苧麻纖維素合成酶基因BnCesA4 cDNA序列的克隆與表達(dá)分析

劉昱翔，陳建榮，彭 彥，黃 妤，趙 燕，黃麗華，郭清泉，張學(xué)文*

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128;2長(zhǎng)沙學(xué)院生物工程與環(huán)境科學(xué)系，湖南長(zhǎng)沙410003)

苧麻纖維是最優(yōu)良的植物韌皮纖維之一，具有極佳的彈性和柔軟性，是植物界最長(zhǎng)的優(yōu)質(zhì)纖維。纖維的組成單位纖維素大分子是由多個(gè)D－吡喃葡萄糖殘基以β－1，4－糖苷鍵聯(lián)結(jié)而成的不分枝多糖，在植物體內(nèi)纖維素構(gòu)成纖維素糖苷網(wǎng)，是承受機(jī)械壓力的支撐結(jié)構(gòu)，并調(diào)控植物形態(tài)學(xué)上的某些特性與特征［1］。

Pear等從棉纖維cDNA文庫(kù)中鑒定出2個(gè)纖維素合成酶基因GhCesA1和GhCesA2［2］。植物纖維素合成酶包含保守的D，D，D區(qū)和QXXRW結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)中的第一個(gè)D，天冬氨酸殘基在Mg2+存在的情況下是唯一能夠與尿苷二磷酸－葡萄糖(UDP－glc)結(jié)合的位點(diǎn)，而第三個(gè)D，TED則可能起到催化作用［3，4］。植物纖維素合成酶在氨基酸序列的N－端具有鋅指結(jié)構(gòu)域，這個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)表明植物纖維素合成酶蛋白至少和一個(gè)其他蛋白有互作［5，6］。植物纖維素合成酶共有8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，2個(gè)位于N－端，6個(gè)位于C－端，跨膜結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞質(zhì)膜上形成供新合成糖苷鏈進(jìn)入細(xì)胞壁的通道［7～9］。植物纖維素合成酶基因表達(dá)狀況的研究發(fā)現(xiàn):不同的纖維素合成酶基因在植物不同部位表達(dá)，一種纖維素合成酶基因可以在多個(gè)部位表達(dá)，也可能在某一特定部位專一性地表達(dá)［10～12］。同一細(xì)胞中有多個(gè)纖維素合成酶共同表達(dá)，而不同的纖維素的表達(dá)受到不同的調(diào)控因素的控制［13，14］。

2008年田志堅(jiān)等利用同源克隆的方法克隆獲得了第一個(gè)苧麻纖維素合成酶基因BnCesA1缺少5'端部分堿基的cDNA序列，隨后蔣杰等以此為基礎(chǔ)獲得了BnCesA基因的全長(zhǎng)cDNA序列。半定量實(shí)驗(yàn)表明，BnCesA1在根、莖、葉、芽4種組織中均有表達(dá)，且表現(xiàn)出莖＞葉＞芽＞根的表達(dá)規(guī)律［15～17］。本研究在克隆獲得新的苧麻纖維素合成酶基因基礎(chǔ)上，對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析和熒光定量RTPCR，以為進(jìn)一步研究苧麻韌皮纖維的合成過程提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

苧麻(Boehmeria nivea(Linn.)Gaud.)栽培種湘苧1號(hào)、湘苧3號(hào)、湘潭大葉白、城步青麻均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所提供。

大腸桿菌DH5菌株，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 苧麻纖維素合成酶基因BnCesA4 cDNA序列克隆

通過GenBank下載多種已公布的植物纖維素合成酶基因序列構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)，利用本地BLAST工具與前期研究中獲得的苧麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對(duì)。從苧麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)掘出與多種纖維素合成酶具有較高同源性的片段CL6473。針對(duì)該序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物:

CL6473 Primer F:5'－AATGCCGATGAGGTTTC CAGAG－3'

CL6473 Primer R:5'－AACTGCTCGTTACTCCA CCAATC－3'

以生長(zhǎng)旺盛的湘苧3號(hào)苧麻中上部莖稈組織為材料，提取苧麻總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以其為模板，擴(kuò)增片段 CL6473。擴(kuò)增產(chǎn)物連接pMD18－T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽(yáng)性克隆送交鉑尚生物公司測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

利用TaKaRa公司3'及5'RACE試劑盒分別擴(kuò)增片段CL6473的3'及5'末端cDNA序列。參照試劑盒說明設(shè)計(jì)3'RACE引物 CL6473 RACE3:5'－TACTGTACCTTGCCTGCTATCTG－3'和 5'RACE巢式PCR引物CL6473 5'GSP1:5'－GATTTCCCTCTC TTCTCTCGTAC－3';CL6473 5'GSP2:5'－GCTCTC CGTCCACAGTCACTTC－3'。3'及5'RACE 所得片段送交鉑尚生物公司測(cè)序。

將CL6473核心片段與3'及5'RACE克隆獲得的兩端序列進(jìn)行拼接，最終得到BnCesA4基因全長(zhǎng)cDNA序列。

1.2.2 苧麻纖維素合成酶基因BnCesA4的生物信息學(xué)分析

將BnCesA4序列與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行聯(lián)機(jī)比對(duì)，分析BnCesA4序列與不同植物纖維素合成酶基因的同源關(guān)系。使用軟件DNAMAN查找開放閱讀框，并翻譯蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)BnCesA4蛋白的分子量、等電點(diǎn)等基本理化性質(zhì)。通過NCBI網(wǎng)站Conserved Domain Search Service工具分析蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域。使用 http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/網(wǎng)站預(yù)測(cè)BnCesA4蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.2.3 苧麻纖維素合成酶的進(jìn)化分析

下載多種植物纖維素合成酶氨基酸序列共66條，與3種苧麻纖維素合成酶BnCesA1、BnCesA3和BnCesA4通過MEGA軟件以Neighbor－Joining的方式共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 苧麻纖維素合成酶基因BnCesA4表達(dá)量的熒光定量PCR分析

分離湘苧1號(hào)、湘苧3號(hào)、湘潭大葉白及城步青麻等4個(gè)品種的成熟階段莖稈，分韌皮部和木質(zhì)部組織并提取總RNA。這4個(gè)品種的苧麻在原麻產(chǎn)量和纖維支數(shù)上都有明顯差異，湘苧1號(hào)高產(chǎn)中支，湘苧3號(hào)高產(chǎn)高支，湘潭大葉白中產(chǎn)低支，城步青麻低產(chǎn)高支［18］。依據(jù)熒光定量引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)BnCesA4基因熒光定量引物:

RT F:5'－ ATGGAGGAATGGAGGAAGAAG －3'

RT R:5'－ AGAATCACAATCCGAAGAAGG －3'

擴(kuò)增片段長(zhǎng)度200 bp。選擇肌動(dòng)蛋白Actin1作為內(nèi)照基因。Actin1基因上下游引物分別為Actin F:5'－GCTCCGTTGAACCCTAAG－3';Actin R:5'－CGATTGTGATGATTT－3'。使用TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)熒光定量試劑盒完成熒光定量實(shí)驗(yàn)，分析BnCesA4基因在4個(gè)代表性苧麻品種的木質(zhì)部與韌皮部中的表達(dá)差異。

2 結(jié)果分析

2.1 苧麻纖維素合成酶基因BnCesA4 cDNA序列克隆與生物信息學(xué)分析

將核心片段CL6473與通過3'及5'RACE獲得的兩端序列進(jìn)行拼接，得到長(zhǎng)度為4 008 bp的cDNA序列。BnCesA4基因編碼區(qū)全長(zhǎng)3 270 bp，5'端非編碼區(qū)236 bp，3'端非編碼區(qū)502 bp，推測(cè)其編碼一個(gè)1 090 aa的蛋白質(zhì)，預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量123.0 kD，理論等電點(diǎn)為7.63。苧麻纖維素合成酶基因BnCesA4 cDNA核苷酸序列及相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列如圖1所示。

圖1 BnCesA4基因cDNA序列及推測(cè)的蛋白質(zhì)序列Fig.1 The cDNA sequence and its putative protein sequences of BnCesA4 gene

將BnCesA4序列與GenBank進(jìn)行聯(lián)機(jī)BLAST分析，結(jié)果顯示其核酸序列與亮葉樺(Betula luminifera CesA8 KC204972)、歐洲/美洲山楊(Populus tremula×Populus tremuloides CesA2 AY573572)、栽培種毛白楊(Populus tomentosa cultivar CV－BJHR01 CesA5 HQ585873)、陸地棉(Gossypium hirsutum CesA9 JQ345699)、蓖麻(Ricinus communis CesA6 XM_002524253)等序列同源達(dá)到80%以上;其氨基酸序列與可可(Theobroma cacao CesA6 XP_007019545)、蓖麻(Ricinus communis CesA6 XP_002524299)、亮葉樺(Betula luminifera CesA8 AGV22110)、陸地棉(Gossypium hirsutum CesA9 AFB18639)、毛白楊(Populus tomentosa CesA AFZ78561)序列同源均超過85%。將BnCesA4氨基酸序列與AtCesA1和兩種已在GenBank中登錄的苧麻纖維素合成酶BnCesA1、BnCesA3進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果如圖2所示。比對(duì)結(jié)果顯示，BnCesA4在氨基酸序列上與3種纖維素合成酶有很高的相似度，這表明克隆獲得的BnCesA4序列為BnCesA基因家族成員。BnCesA4蛋白TMHMM預(yù)測(cè)顯示具有8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(287～304、311 ～330、867 ～889、901 ～923、938 ～960、985～1007、1022～1044、1 049～1 071)，2個(gè)位于 N 端，6個(gè)位于C端。氨基酸序列N端39～82位置上具有鋅指結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為在纖維素合成酶各亞基之間的相互作用上起到重要作用，在氨基酸829～833的位置上有與底物結(jié)合和催化相關(guān)的QVLRW保守結(jié)構(gòu)域。研究顯示，纖維素合成酶是N－糖基化的，在擬南芥的研究中也證實(shí)CesA蛋白是被磷酸化的，而這些修飾對(duì)蛋白質(zhì)的活性是極為重要的。motif預(yù)測(cè)顯示，BnCesA4有5個(gè)糖基化位點(diǎn)(123～126、142～145、577 ～580、822 ～825、964 ～967)。BnCesA4具有1個(gè)CAMP磷酸化位點(diǎn)(691～694)和9個(gè)酪氨酸激酶(CK2)磷酸化位點(diǎn)(30～33、148 ～151、343 ～346、369 ～372、492 ～495、727 ～730、743 ～746、787 ～790、917 ～920)。

圖2 AtCesA1、BnCesA1、BnCesA3與BnCesA4蛋白質(zhì)序列比對(duì)結(jié)果Fig.2 Multiple Alignment of protein sequence of AtCesA1，BnCesA1，BnCesA3 and BnCesA4

2.2 苧麻纖維素合成酶的進(jìn)化分析

從GenBank下載多種植物纖維素合成酶氨基酸序列與苧麻纖維素合成酶BnCesA1、BnCesA3和BnCesA4共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，以了解纖維素合成酶之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，實(shí)心圓指示出3種苧麻纖維素合成酶。

圖3 纖維素合成酶基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of cellulose synthase genes from different species

系統(tǒng)發(fā)育樹顯示木本植物與草本植物CesA在系統(tǒng)發(fā)育樹中呈分散分布，沒有出現(xiàn)木本植物或草本植物CesA聚集的分枝，推測(cè)CesA的分化應(yīng)早于草本植物與木本植物的分化。而不同植物的纖維素合成酶在系統(tǒng)發(fā)育樹中的分布也分散，CesA的分化早于這些物種出現(xiàn)。某些同一物種的多個(gè)CesA分布在同一分枝上，如可可纖維素合成酶TcCesA1、2、3、4，可能是相同基因產(chǎn)生的多個(gè)拷貝，纖維素合成酶家族成員之間可能在功能上存在冗余。BnCesA4在進(jìn)化關(guān)系上與GhCesA9最為接近。

2.3 苧麻纖維素合成酶基因BnCesA4表達(dá)量的熒光定量PCR分析

熒光定量實(shí)驗(yàn)選擇在BnCesA4基因高可變區(qū)設(shè)計(jì)引物，有效避免了具有較高同源性的纖維素合成酶家族其他基因的影響，溶解曲線峰值單一，引物特異性良好。采用雙Δct法對(duì)熒光定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，獲得BnCesA4基因在不同品種的木質(zhì)部與韌皮部的表達(dá)量關(guān)系如圖4所示。

BnCesA4基因在4個(gè)品種的苧麻木質(zhì)部和韌皮部都有表達(dá)，其中在城步青麻韌皮部表達(dá)量最高，在湘苧1號(hào)木質(zhì)部中表達(dá)量最低，湘苧1號(hào)中韌皮部表達(dá)量是木質(zhì)部表達(dá)量的2倍，而其他品種中韌皮部與木質(zhì)部的表達(dá)量差距都不大。除湘苧3號(hào)中木質(zhì)部表達(dá)量略高于韌皮部外，在其他3個(gè)品種中都表現(xiàn)出韌皮部的表達(dá)量高于木質(zhì)部。BnCesA4基因在4個(gè)品種韌皮部表達(dá)水平差異較小，說明BnCesA4在4個(gè)品種的苧麻韌皮纖維的合成過程中表達(dá)量穩(wěn)定。4個(gè)品種苧麻韌皮部表達(dá)水平與苧麻的原麻產(chǎn)量和纖維支數(shù)之間并沒有發(fā)現(xiàn)直接聯(lián)系，如湘潭大葉白屬于中產(chǎn)低支的苧麻品種，但其韌皮部BnCesA4基因表達(dá)量高于屬于高產(chǎn)高支品種的湘苧3號(hào)。

圖4 苧麻品種間木質(zhì)部與韌皮部BnCesA4基因表達(dá)差異Fig.4 Differential expression of BnCesA4 in phloem and xylem among different ramie varieties

3 結(jié)論與討論

田志堅(jiān)和蔣杰克隆獲得了第一個(gè)苧麻纖維素合成酶基因BnCesA1，并通過半定量RT－PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BnCesA1基因在根、莖、葉和芽組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量有差異。苧麻具有發(fā)達(dá)的韌皮部纖維，是重要的紡織工業(yè)原料，而利用苧麻木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物能源成為苧麻研究的熱點(diǎn)，木質(zhì)纖維的質(zhì)量直接關(guān)系到生產(chǎn)成本與轉(zhuǎn)化過程中的二次污染。本研究克隆獲得了BnCesA4基因全長(zhǎng)cDNA序列，利用多種已知植物纖維素合成酶氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，更重點(diǎn)關(guān)注了該基因在苧麻莖稈的韌皮部及木質(zhì)部中的表達(dá)。BnCesA4基因在苧麻莖稈韌皮部與木質(zhì)部都有表達(dá)，其參與了苧麻韌皮纖維的合成過程，但不具有韌皮部表達(dá)的特異性。同時(shí)筆者也發(fā)現(xiàn)在纖維素集中合成的韌皮部中，BnCesA4基因的表達(dá)量并沒有極顯著的高于木質(zhì)部，而BnCesA4的表達(dá)量與苧麻纖維產(chǎn)量與品質(zhì)也沒有直接的聯(lián)系。其可能原因:首先，纖維素的生物合成過程是多個(gè)纖維素合成酶共同參與的結(jié)果，某一種纖維素合成酶并不能決定纖維素的產(chǎn)量與品質(zhì)。其次，纖維素合成酶需要與其他多種蛋白構(gòu)成復(fù)合體來行使功能，纖維素合成酶直接合成纖維素，而調(diào)節(jié)纖維素的產(chǎn)量與質(zhì)量則由其他類型的蛋白完成，如纖維素內(nèi)切酶對(duì)合成的葡聚糖鏈的修飾與加工過程，最終使其轉(zhuǎn)化為纖維素微纖絲［19～21］。第三，原麻產(chǎn)量與纖維支數(shù)取決于多種因素的共同作用，如原麻膠質(zhì)含量、苧麻纖維分子結(jié)晶度等［18］。所以要實(shí)現(xiàn)利用基因工程手段改良苧麻纖維產(chǎn)量與品質(zhì)，需要克隆獲得更多苧麻纖維素合成酶基因家族成員，并對(duì)其表達(dá)規(guī)律有充分的認(rèn)識(shí)，在此基礎(chǔ)上完善對(duì)纖維素合成酶復(fù)合體的研究，從分子層面上進(jìn)一步闡明苧麻特殊的纖維發(fā)育機(jī)制。

［1］Brown RMJr，Saxena IM.Cellulose biosynthsis:a model for understanding the assembly of biopolymers［J］.Plant Physiol Biochem，2000，38(1/2):57 －67.

［2］Pear J，Kawagoe Y，Schreckengost W，et al.Higher plants contain homologs of the bacterial CelA genes encoding the catalytic subunit of the cellulose synthase［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93:12637 －12642.

［3］Charnock SJ，Davies GJ.Structure of the nucleotidediphospho － sugar transferase，SpsA，from Bacillus subtilis，in native and nucleotide － complexed forms［J］.Biochemistry，1999，38:6380 －6385.

［4］Morgan JLW，Joanna Strumillo，Jochen Zimmer.Crystallographic snapshot of cellulose synthesis and membrane translocation［J］.Nature，2013，493:181 －186.

［5］Kawagoe Y，Delmer DP.Pathway and genes in involved in cellulose biosynthesis［J］.Genet Eng，1997，19:63 －87.

［6］Kawagoe Y，Delmer DP.Cotton CelA1 has a LIM － like Zn binding domain in the N－terminal cytoplasmic region［J］.Plant Physio，1997b，114:85.

［7］Darby M Harris，Kendall Corbin，Tuo Wang，et al.Cellulose microfibril crystallinity is reduced by mutating C－terminal transmembrane region residues CESA1A903V and CESA3T942I of cellulose synthase ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2012，109:4098 －4103.

［8］Zhang B，Deng L，Qian Q，et al.A missense mutation in the transmembrane domain of CESA4 affects protein abundance in the plasma membrane and results in abnormal cell wall biosynthesis in rice ［J］.Plant Mol Biol，2009，71:509 －524.

［9］Kurek I，Kawagoe Y，Jacob － Wilk D.Dimerization of cotton fiber cellulose synthase catalytic subunits occurs via oxidation of the zinc － binding domains［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99:11109 －11114.

［10］Turner SR，Somerville CR.Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition innthe secondary cell wall［J］.Plant Cell，1997，9:689－701.

［11］Taylor NG，Scheible WR，Cutler S，et al.The irregular xylem 3 locus of Arabidopsis encodes a cellulose synthase required for secondary cell wall synthesis［J］.Plant Cell，1999，11:769 －779.

［12］Olawole OO，Evert J，Vincken JP，et al.Differential expression of cellulose synthase(CesA)gene transcriptsin potato as revealed by QRT － PCR［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2009，47:1116 －1118.

［13］Richmond TA，Somerville CR.The cellulose synthase superfamily［J］.Plant Physiol，2000，124:495 －498.

［14］Monika S Doblin，Isaac Kurek，Deborah Jacob － Wilk，et al.Cellulose biosynthesis in plants:from genes to rosettes［J］.Plant and Cell Physiology，2002，43(12):1407 －1420.

［15］田志堅(jiān)，易 蓉，陳建榮，等.苧麻纖維素合成酶基因cDNA 的克隆及表達(dá)分析［J］.作物學(xué)報(bào)，2008，34(1):78－83.

［16］易 蓉，田志堅(jiān)，黃麗華，等.苧麻纖維素合成酶基因cDNA的功能分析［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，35(1):13 －16.

［17］蔣 杰，揭雨成，周清明，等.苧麻纖維素合酶基因BnCesA1全長(zhǎng)cDNA的克隆與表達(dá)分析［J］.植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2012，13(5):851 －857.

［18］郭清泉，胡日生，孫煥良，等.苧麻膠質(zhì)的基因型差異與成因及育種中利用研究Ⅰ.苧麻膠質(zhì)及其組分含量的基因型差異［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2000，26(5):340 －342.