)照品母液和1.05 mg／mL熊果酸對(duì)照品母液。

2.5 供試品溶液的制備 取“2.1項(xiàng)”中提取物160 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，先用適量甲醇溶解，超聲15 min，再用甲醇定容至刻度，微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續(xù)濾液即得。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 檢測(cè)限與定量限 以信噪比為3∶1確定齊墩果酸和熊果酸檢測(cè)限分別為0.0038和0.0042 ng，以信噪比為10∶1確定齊墩果酸和熊果酸定量限分別為0.0095 ng和0.0105 ng。

2.6.2 線性關(guān)系 精密吸取齊墩果酸對(duì)照品母液0.5 mL和熊果酸對(duì)照品母液0.5 mL，置于同一50 mL容量瓶中，搖勻。精密吸取該溶液0.3 mL轉(zhuǎn)移至EP管中，加入甲醇5.7 mL搖勻，然后依次稀釋分別制成齊墩果酸濃度 0.0019、0.00475、0.0095、0.0190、0.0475 和 0.0950 μg／mL 和熊果酸濃度為 0.0021、0.00525、0.0105、0.0210、0.0525 和 0.1050 μg／mL的混合對(duì)照品溶液。準(zhǔn)確吸取上述混合對(duì)照品溶液5 μL，按上述確定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，齊墩果酸回歸方程為y＝24276x＋78.912，相關(guān)系數(shù) r＝0.9913；熊果酸回歸方程為 y＝16240x＋111.58，相關(guān)系數(shù) r＝0.9937。

2.6.3 精密度試驗(yàn) 日內(nèi)精密度：準(zhǔn)確吸取同一供試品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得齊墩果酸的峰面積RSD為1.0%和熊果酸的峰面積RSD為0.6%。日間精密度：上述供試品溶液連續(xù)測(cè)定3 d，每天測(cè)定6次，測(cè)得齊墩果酸的峰面積RSD為3.0%和熊果酸的峰面積RSD為2.5%。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次乙酸乙酯提取物樣品6份，精密稱定160 mg，按2.5項(xiàng)下“供試品溶液的制備”方法操作，在上述色譜條件下進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得齊墩果酸的含量RSD為1.3%及熊果酸的含量RSD為0.9%。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取同一供試品溶液5 μL，分別在 0 、4、6、8、12 和 24 h 進(jìn)行測(cè)定，以齊墩果酸、熊果酸的峰面積進(jìn)行考察，進(jìn)樣6次，測(cè)得齊墩果酸的峰面積RSD為1.2%及熊果酸的峰面積RSD為1.8%。表明樣品至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知齊墩果酸和熊果酸含量的乙酸乙酯提取物80 mg，精密稱定6份，每份加入相同含量的齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品，按2.5項(xiàng)下“供試品溶液的制備”方法操作，測(cè)定，計(jì)算得齊墩果酸平均回收率為100.4%，RSD為2.9%，熊果酸平均回收率為99.4%，RSD為2.5%。見表1和表2。

2.7 樣品測(cè)定 按照本方法的測(cè)定條件，分別測(cè)定6批丹參地上部分乙酸乙酯活性部位中齊墩果酸和熊果酸的含量，結(jié)果見表3。

3 討 論

3.1 含量測(cè)定指標(biāo)的選擇 現(xiàn)代藥理研究表明：齊墩果酸和熊果酸具有殺蟲、消炎、防流感、抗糖尿和增強(qiáng)免疫力等功能［8］；同時(shí)齊墩果酸也是治療慢性病毒性肝炎和急性黃疸型肝炎較理想的藥物；熊果酸還在抗腫瘤、抗氧化、降脂方面的作用顯著［9］。因此研究丹參地上部分中齊墩果酸和熊果酸的含量，對(duì)丹參地上部分在功能食品及養(yǎng)生保健領(lǐng)域的應(yīng)用及推廣具有參考價(jià)值。

表1 齊墩果酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表2 熊果酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表3 丹參地上部分乙酸乙酯活性部位中齊墩果酸和熊果酸的含量測(cè)定結(jié)果%

3.2 流動(dòng)相的選擇 熊果酸和齊墩果酸都是五環(huán)三萜類成分，互為同分異構(gòu)體，兩者極性相似，不易分離，實(shí)驗(yàn)前期流動(dòng)相的摸索階段，曾選用乙腈-甲酸銨、甲醇-乙腈-甲酸銨、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-甲酸水等不同流動(dòng)相調(diào)整不同比例做對(duì)比考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.1%甲酸水（87∶13）為流動(dòng)相，基線平穩(wěn)，可得到較為滿意的色譜峰形，故最終選用甲醇-0.1%甲酸水（87∶13）作為流動(dòng)相。

3.3 質(zhì)譜條件的選擇 在本次實(shí)驗(yàn)中，碰撞能量、錐孔電壓、離子源溫度和去溶劑氣體溫度等質(zhì)譜參數(shù)的設(shè)置對(duì)于齊墩果酸和熊果酸的檢測(cè)有重要影響。通過全掃描發(fā)現(xiàn)：碰撞能低于40 eV時(shí)，齊墩果酸與熊果酸無法產(chǎn)生碎片離子，達(dá)到50eV時(shí)，也基本上沒有明顯的碎片離子，說明它們不能形成穩(wěn)定的子離子，所以多反應(yīng)檢測(cè)掃描（MRM）掃描分析方法不適合這兩種化合物的定量分析。而選用選擇反應(yīng)檢測(cè)掃描（SIR），質(zhì)譜的化學(xué)背景降低，目標(biāo)檢測(cè)物的信噪比顯著提高，可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的高靈敏度和高選擇性。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道：由于齊墩果酸與熊果酸在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有羧基，其在負(fù)離子檢測(cè)模式下比在正離子模式下有更好的信號(hào)強(qiáng)度和更弱的基線噪音信號(hào)。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)的質(zhì)譜工作模式為SIR掃描模式和負(fù)離子檢測(cè)模式。

3.4 含量測(cè)定結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了6批次的丹參地上部分乙酸乙酯活性部位中齊墩果酸和熊果酸的含量，結(jié)果表明提取物中熊果酸的含量達(dá)到約0.25%，是齊墩果酸含量的5倍左右。因此，該方法的建立不僅為丹參地上部分活性部位的質(zhì)量控制提供了方法，而且也表明丹參地上部分具有豐富的熊果酸成分，是一個(gè)可利用的藥用資源。

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