右美托咪定抑制化學(xué)性低氧引起的PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)

華瀟瀟，陳潔琳，張莉莉，周 舸，伍偉軍，袁福利，馮鑒強(qiáng)，莫利求

(中山大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)麻醉科，廣東廣州 510700;2.中山醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣東廣州 510080)

右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是一種高選擇性α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，主要作為鎮(zhèn)靜藥應(yīng)用于 ICU和麻醉患者，其還具有神經(jīng)保護(hù)作用［1－2］。值得注意的是，近年有研究證實(shí)DEX具有抗炎癥作用。例如，DEX 在臨床上能改善敗血癥病人的炎癥反應(yīng)，并能改善患者的預(yù)后［3］。在大鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞［4］和巨噬細(xì)胞［5］，DEX 能抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)引起的炎癥反應(yīng)。但是，DEX能否抑制缺氧引起的神經(jīng)炎癥，尚未見(jiàn)報(bào)道。

缺氧是臨床上引起神經(jīng)損傷的重要因素之一。缺氧可引起氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)。最近，我們證實(shí)，化學(xué)性低氧可通過(guò)活性氧(reactive oxygen species，ROS)激活的p38絲裂原激活蛋白酶激酶(MAPK)通路誘發(fā)具有神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與功能特征的PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)［6］，并證實(shí)DEX可以通過(guò)抑制p38MAPK通路保護(hù)PC12細(xì)胞對(duì)抗化學(xué)缺氧性損傷。因此，我們推測(cè)DEX可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)來(lái)保護(hù)PC12細(xì)胞對(duì)抗化學(xué)缺氧性損傷。為此，本研究應(yīng)用化學(xué)性低氧模擬劑氯化鈷(CoCl2)處理PC12細(xì)胞建立化學(xué)性缺氧損傷的細(xì)胞模型，重點(diǎn)探討:①DEX能否抑制化學(xué)性缺氧引起的炎癥反應(yīng);②DEX抑制炎癥的作用是否與其減輕細(xì)胞損傷與抗氧化應(yīng)激有關(guān)，以進(jìn)一步闡明抑制炎癥反應(yīng)在DEX保護(hù)PC12細(xì)胞對(duì)抗缺氧性損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 DEX由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供。CoCl2購(gòu)自美國(guó)Sigma Aldrich公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自日本Dojindo Lab，DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司。IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，TNF-ɑ ELISA試劑盒購(gòu)自上海依科賽生物制品有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 PC12細(xì)胞由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心提供，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，2～3 d換液1次。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模瑢?shí)驗(yàn)分6組:① 正常對(duì)照組;②CoCl2損傷組:600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12 細(xì)胞24 h;③ DEX+CoCl2組:0.1 μmol·L－1DEX 與600 μmol·L－1CoCl2共處理PC12細(xì)胞24 h;④ NAC+CoCl2組:500 μmol·L－1NAC 預(yù)處理 PC12 細(xì)胞 60 min 后，用 600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12 細(xì)胞 24 h;⑤ DEX 對(duì)照組:單獨(dú)予以0.1 μmol·L－1DEX 處理PC12細(xì)胞24 h;⑥ NAC對(duì)照組:單獨(dú)予以500 μmol·L－1NAC預(yù)處理PC12細(xì)胞60 min。

1.3 細(xì)胞存活率的檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，以 1×107接種于 96孔板，100 μl/孔。在37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜，按照上述實(shí)驗(yàn)要求處理完后，每孔加入100 μl 10%的 CCK-8，37℃孵育1 h，用酶標(biāo)儀(λ=450 nm)測(cè)定各孔吸光度(OD)。取4孔OD值的平均數(shù)，按照下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率/%=處理組OD/對(duì)照組OD×100%，重復(fù)5次。

1.4 IL-1β、IL-6和 TNF-ɑ 水平的檢測(cè) 采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6和TNF-ɑ水平。PC12細(xì)胞以1×107接種于96孔板中，100 μl/孔，當(dāng)80%融合時(shí)，分別給予各組處理因素，每組3個(gè)復(fù)孔。按實(shí)驗(yàn)要求處理完成后，收集培養(yǎng)基留作待測(cè)標(biāo)本。ELISA操作根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，顯色反應(yīng)終止后，用酶標(biāo)儀(λ=450 nm)測(cè)定各孔吸光度(OD)。取3孔OD值的平均數(shù)，按照下列公式計(jì)算 IL-1β、IL-6和 TNF-ɑ的誘導(dǎo)釋放率%:處理組OD/對(duì)照組OD×100%，重復(fù)5次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較用Bonferroni檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 DEX抑制CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥因子的釋放Fig 1 顯示，600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12 細(xì)胞24 h，可使細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，與正常對(duì)照組相比較，IL-1β的水平升高至(445.8±38.4)%(P＜0.01)，IL-6和 TNF-ɑ水平分別升高為(231.1±20.0)%和(236.7±11.3)%(P值均＜0.01)。但是，當(dāng)給予 0.1 μmol·L－1DEX 與 CoCl2共處理PC12細(xì)胞24 h后，CoCl2誘導(dǎo)的炎癥因子釋放被抑制，其中IL-1β的釋放率降至(147.5±16.1)%(Fig 1A)，IL-6(Fig 1B)和 TNF-ɑ(Fig 1C)分別降至(144.8±7.5)%和(157.3±10.4)%，與CoCl2損傷組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

Fig 1 Dexmedetomidine(DEX)protects PC12 cells against upregulation of levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α induced by CoCl2(n=5)

2.2 ROS清除劑NAC抑制CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥因子的釋放 Fig 2顯示，與DEX的抗炎癥作用相似，CoCl2處理 PC12細(xì)胞前 60 min，應(yīng)用 500 μmol·L－1NAC(為 ROS清除劑)預(yù)處理 PC12細(xì)胞，也能抑制CoCl2對(duì) IL-1β、IL-6和 TNF-ɑ分泌的上調(diào)作用，其中IL-1β的水平降至(301.9±20.6)%(Fig 2A)，IL-6水平降低至(171.7±22.3)%(Fig 2B)，TNF-ɑ 水平降至(194.2 ±53.36)%(Fig 2C)，與CoCl2損傷組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。單獨(dú)NAC處理對(duì)PC12細(xì)胞的上述炎癥因子的基礎(chǔ)分泌無(wú)明顯的影響。

Fig 2 N-acetyl-L-cysteine(NAC)protects PC12 cells against upregulation of IL-1β，IL-6 and TNF-α induced by CoCl2(n=5)

2.3 DEX和NAC抑制CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用 Fig 3顯示，600 μmol·L－1CoCl2處理 PC12 細(xì)胞24 h后，產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性，使細(xì)胞存活率降低至(48.9 ± 5.9)%(P＜ 0.01)，0.1 μmol·L－1DEX 與600 μmol·L－1CoCl2共處理 PC12 細(xì)胞 24 h后，PC12細(xì)胞存活率升高至(77.8±8.0)%，與CoCl2損傷組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)此外，NAC 預(yù)處理 60 min 也抑制 600 μmol·L－1CoCl2引起的細(xì)胞毒性(Fig 3)，使細(xì)胞存活率升高至(62.0±6.6)%(P＜0.05)。

Fig 3 Effects of dexmedetomidine(DEX)and N-acetyl-L-cysteine(NAC)on CoCl2-induced cytotoxicity in PC12 cells(n=5)

2.4 IL-1β、IL-6 和 TNF-α中和抗體抑制 CoCl2引起的細(xì)胞毒性作用 為了探討炎癥因子在CoCl2引起的細(xì)胞毒性中的作用，本研究分別觀察IL-1β、IL-6和TNF-α中和抗體對(duì)CoCl2引起的細(xì)胞毒性的影響。Fig 4 顯示，分別給予 100 μg·L－1IL-1β、IL-6和TNF-α中和抗體，與CoCl2共處理PC12細(xì)胞24 h后，均使細(xì)胞存活率明顯升高，其中，IL-1β中和抗體組，細(xì)胞存活率升高至(84.0±8.0)%(P＜0.01)，IL-6中和抗體組細(xì)胞存活率升高至(76.5±9.0)%(P＜0.01)，TNF-α中和抗體組細(xì)胞存活率升高至(68.2±3.8)%(P＜0.05)。

3 討論

Fig 4 Effects of neutralizing antibodies of IL-1β，IL-6 and TNF-α on CoCl2-induced cytotoxicity in PC12 cells(n=5)

臨床上，缺氧、缺血是多種疾病，如腦中風(fēng)(stroke)引起神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要的病理生理機(jī)制之一。缺氧可誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)［1，6－7］及炎癥反應(yīng)［6，8－9］。在缺血、缺氧損傷的腦組織中，前炎癥細(xì)胞因子如IL-1β和IL-6水平升高［8］。IL-1β可通過(guò)誘導(dǎo)凋亡蛋白(Bax)基因的大量表達(dá)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡［10］。IL-1β的表達(dá)高低通常反映了缺血的嚴(yán)重程度。腦缺血后，缺血局部產(chǎn)生TNF-α和IL-1β等炎癥因子，從而激活腦血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，進(jìn)而導(dǎo)致白細(xì)胞浸潤(rùn)及血栓形成，更進(jìn)一步加重缺血、缺氧。本研究再次證實(shí)，化學(xué)性低氧可引起PC12細(xì)胞產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高，這與Lan等［6］的報(bào)道相一致。

為了進(jìn)一步探討炎癥反應(yīng)與缺氧引起的細(xì)胞毒性的關(guān)系，本研究觀察了IL-1β、IL-6和TNF-α中和抗體對(duì)CoCl2(為化學(xué)性低氧模擬劑)引起的PC12細(xì)胞毒性［1，6－7］的影響。研究結(jié)果表明，上述 3 種炎癥因子的中和抗體均能明顯的抑制化學(xué)性低氧引起的細(xì)胞毒性，使細(xì)胞存活率增多，提示炎癥反應(yīng)參與化學(xué)性低氧引起的PC12細(xì)胞損傷。

值得注意的是，本研究率先證實(shí)α2腎上腺能受體激動(dòng)劑DEX能明顯的抑制CoCl2引起的炎癥反應(yīng)，使PC12細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α明顯減少。近年，在多種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀^察到DEX具有抗炎癥作用［4－5］。例如，Peng 等［4］報(bào)道，DEX 能減少 LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β和TNF-α的釋放。在離體的全血實(shí)驗(yàn)，Kawasaki等［11］也證實(shí)，DEX 能抑制 LPS誘導(dǎo)的人全血炎癥反應(yīng)。在敗血癥大鼠，DEX能減輕內(nèi)毒素引起的炎癥反應(yīng)［12］。上述的研究均支持本文的結(jié)果。結(jié)合我們前期的研究［1－2］和本文的上述結(jié)果(3種炎癥因子中和抗體能抑制低氧引起的細(xì)胞毒性)，提示，抑制炎癥反應(yīng)可能是DEX的神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。因此，對(duì)于可能存在缺氧的神經(jīng)損傷患者，如腦外傷、腦中風(fēng)等，及時(shí)應(yīng)用DEX是需要考慮的，一方面DEX具有鎮(zhèn)靜、抗焦慮作用，另一方面具有抗炎癥作用，并有利于促進(jìn)受損神經(jīng)細(xì)胞的恢復(fù)。Tasdogan等［13］證實(shí)，在腹部手術(shù)后發(fā)生嚴(yán)重?cái)⊙Y的患者，靜脈注射DEX能抑制炎癥反應(yīng)及降低腹內(nèi)壓。這值得臨床醫(yī)生進(jìn)一步探討。

低氧誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在某些特殊疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。在阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征，由于間歇低氧而引發(fā)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化［15］。對(duì)于圍術(shù)期病人而言，其遭受低氧的機(jī)率較高，在某些特殊病人如老年人，低氧誘發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)有可能導(dǎo)致術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)的發(fā)生，同時(shí)也可能加重與炎癥有關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如唐氏綜合癥、老年癡呆癥和多發(fā)性硬化等)。因此，研究減輕低氧誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)具有較重要的臨床意義。

目前，有關(guān)DEX抗炎癥的分子機(jī)制的報(bào)道很少。有報(bào)道指出，DEX的抗炎作用可能與激活α2-腎上腺素能受體及抑制核因子-κB(NF-κB)有關(guān)［11］。另有研究證實(shí)，在腦缺血/再灌注損傷的大鼠，DEX具有抗氧化作用，使丙二醛(MDA)水平降低，超氧化物歧化酶(SOD)增多［14］。最近，我們也證實(shí)DEX能降低化學(xué)性低氧引起的活性氧(ROS)水平升高［1－2］。有意義的是，本研究觀察到，ROS清除劑NAC也能抑制化學(xué)性低氧引起的PC12細(xì)胞炎癥反應(yīng)，提示ROS介導(dǎo)低氧引起的炎癥反應(yīng)，通過(guò)抑制ROS生成可能是DEX抑制炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要機(jī)制。

綜上所述，本研究為闡明α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑DEX抑制化學(xué)性低氧引起的神經(jīng)細(xì)胞炎癥與細(xì)胞毒性提供了新穎的實(shí)驗(yàn)資料，為臨床應(yīng)用DEX防治神經(jīng)炎癥反應(yīng)提供新思路。

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