幽門螺桿菌多靶點疫苗工程菌BIB發(fā)酵及純化工藝研究＊

潘 興，王保寧，楊 靖，李健春，祝 捷，周永君，王紅仁，李明遠，李婉宜△

1.四川大學華西基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院 微生物教研室（成都 610041）；2.四川萬可泰生物技術(shù)有限責任公司（成都 610041）；3.湖北醫(yī)藥學院 微生物教研室（十堰 442000）

幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，H.pylori）作為一種定植于胃和十二指腸黏膜的螺旋形革蘭陰性菌，與慢性胃炎、消化性潰瘍和胃癌的發(fā)生關(guān)系密切，1994年被世界衛(wèi)生組織列為一類致癌因子［1，2］。H.pylori在全球范圍內(nèi)的感染率已超過50%，在我國的感染率為42%～90%［3］。目前臨床治療H.pylori感染多采用抗生素聯(lián)合質(zhì)子泵抑制劑，短期內(nèi)具有較好的根除療效，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，推薦用于根除治療的幾種抗生素藥物中，甲硝唑耐藥率達60%～70%，克拉霉素耐藥率達20%～38%，左氧氟沙星耐藥率達30%～38%。此外，抗生素療法還存在治療后易復發(fā)、腸道菌群微生態(tài)失衡等不足，大大限制了其使用［3，4］。因此，接種有效的H.pylori疫苗是防治H.pylori感染的重要策略。

本課題前期構(gòu)建了含分子內(nèi)佐劑的重組幽門螺桿菌多靶點疫苗工程菌（BIB），并通過大量的體內(nèi)外實驗證實了BIB工程菌表達的重組蛋白（rBIB）具有良好的免疫原性與免疫保護性［5－8］。本研究以搖瓶發(fā)酵結(jié)果為基礎(chǔ)，對影響B(tài)IB收率的因素如發(fā)酵培養(yǎng)基、工作種子液接種量、誘導劑濃度、誘導起始時間、誘導持續(xù)時間及誘導劑添加方式等進行優(yōu)化，再放大工藝至50L發(fā)酵罐中進行綜合條件驗證，初步建立起B(yǎng)IB工程菌的高密度發(fā)酵工藝；再利用rBIB蛋白的高等電點特性（pI＝9.05），在pH為7.0～7.5的磷酸鹽緩沖液中目的蛋白帶正電荷，并建立rBIB蛋白的陽離子交換層析純化工藝，為深入研究rBIB蛋白性質(zhì)及其規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種BIB工程菌由四川萬可泰生物技術(shù)有限責任公司構(gòu)建并保存，菌種經(jīng)中國食品藥品檢定研究院檢定為合格。

1.1.2 儀器與主要實驗試劑 BIOTECH－50JS型發(fā)酵罐購自上海保興生物設(shè)備工程有限公司，AKTA purifier 100蛋白純化儀、HiTrap SP Sepharose FF、 HiTrap CM－FF、 HiTrap SP Sepharose XL層析柱均購自GE公司，蛋白胨、酵母抽提物購自O(shè)XOID公司，其他試劑為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 工作菌種活化與發(fā)酵種子液制備 ?。?0℃保存的工作菌種1支，用500μL LB液體培養(yǎng)基復蘇后，劃線接種至LB固體平板中（卡那霉素，50 μg／mL），37℃培養(yǎng)12h。挑取單菌落至含有3mL LB試管中，37℃、240rpm培養(yǎng)12h，再以1%（v／v）比例接種到3mL試管中，相同條件培養(yǎng)3h，此為發(fā)酵一級種子；取發(fā)酵一級種子按1%（v／v）比例接種到100mL搖瓶中，相同條件培養(yǎng)3h，此為發(fā)酵二級種子；取發(fā)酵二級種子按10%（v／v）比例接種到2 000mL搖瓶中，相同條件培養(yǎng)3h，此為發(fā)酵三級種子，即為高密度發(fā)酵工作種子。

1.2.2 培養(yǎng)基的篩選 從LB、TB、SOC等5種培養(yǎng)基中篩選發(fā)酵最適宜的培養(yǎng)基。發(fā)酵工作種子按1%接種至上述培養(yǎng)基中，37℃生長4h后，5.0mM乳糖誘導表達7h，分別測定菌體濕重和蛋白表達量。

1.2.3 工程菌最佳接種量的確定 將發(fā)酵工作種子分別按 0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、4.0%、8.0%、10.0%體積比接種至培養(yǎng)基中，37 ℃生長4h后，加入終濃度為5.0mM的乳糖誘導表達7 h，0.5mM的IPTG誘導表達7h作誘導陽性對照。分別測定菌體濕重和蛋白表達量。

1.2.4 最佳誘導起始時間的確定 將發(fā)酵工作種子按1%體積比接種至培養(yǎng)基中，37℃分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6h后，加入終濃度為5.0mM 的乳糖，分別誘導表達7h；0.5mM的IPTG誘導表達7h作誘導陽性對照。分別測定菌體濕重和蛋白表達量。

1.2.5 最佳誘導時間的確定 將發(fā)酵工作種子按1%體積比接種至培養(yǎng)基中，37℃生長4h后，加入終濃度為5.0mM 的乳糖，分別誘導2、4、5、6、7、8、9h；0.5mM的IPTG誘導表達7h作誘導陽性對照。分別測定菌體濕重和蛋白表達量。

1.2.6 誘導劑添加方式的確定 將發(fā)酵工作種子按1%體積比接種至培養(yǎng)基中，37℃生長4h后，1次性加入終濃度為5.0mM的乳糖誘導表達7h；分2次添加的濃度為2.5mM／次，分別在第0h、3h添加，共誘導7h；分4次添加的濃度為1.25mM／次，分別在第0、1、2、3h添加，共誘導7h；0.5mM的IPTG誘導表達7h作誘導陽性對照。分別測定菌體濕重和蛋白表達量。

1.2.7 最佳誘導劑濃度的確定 將發(fā)酵工作種子按1%體積比接種至培養(yǎng)基中，37℃生長4h后，分別加入終濃度為0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、8.0mM 的乳糖誘導表達7h；0.5mM的IPTG誘導表達7h作誘導陽性對照。分別測定菌體濕重和蛋白表達量。

1.2.8 發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵條件的研究 根據(jù)搖瓶探索的條件和相關(guān)文獻資料［9－11］，再對培養(yǎng)基進一步優(yōu)化。BIB工程菌發(fā)酵工作種子以4%的體積比接種至20LTB培養(yǎng)基中；生長至8h時，添加終濃度至5mM的乳糖作為誘導劑，繼續(xù)培養(yǎng)10～11 h。在BIB工程菌對數(shù)生長期過程中（2～8h），以80mL／h的葡萄糖補充碳源；平臺期時（8～16h）以40mL／h的甘油為流加碳源。全程滴加氨水控制pH在7.0左右，調(diào)整轉(zhuǎn)速以控制溶解氧在30%左右，并每2h取樣1次。分別測定發(fā)酵液吸光度OD578值、菌體濕重和蛋白表達量。

1.2.9BIB陽離子交換層析純化工藝研究 利用rBIB高等電點特性（pI＝9.05），在pH 為7.0～7.5的磷酸鹽緩沖液中目的蛋白帶正電荷，選擇陽離子交換層析進行純化，再根據(jù)陽離子交換層析填料的結(jié)合力選擇不同層析柱。每次上樣20mL、樣品蛋白濃度2.5mg／mL、上樣流速1mL／min（見表1）。

表1 不同陽離子交換層析柱純化rBIB pH條件篩選

1.2.10 分析方法 將發(fā)酵液用培養(yǎng)基稀釋20倍后，取200μL于酶標分析儀中在578nm處測其吸光度值；并取菌液100mL，4℃、10 000g離心10 min，棄上清后稱菌體濕重；蛋白樣品經(jīng)SDS－PAGE電泳后用凝膠掃描分析儀掃描，Quantity－One軟件分析目的蛋白表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，各組之間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

LB培養(yǎng)基中蛋白表達量最高（42.3%），但菌體濕重收率最低（7.3g／L）；而TB培養(yǎng)基中菌體濕重最高（12.4g／L），且蛋白表達量也較高（39.2%），故選擇TB培養(yǎng)基用作高密度發(fā)酵用培養(yǎng)基（見圖1）。

圖1 不同培養(yǎng)基中BIB工程菌菌體濕重及重組蛋白rBIB的表達水平

2.2 工程菌最佳接種量的確定

當工程菌的接種量在1.0%～10.0%時菌體濕重收率與IPTG對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且rBIB蛋白表達量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但當接種量超過4.0%時蛋白表達量卻隨接種量的增加出現(xiàn)下降趨勢，故選擇1.0%～4.0%的接種量（見圖2）。

2.3 乳糖最佳誘導濃度的確定

當乳糖濃度為5～8mM時菌體濕重收率與IPTG對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且rBIB蛋白表達量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），故選擇5～8mM 的乳糖濃度（見圖3）。

2.4 工程菌最佳誘導起始時間的確定

當誘導初始時間在2～8h時，此時工程菌正處于生長對數(shù)期（見圖7A）。4h時菌體濕重（7.88g／L）和蛋白表達量（43.6%）均達到最高，故選擇轉(zhuǎn)種后4h開始添加誘導劑（見圖4）。

2.5 工程菌最佳誘導時間的確定

當誘導時間在7～8h時，菌體濕重收率、蛋白表達量與IPTG對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），故選擇誘導時間為7～8h（見圖5）。

圖2 不同接種量條件下工程菌菌體濕重及重組蛋白表達量

圖3 不同誘導劑濃度條件下工程菌菌體濕重及重組蛋白表達量

圖4 不同初始誘導時間條件下工程菌菌體濕重及重組蛋白表達量

圖5 不同誘導時間條件下工程菌菌體濕重及重組蛋白表達量

2.6 乳糖添加方式的確定

當乳糖一次性添加時，菌體濕重收率與IPTG對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且rBIB蛋白表達量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），故乳糖應一次性添加（見圖6）。

圖6 不同乳糖添加方式對重組蛋白表達量的影響

2.7 發(fā)酵罐高密度發(fā)酵條件的研究

由BIB工程菌在發(fā)酵罐中的菌落數(shù)（CFU）及菌液吸光度OD578值隨發(fā)酵時間的變化可得，其生長對數(shù)期在2～8h和8～16h為平臺期，16h后進入衰亡期（見圖7A）。對數(shù)末期8h添加誘導劑乳糖，繼續(xù)培養(yǎng)10～11h，收集菌體，最終菌體濕重收率為70g／L，重組蛋白表達量約為32%（見圖7B）。發(fā)酵罐高密度發(fā)酵與搖瓶發(fā)酵相比，高密度發(fā)酵顯著提高了BIB工程菌菌體收率（P＜0.05），且重組蛋白的表達量二者之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05；見圖7B）。

2.8 BIB陽離子交換層析純化工藝研究

當純化緩沖液pH 為7.5時，HiTrap SP Sepharose XL、HiTrap SP Sepharose FF、HiTrap CM－FF三者純化后的rBIB純度分別為：75.3%、61.9%、49.9%；當純化緩沖液pH 為7.0時，三者純化后的rBIB純度分別為：91.8%、67.7%、52.3%（見圖8）。由此可見，rBIB純化結(jié)合緩沖液及洗脫緩沖液的pH為7.0時效果較好，且選擇HiTrap SP Sepharose XL層析柱效果最好，純化后的樣品純度可達到91.8%。

圖7 高密度發(fā)酵條件下rBIB的表達水平檢測

圖8 SDS－PAGE檢測陽離子交換層析后的rBIB純度

3 討論

利用普通的發(fā)酵工藝生產(chǎn)大腸桿菌或其基因工程菌的表達產(chǎn)物時，大腸桿菌的生物量、蛋白表達量、代謝產(chǎn)物在菌體內(nèi)和發(fā)酵液中的濃度都比較低，難以實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)。而高細胞密度發(fā)酵（high cell density cultivation，HCDC）在一定條件和培養(yǎng)體系下，能獲得最多的工程菌細胞量，由此可以更高效地獲得目的產(chǎn)物。HCDC即利用一定的培養(yǎng)技術(shù)和裝置提高菌體的發(fā)酵密度，使菌體密度較普通培養(yǎng)有顯著提高，最終提高產(chǎn)物的生產(chǎn)率。此外，大腸桿菌結(jié)構(gòu)簡單、遺傳學背景清晰、生長周期短、生長條件清楚，已成為最為常用的宿主菌［12］。

乳糖操縱子（lac）是目前研究最為詳盡、應用較為廣泛的一種可誘導負調(diào)控型操縱子［13］。誘導劑IPTG是一種高效的乳糖啟動子誘導劑，可以直接進入大腸桿菌細胞內(nèi)發(fā)揮誘導作用，是一種非代謝性的誘導物，但其具有潛在的毒性，對菌體生長有一定抑制作用，一些國家已明文規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)工藝中不得使用［14，15］。乳糖是一種天然的lac啟動子的誘導物，相比IPTG而言，具有無毒、價廉，可以作為碳源、氮源被利用等優(yōu)點，且成本不足IPTG的1%，宜于大規(guī)模生產(chǎn)［16］。然而由于乳糖的轉(zhuǎn)運和轉(zhuǎn)化比IPTG復雜，且可以被菌體代謝利用，對于菌體的生理及代謝也有一定程度的影響，因此乳糖作為誘導劑時需要對其進行條件摸索。

由于重組大腸桿菌進行高密度發(fā)酵可獲得較高的生物量而對發(fā)酵條件有非常高的要求，影響高密度發(fā)酵的因素又較多，且采用乳糖作為誘導劑時，有必要對菌體生長及誘導條件進行更為精細的研究和優(yōu)化。本實驗首先在搖瓶中針對各個單因素如發(fā)酵培養(yǎng)基、工作種子液接種量、誘導劑濃度、誘導起始時間、持續(xù)誘導時間和誘導劑添加方式等進行優(yōu)化，得出各個最佳條件，再進一步經(jīng)過50L發(fā)酵罐發(fā)酵驗證，最終得出了工程菌高密度發(fā)酵的最佳條件。本研究表明，高密度發(fā)酵工藝較搖瓶發(fā)酵對工程菌的菌體濕重提高了約7倍，且目標蛋白表達量相似。

本研究還利用rBIB蛋白的高等電點特性（pI＝9.05），在pH 為7.0～7.5的磷酸鹽緩沖液中目的蛋白帶正電荷，進而初步探索了其陽離子交換層析純化條件，對純化緩沖液pH及陽離子交換層析填料進行了篩選。結(jié)果顯示當純化緩沖液pH從7.5降至7.0后，rBIB蛋白在 HiTrap SP Sepharose XL、HiTrap SP Sepharose FF及 HiTrap CM－FF 3種純化柱上純化效果均出現(xiàn)了升高，這是由于純化緩沖液pH下降使得rBIB蛋白偏離等電點更遠，與相應的陽離子填料結(jié)合更為緊密。SP Sepharose XL為超高載量強離子交換層析填料，功能基團為磺丙基（SP）；SP Sepharose FF為高流速強離子交換層析填料，功能基團為磺丙基（SP）；而CM－FF為弱離子交換層析填料，功能基團為羧甲基（CM）。結(jié)果顯示，當選擇HiTrap SP Sepharose XL層析柱以及緩沖體系pH為7.0時，純化效果最佳，rBIB蛋白純度達到了91.8%。

綜上所述，BIB工程菌高密度發(fā)酵及純化工藝較為先進，為rBIB蛋白的深入研究及其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅實基礎(chǔ)。

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