小型豬血漿中二丙酸倍他米松及其代謝物倍他米松的LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定方法的建立及在藥動(dòng)學(xué)研究中的應(yīng)用

童穎，潘虹，孫成龍，辛?xí)造?，丁? ，馬鵬程

（1.中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析教研室，江蘇 南京 210009；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院，江蘇 南京 210042）

二丙酸倍他米松（betamethasone dipropionate）是一種強(qiáng)效外用糖皮質(zhì)激素[1]，在靶器官中會(huì)水解為其活性代謝產(chǎn)物倍他米松（betamethasone）[2]，具有抗炎、止癢、血管收縮等作用，常用于治療銀屑病和激素敏感性皮膚病[3]。據(jù)文獻(xiàn)[4-5]報(bào)道，盡管皮膚局部給藥避免了藥物體內(nèi)吸收，但長(zhǎng)期大量使用可能引起藥物的系統(tǒng)暴露量過(guò)大，從而引發(fā)糖皮質(zhì)激素類藥物常見的不良反應(yīng)。因此，需要建立靈敏的方法測(cè)定二丙酸倍他米松及其代謝物倍他米松的血藥濃度，用于評(píng)價(jià)藥物的安全性。國(guó)內(nèi)外主要采用HPLC法[6-7]、GC-MS法[8]和HPLC-MS/MS法[9-11]測(cè)定血漿中的倍他米松濃度，而血漿中原形藥物二丙酸倍他米松的濃度測(cè)定未見報(bào)道。GC-MS法的樣品前處理步驟煩瑣，不利于高通量樣本分析。而現(xiàn)有的LC-MS/MS法靈敏度低且測(cè)定成分單一，不適合生物樣本分析。本文建立了同時(shí)測(cè)定小型豬血漿中二丙酸倍他米松及其代謝物倍他米松的LC-MS/MS法，定量下限分別為25和10 ng·L-1，該分析方法高效、準(zhǔn)確、靈敏，可用于二丙酸倍他米松及其代謝物倍他米松的藥動(dòng)學(xué)研究。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260液相色譜–API 4000質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS），配有雙高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、電噴霧離子化接口、流動(dòng)注射泵、三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器等；色譜工作站：Analyst 1.5.2系統(tǒng)軟件（加拿大）。

1.2 藥品和試劑

二丙酸倍他米松乳膏（規(guī)格：以倍他米松計(jì)0.05%，批號(hào)：2013001）；二丙酸倍他米松對(duì)照品（批號(hào)：130503，含量：99.6%）；倍他米松對(duì)照品（批號(hào)：Y-08301，含量：98.7%），均由重慶華邦制藥有限公司提供；布地奈德對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)：100989-200801；含量：99.4%）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈為色譜純，購(gòu)自德國(guó)Merck公司；乙酸、乙酸銨、乙醚等試劑均為分析純，購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司；環(huán)己烷為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為去離子純凈水。

1.3 動(dòng)物

巴馬小型豬，2～3月齡，8～12 kg，雌雄各半，泰州泰和生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2011-0002。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)條件

色譜柱：Hedera ODS-2（150 mm×2.1 mm，5 μm，江蘇漢邦科技有限公司）；流動(dòng)相：5 mmol·L-1醋酸銨水溶液（含0.1%乙酸）（A）-甲醇（B）。梯度洗脫程序：0—3.8 min，73% B；3.8—3.9 min，由 73% B 變至 100%B；3.9—8.9 min，100% B；8.9—9 min， 由 100% B變至73% B；9—13 min，73% B。流速：0.7 mL·min-1。柱溫：38 ℃。進(jìn)樣量15 μL。多反應(yīng)離子檢測(cè)（MRM）；大氣壓化學(xué)離子化（APCI）；離子極性：負(fù)離子；檢測(cè)離子選擇：二丙酸倍他米松，m/z 563.2→483.1；倍他米松，m/z 451.2→361.0；布地奈德（內(nèi)標(biāo)），m/z 489.3→357.1；碰撞氣壓力：4 psi（1psi=6.895 kPa）；氣簾氣壓力：20 psi；離子源氣體1壓力：30 psi；霧化電流：-1 μA；輔助加熱溫度：300 ℃。其他相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)條件見表1。其二級(jí)質(zhì)譜圖見圖1。

表1 待分析物相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)條件Table 1 Optimized MS parameters for the analytes

圖1 待分析物的二級(jí)質(zhì)譜圖Figure 1 The secondary mass spectrum of analytes

2.2 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取二丙酸倍他米松對(duì)照品10.78 mg，倍他米松對(duì)照品10.76 mg（相當(dāng)于二丙酸倍他米松10.74 mg，倍他米松10.62 mg），分別置于10 mL量瓶中，加入乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，即得1.074 g·L-1的二丙酸倍他米松儲(chǔ)備液和1.062 g·L-1的倍他米松儲(chǔ)備液，分別用乙腈逐級(jí)稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為25.78、17.18、10.74、5.155、2.578、1.074 μg·L-1的二丙酸倍他米松標(biāo)準(zhǔn)溶液和濃度分別為25.49、16.99、10.62、5.098、2.549、1.274、0.424 8 μg·L-1的倍他米松標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密稱取布地奈德對(duì)照品10.20 mg（相當(dāng)于布地奈德10.14 mg），置于10 mL量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，即得1.014 g·L-1的布地奈德儲(chǔ)備液。取該儲(chǔ)備液適量，稀釋至所需質(zhì)量濃度 202.8 μg·L-1。

2.3 血漿樣品的處理

血漿樣品于冰水浴中化凍后，精密量取1 mL于10 mL玻璃離心管中，加入內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液（布地奈德質(zhì)量濃度為202.8 μg·L-1）20 μL，渦旋混勻，再加入提取溶劑乙醚-環(huán)己烷（4∶1）5 mL，乙酸（5%）100 μL，立即渦旋3 min，于4 000 r·min-1下離心10 min。取上層有機(jī)相至另一玻璃離心管中，于25 ℃水浴以氮?dú)饬鞔蹈?。提取好的血漿樣品放置于-20 ℃冰箱中保存。測(cè)定前用100 μL乙腈-水（50∶50）復(fù)溶液復(fù)溶，渦旋3 min，轉(zhuǎn)移至1.5 mL塑料離心管中，于15 600 r·min-1下離心3 min，取上清液至自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中，進(jìn)樣量15 μL，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

2.4 實(shí)驗(yàn)方案

取小型豬3只，對(duì)其背部及肋腹部皮膚進(jìn)行清理后單次給藥（2 mg·cm-2），給藥面積按20%體表面積計(jì)算[小型豬體表面積（BSA，單位：m2）計(jì)算公式[12]：BSA=0.121BW0.575，其中BW表示體質(zhì)量，單位為kg]，將稱量的二丙酸倍他米松乳膏置于給藥部位，然后用帶橡膠指套的手指涂抹藥物，接觸藥物的材料在接觸前和接觸后均稱重，以計(jì)算實(shí)際給藥量。給藥后約10 min用紗布覆蓋，然后用繃帶包裹固定，給藥24 h后去除藥物，清洗給藥部位。

分別于給藥前采集空白血，給藥后0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12、24、36、48 h采集靜脈血4 mL，離心取血漿-70 ℃保存，待測(cè)。用LC-MS/MS法測(cè)定血漿中二丙酸倍他米松及其代謝物倍他米松的濃度，采用BAPP軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 特異性考察

二丙酸倍他米松、倍他米松和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為3.91、1.20、2.37 min，無(wú)雜峰干擾測(cè)定，色譜圖見圖2。

圖2 待分析物的特異性色譜圖Figure 2 Chromatograms of specificity test for analytes

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及定量下限

取10 mL玻璃離心管數(shù)支，分別精密加入適量的二丙酸倍他米松、倍他米松標(biāo)準(zhǔn)溶液，以氮?dú)饬鞔蹈珊蠹尤肟瞻籽獫{1 mL，渦旋混勻，配成含二丙酸倍他米松26.85、26.85、64.44、128.9、268.5、429.6、644.4 ng·L-1， 倍他米松質(zhì)量濃度為10.62、31.86、63.72、127.4、265.5、424.8、637.2 ng·L-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，并同時(shí)制備空白樣品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別計(jì)算二丙酸倍他米松、倍他米松峰面積（As）和內(nèi)標(biāo)峰面積（Ai）的比值f（f=As/Ai），以f對(duì)血藥濃度C作權(quán)重回歸計(jì)算，得二丙酸倍他米松的回歸方程：f=2.10×10-3C+1.50×10-3（r=0.998 3），倍他米松的回歸方程：f=9.60×10-3C－2.23×10-2（r=0.997 4），權(quán)重系數(shù)（ω）=1/C2。結(jié)果顯示，二丙酸倍他米松血藥濃度在26.85～644.4 ng·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為26.85 ng·L-1，信噪比大于10；倍他米松血藥濃度在10.62～637.2 ng·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為10.62 ng·L-1，信噪比大于10。

3.3 精密度與準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

制備二丙酸倍他米松質(zhì)量濃度分別為53.70、161.1、483.3 ng·L-1，倍他米松質(zhì)量濃度分別為26.55、106.2、477.9 ng·L-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，每個(gè)濃度各配制5份樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法操作，計(jì)算樣品和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值f，將f代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算各樣品的質(zhì)量濃度，連續(xù)測(cè)定3批樣品，根據(jù)3批樣品濃度的實(shí)測(cè)值計(jì)算該方法的準(zhǔn)確度與精密度，結(jié)果見表2。本方法的準(zhǔn)確度與精密度符合生物樣品分析要求。

3.4 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)

按文獻(xiàn)[13-14]報(bào)道的方法，配制并處理二丙酸倍他米松質(zhì)量濃度分別為 53.70、161.1、483.3 ng·L-1，倍他米松質(zhì)量濃度分別為26.55、106.2、477.9 ng·L-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，考察提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)（ME）。測(cè)得血漿中內(nèi)標(biāo)的回收率為(109.8±5.5) % (n=15)，ME為(101.2±6.3) % (n=18)，血漿中二丙酸倍他米松、倍他米松回收率及ME見表2。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)條件下二丙酸倍他米松、倍他米松和內(nèi)標(biāo)的回收率均良好，血漿基質(zhì)對(duì)其離子化及測(cè)定無(wú)影響。

表2 血漿中二丙酸倍他米松和倍他米松LC-MS/MS測(cè)定方法的精密度、準(zhǔn)確度、回收率和基質(zhì)效應(yīng)()Table 2 Precision, accuracy, recovery and matrix effect data for the analysis of betamethasone dipropionate and betamethasone in miniature pig plasma by LC-MS/MS method

表2 血漿中二丙酸倍他米松和倍他米松LC-MS/MS測(cè)定方法的精密度、準(zhǔn)確度、回收率和基質(zhì)效應(yīng)()Table 2 Precision, accuracy, recovery and matrix effect data for the analysis of betamethasone dipropionate and betamethasone in miniature pig plasma by LC-MS/MS method

藥物 質(zhì)量濃度/(ng·L-1) 批內(nèi)RSD/% 批間RSD/% 準(zhǔn)確度/% 回收率/% 基質(zhì)效應(yīng)/%二丙酸倍他米松倍他米松53.70 5.7 6.1 98.8 ± 8.0 98.0 ± 8.8 103.9 ± 3.6 161.1 1.9 2.1 94.8 ± 6.5 102.9 ± 6.2 101.1 ± 6.4 483.3 3.9 4.4 98.9 ± 3.1 106.4 ± 6.0 100.1 ± 5.5 26.55 11.9 5.9 104.6 ± 9.9 96.9 ± 6.4 97.3 ± 7.2 106.2 7.8 1.5 94.2 ± 7.5 96.0 ± 7.7 90.1 ± 2.7 477.9 8.1 12.5 97.3 ± 8.2 96.5 ± 7.4 98.2 ± 5.3

3.5 穩(wěn)定性考察

配制二丙酸倍他米松質(zhì)量濃度分別為53.70和483.3 ng·L-1，倍他米松質(zhì)量濃度分別為26.55和477.9 ng·L-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿樣品若干份。其中3份按“2.3”項(xiàng)下方法操作處理后，立即進(jìn)樣測(cè)定，另取3份室溫放置1.5 h、3份冰水浴放置2.5 h、3份反復(fù)凍融3次及3份-20 ℃冰凍放置54 d，考察血漿樣品穩(wěn)定性；同時(shí)考察血漿樣品提取后的殘?jiān)谑覝胤胖眉?20 ℃冰凍狀態(tài)放置，血漿樣品提取后的殘?jiān)鼜?fù)溶液于進(jìn)樣器中放置及-20 ℃冰凍狀態(tài)放置條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，二丙酸倍他米松、倍他米松的穩(wěn)定性良好。

3.6 藥動(dòng)學(xué)研究

3只小型豬背部及肋腹部皮膚清理后分別單次給予二丙酸倍他米松乳膏（2 mg·cm-2），測(cè)得小型豬血漿中倍他米松的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖3，采用BAPP進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，其主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表3。

二丙酸倍他米松濃度的最大值為51.09 ng·L-1，約有90 %的樣品測(cè)得的二丙酸倍他米松血藥濃度低于定量下限（26.85 ng·L-1），無(wú)法估算其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，且無(wú)法作出其平均血藥濃度-時(shí)間曲線。

圖3 3只小型豬外用二丙酸倍他米松乳膏后其血漿中倍他米松的平均血藥濃度-時(shí)間曲線Figure 3 The mean plasma concentration-time profile of betamethasone in miniature pig plasma after transdermal administration with betamethasone dipropionate cream

表3 3只小型豬外用二丙酸倍他米松乳膏后其體內(nèi)倍他米松的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Table 3 The main pharmacokinetic parameters of betamethasone in three miniature pigs after transdermal administration with betamethasone dipropionate cream

4 討論

二丙酸倍他米松和倍他米松為糖皮質(zhì)激素類藥物，血 漿中存在與其結(jié)構(gòu)相似的內(nèi)源性物質(zhì)，會(huì)對(duì)其產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。文獻(xiàn)[11,15]采用ESI離子化方式，本研究發(fā)現(xiàn)ESI離子化方式存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)，導(dǎo)致其響應(yīng)不穩(wěn)定，無(wú)法準(zhǔn)確定量。根據(jù)文獻(xiàn)[16]報(bào)道，可以通過(guò)改變離子化方式解決樣本的基質(zhì)效應(yīng)。液質(zhì)聯(lián)用中3種常用的大氣壓離子化方式的抗基質(zhì)干擾能力依次為：APPI>APCI>ESI，經(jīng)考察，待測(cè)物質(zhì)在APCI模式下的基質(zhì)效應(yīng)較小，符合生物樣本檢測(cè)的相關(guān)要求，故選擇APCI離子化方式。但在APCI模式下監(jiān)測(cè)待測(cè)物的[M+H]+，靈敏度達(dá)不到準(zhǔn)確定量的要求，所以需要更換監(jiān)測(cè)離子以達(dá)到更高的靈敏度。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，待測(cè)物形成的加合離子[M+CH3COO]-靈敏度最高。當(dāng)在流動(dòng)相中加入一定量的乙酸銨后，其靈敏度達(dá)到準(zhǔn)確定量的要求，并且能形成穩(wěn)定的離子峰。因此，最終選擇在APCI模式下監(jiān)測(cè)[M+CH3COO]-。

在流動(dòng)相中加入適當(dāng)?shù)奶砑觿┛梢愿淖兇郎y(cè)物的保留時(shí)間，改善峰形。筆者所在課題組曾比較了在流動(dòng)相中分別加入不同量的甲酸和乙酸的效果。加入甲酸后，HCOO-和CH3COO-競(jìng)爭(zhēng)形成待測(cè)物的加合離子，使待測(cè)物的響應(yīng)明顯降低，且不穩(wěn)定，故選擇乙酸作為添加劑。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入0.1%的乙酸，待測(cè)物峰形良好。同時(shí)采用梯度洗脫程序進(jìn)一步解決基質(zhì)效應(yīng)。

根據(jù)小型豬血漿樣品測(cè)定結(jié)果，二丙酸倍他米松的血藥濃度最大值為51.09 ng·L-1，約有90%的樣品測(cè)得的二丙酸倍他米松血藥濃度低于定量下限。二丙酸倍他米松乳膏是皮膚外用藥，由于透皮吸收的限制，導(dǎo)致其入血量較少；另外，二丙酸倍他米松作為前藥，在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為其活性代謝產(chǎn)物倍他米松。故二丙酸倍他米松的系統(tǒng)暴露量極低。倍他米松的系統(tǒng)暴露量也較低（pg級(jí)），說(shuō)明該皮膚外用制劑安全性較好。

本研究采用2～3月齡的小型豬，其皮膚的生理形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、免疫功能等與人最為接近[17]，且給藥劑量為臨床應(yīng)用的最大劑量，其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)可為臨床研究提供一定參考。本實(shí)驗(yàn)建立了小型豬血漿中二丙酸倍他米松及其代謝物倍他米松的LC-MS/MS同時(shí)測(cè)定方法，符合生物樣本測(cè)定的要求，可為治療藥物的臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)和藥動(dòng)學(xué)研究提供參考。

[1]尤立平, 潘德海.二丙酸倍他米松乳膏治療慢性濕疹臨床觀察[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志, 2011, 25 (10): 827-828.

[2]鄧泮, 陳笑艷, 戴曉健, 等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定家兔血漿中倍他米松[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 29 (3): 326-330.

[3]Vairale A S, Sivaswaroop P, Bandana S.Development and validation of stability-indicating HPLC method for betamethoasone dipropionate and related substances in topical formulation [J].Indian J Pharm Sci, 2012,74 (2): 107-115.

[4]鄭家潤(rùn).皮膚局部用藥的安全性評(píng)價(jià)[J].中國(guó)新藥雜志, 2005,14(3): 257-259.

[5]Nguyen V, Cunningham B B, Eichenfield L F, et al.Treatment of ichthyosiform diseases with topically applied tazarotene: risk of systemic absorption [J].J Am Acad Dermatol, 2007, 57 (5 Suppl): S123-S125.

[6]Cheng W S, Chen J L, Chiang C H.Simultaneous determination of plasma betamethasone disodium phosphate and betamethasone in rabbit by high performance liquid chromatography [J].J Food Drug Anal,2009, 17 (5): 348-356.

[7]Samtani M N, Schwab M, Nathanielsz P W, et al.Stabilization and HPLC analysis of betamethasone sodium phosphate in plasma [J].J Pharm Sci, 2004, 93 (3): 726-732.

[8]Rodchenkov G M, Uralets V P, Semenov V A, et al.Gas chromatographic and mass spectral study of betamethasone synthetic corticosteroid metabolism [J].J Chromatogr, 1988, 432: 283-289.

[9]Samtani M N, Lohle M, Grant A, et al.Betamethasone pharmacokinetics after two prodrug formulations in sheep: implications for antenatal corticosteroid use [J].Drug Metab Dispos, 2005, 33 (8): 1124-1130.

[10]Pereira Ados S, Oliveira L S, Mendes G D, et al.Quantification of betamethasone in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry using atmospheric pressure photoionization in negative mode[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2005, 828 (1/2): 27-32.

[11]曲婷婷, 張蕊, 王本杰, 等.LC-MS/MS法測(cè)定人血漿中倍他米松[J].藥學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 43 (4): 402-407.

[12]Swindle M M, Makin A, Herron A J, et al.Swine as models in biomedical research and toxicology testing [J].Vet Pathol, 2012, 49 (2):344-356.

[13]于勇, 孫魯寧, 杜曉瑯, 等.人尿中對(duì)乙酰氨基苯甲酸和N,N-二甲氨基-2-丙醇的液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定及尿藥排泄特征研究[J].藥學(xué)進(jìn)展,2011, 35 (9): 417-423.

[14]劉園園, 唐立超, 沙克亞, 等.HPLC-MS法測(cè)定氯吡格雷酸人體尿藥濃度及氯吡格雷酸經(jīng)尿排泄研究[J].藥學(xué)進(jìn)展, 2010, 34 (10):463-467.

[15]Zou J J, Dai L, Ding L, et al.Determination of betamethasone and betamethasone 17-monopropionate in human plasma by liquid chromatography–positive/negative electrospray ionization tandem mass spectrometry [J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2008,873 (2): 159-164.

[16]楊靖, 丁黎, 劉文英.LC-MS在體內(nèi)藥物分析方法學(xué)研究中常見的問(wèn)題及其對(duì)策[J].中國(guó)科學(xué):化學(xué), 2010, 40 (6): 611-620.

[17]Mahl J A, Vogel B E, Court M, et al.The minipig in dermatotoxicologymethods and challenges [J].Exp Toxicol Pathol, 2006, 57 (5/6): 341-345.