延安地區(qū)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的RT－PCR檢測與序列分析

馮光惠，杜虎平，李夏隆，亢福仁

(榆林學院生命科學學院，陜西榆林 719000)

馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(Potato spindle tuber viroid，PSTVd)是由類病毒(viroid)引起的危害馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害，PSTVd通常減產(chǎn)20% ～60%，嚴重可導致馬鈴薯種質(zhì)退化，與馬鈴薯X病毒、Y病毒等病毒復合侵染時減產(chǎn)更嚴重，給農(nóng)民造成巨大的經(jīng)濟損失。PSTVd極易通過種薯(苗)、花粉、種子、機械或昆蟲等多種途徑傳播，侵染后潛伏期長并持續(xù)感染，不能經(jīng)過莖尖脫毒除去，因而篩選無毒馬鈴薯種苗是減輕病害、保持優(yōu)良種質(zhì)、提高馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)的有效措施。建立快速、靈敏、準確的類病毒檢測技術是保證無毒種苗(薯)生產(chǎn)的關鍵［1］。

PSTVd是一種無蛋白質(zhì)外殼的侵染性單鏈環(huán)狀RNA分子。由于沒有蛋白質(zhì)外殼，不具有抗原性，不能采用血清學方法檢測。近年來，RT－PCR檢測技術廣泛應用于馬鈴薯各種病毒和紡錘塊莖類病毒的檢測，在病毒或類病毒含量極低時也可以快速檢測，該方法具有靈敏、快速、準確度高、特異性強等優(yōu)點，適用于馬鈴薯及其他植物病毒或類病毒的檢測。國內(nèi)研究者采用RT－PCR方法檢測了不同地區(qū)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒。董代幸等［2］檢測了烏魯木齊地區(qū)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒，并擴增出251 bp的目的片段，與國內(nèi)外已報道的核酸序列同源性達93.6% ～99.2%;吳志明等［3］檢測了河北地區(qū)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒，并擴增出360 bp的目的片段，與國內(nèi)外已報道的核酸序列同源性達98%以上;呂典秋等［4］檢測了東北地區(qū)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒，擴增出359 bp的目的片段，在與國外序列比較中發(fā)現(xiàn)了互換和突變現(xiàn)象。在RT－PCR檢測技術基礎上，王中康等［5］和 Nie等［6］應用多重 RT －PCR技術分別檢測了馬鈴薯PVX、PVY、PVA、PVS、PLRV 5種病毒和1種紡錘類病毒(PSTVd)，極大地提高了馬鈴薯病毒和類病毒的檢測效率。

延安地區(qū)的馬鈴薯種植面積約占陜西省馬鈴薯種植總面積的20%，馬鈴薯是帶動地方農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展的重要農(nóng)作物，每年不斷增加脫毒種薯種植面積和引進新品種，隨著種植年代的增加，病毒在馬鈴薯體內(nèi)不斷積累，嚴重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前尚未見用RT－PCR法檢測和分析延安地區(qū)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的報道。本試驗以延安地區(qū)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)種植2～3代的疑似帶病毒馬鈴薯為研究對象，采用RT－PCR方法檢測該地區(qū)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd)，并對PSTVd基因序列進行分析，了解PSTVd的變異程度，以期為脫毒馬鈴薯的種苗(薯)繁育和推廣種植提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)樣品的采集。在馬鈴薯生長盛期至成熟期，采集馬鈴薯疑似帶病毒植株葉片，于常溫下保存于保濕組織培養(yǎng)瓶中，運回實驗室后于4℃冰箱保存。馬鈴薯樣品信息見表1。

表1 本研究中所用馬鈴薯樣品信息

(2)儀器與試劑。主要儀器有PCR儀、高速冷凍離心機、電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)。Trizol試劑及cDNA合成試劑盒、DNA膠回收試劑盒、pGEMTeasy載體、Taq DNA 聚合酶、dNTP、10×buffer均購自北京全式金生物科技有限公司。

(3)引物設計。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒基因組序列，利用引物設計軟件Primer 5設計1對特異引物，上游引物為5'－GAAACCTGGAGCGAACTG－3'，下游引物為5'－CG GTTCCAAGGGCTAAAC－3'。預期擴增片段長度為251 bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，將其用滅菌TE(pH 8.0)稀釋至濃度為10 μmol/L。

1.2 方法

(1)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的RT－PCR檢測。

馬鈴薯總RNA的提取。采用Trizol法，參照文獻［7］方法進行，略做改動。具體步驟是:稱取0.1 g馬鈴薯葉片在研缽中用液氮研磨，取1.5 mL離心管加入1 mL Trizol液，將研磨液與Trizol液混合均勻;4℃、12 000 r/min離心15 min;轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，加入0.2 mL氯仿，渦旋混勻，室溫放置5 min，4℃、12 000 r/min 離心 15 min;取上清液(水相)于另一離心管中，按上清液體積分別加入1/2體積的異戊醇、0.8 mol/L檸檬酸鈉和1.2 mol/L氯化鈉，混合均勻，室溫放置5～10 min，4℃、12 000 r/min離心8 min，棄上清液，用1 mL 75%的乙醇洗滌沉淀2次，4℃、12 000 r/min離心15 min，小心倒掉乙醇，室溫自然干燥后溶于用 DEPC處理過的ddH2O，于－80℃條件下保存。

cDNA的合成。按照cDNA合成試劑盒說明書操作，對提取的馬鈴薯葉片總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。具體反應體系如下:馬鈴薯總RNA 5 μL，Anchored Oligo(dT)18(0.5 μg/μL)1 μL，2 × ES Reaction Mix 10 μL，EasyScript RT Enzyme Mix 1 μL，加 RNase －free Water至20 μL?；靹蚝螅″佒?2℃孵育30 min，PCR儀中于85℃條件下加熱失活5 min。

PCR反應及產(chǎn)物檢測。PCR反應體系:cDNA 3 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，10 × buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，Taq DNA 聚合酶1 μL，加ddH2O至 50 μL。PCR反應程序:94℃ 5min;94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個循環(huán);72℃10 min。取 6 μL PCR 擴增產(chǎn)物與 1 μL Loading Buffer混勻，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，于凝膠成像系統(tǒng)中照相。

(2)克隆及序列分析。用DNA膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，將其與pGEM－Teasy載體連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1－T1感受態(tài)細胞，在加有IPTG和X－gal的LB平板上篩選白色菌落，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用堿裂解法提取質(zhì)粒，采用EcoRⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒進行鑒定。將含目的條帶的陽性重組質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。用DNAstar軟件分析類病毒基因序列相似性，并與GenBank中搜索國內(nèi)外14個不同地區(qū)(表2)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒基因進行序列相似性分析。

表2 國內(nèi)外14個不同地區(qū)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒序列的信息

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的RT－PCR檢測

對采自延安地區(qū)8個縣(區(qū))不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)馬鈴薯葉片所含紡錘塊莖類病毒的 RT－PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)均能擴增出預期長度的目的條帶(圖1)，表明這些馬鈴薯植株均感染了PSTVd。

圖1 馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的RT－PCR檢測結果

2.2 馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的序列一致性分析

用DNAstar軟件對馬鈴薯紡錘塊莖類病毒序列進行分析，結果表明，延安地區(qū)8個縣(區(qū))各鄉(xiāng)鎮(zhèn)PSTVd序列大小為247～251 bp，出現(xiàn)少量堿基突變或缺失，并對編碼的氨基酸產(chǎn)生影響，該地區(qū)8個采樣點之間的序列一致性也有所差異，處在98.2% ～99.7%之間，表明該地區(qū)部分鄉(xiāng)鎮(zhèn)的PSTVd基因序列發(fā)生了一定程度的變異。其中，志丹縣順寧鎮(zhèn)、安塞縣化子坪鎮(zhèn)和寶塔區(qū)萬花鄉(xiāng)之間的序列一致性為99.7%;子長縣欒家坪鄉(xiāng)和延川縣馬家河鄉(xiāng)之間的序列一致性為99.5%;宜川縣丹川鎮(zhèn)、富縣直羅鎮(zhèn)、吳起縣鐵邊城鎮(zhèn)和其它鄉(xiāng)鎮(zhèn)之間的序列一致性相對較低。就地理位置而言，延安地區(qū)中南部的宜川縣丹川鎮(zhèn)、富縣直羅鎮(zhèn)的PSTVd變異程度較高，北部縣區(qū)各鄉(xiāng)鎮(zhèn)的PSTVd變異較輕。以志丹縣順寧鎮(zhèn)、延川縣馬家河鄉(xiāng)、宜川縣丹川鎮(zhèn)、富縣直羅鎮(zhèn)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒基因序列為對照，與國內(nèi)外其他地區(qū)14個樣品的PSTVd基因進行比較，序列一致性在80.4% ～99.2%(表3)。

表3 馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的序列一致性分析

3 討論

本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，延安地區(qū)8個縣(區(qū))不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)最近幾年都在推廣種植脫毒馬鈴薯，但一級脫毒種薯種植2～3年后，馬鈴薯植株出現(xiàn)不同癥狀，產(chǎn)量也呈逐年下降趨勢，說明馬鈴薯單一病毒(類病毒)或各種復合病毒在馬鈴薯體內(nèi)存在。原因之一是地方檢疫部門對馬鈴薯脫毒苗及各級種薯的檢驗檢疫監(jiān)督不嚴，造成將帶毒種薯發(fā)放給農(nóng)民種植;二是脫毒馬鈴薯都是通過莖尖剝離組織培養(yǎng)脫毒的，而馬鈴薯紡錘塊莖類病毒很難通過莖尖剝離脫毒，造成多數(shù)脫毒種苗(薯)脫除了病毒，實際還攜帶類病毒，只是單獨類病毒對產(chǎn)量和品質(zhì)的影響不夠明顯，在田間種植2～3代后，與其他病毒復合感染，從而造成產(chǎn)量和品質(zhì)明顯下降。

RT－PCR分子檢測技術可快速、準確地檢測馬鈴薯的帶毒情況，是近年來國內(nèi)外應用較為普遍的病毒檢測技術，該技術的應用對脫毒馬鈴薯種薯的推廣及馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。筆者認為，在普通RT－PCR體系中，只要提取的馬鈴薯總RNA品質(zhì)高，在檢測不同種類的病毒和類病毒時，設計不同的特異引物，就能擴增出預期的目的條帶，而且不會發(fā)生假陰性現(xiàn)象，檢測效果好。另外，在用RT－PCR檢測類病毒PSTVd以及常見的6種病毒PVX、PVY、PVS、PVA、PVM 和 PLRV 時，可通過改變PCR反應體系中的溫度，從而在PCR儀中實現(xiàn)多種病毒的同步檢測。

通過克隆測序，可了解馬鈴薯病毒或類病毒的變異程度。馬鈴薯不同病毒或類病毒的變異也有差異，本試驗研究延安地區(qū)8縣(區(qū))不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)馬鈴薯紡錘類病毒基因的序列一致性在98.2%～99.7%，而同為陜北地區(qū)的榆林10縣區(qū)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的PSTVd的序列一致性均在99.7%以上，病毒變異率高低以及不同地區(qū)病毒變異率差異大小是否會對馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生影響，單一病毒或類病毒及復合病毒感染對產(chǎn)量和品質(zhì)的影響關系都有待進一步研究。

［1］Navarro B，Silletti MR，Serio FD.Identification and characterization of potato spindle tuber viroid infecting tomato in Italy［J］.Journal of Plant Pathology，2009，91(3):723－726.

［2］董代幸，羅 明，王麗麗，等.烏魯木齊地區(qū)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的檢測與序列分析［J］.西北農(nóng)業(yè)學報，2010，19(9):38 －42.

［3］吳志明，賈曉梅，謝曉亮，等.馬鈴薯紡錘塊莖類病毒RT－PCR檢測及全序列分析［J］.華北農(nóng)學報，2003，18(S1):63－65.

［4］呂典秋，李學湛，楊希才，等.馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd)東北分離物的核苷酸序列分析［J］.農(nóng)業(yè)生物技術學報，2005，13(1):131 －132.

［5］王中康，夏玉先，袁 青，等.馬鈴薯種苗復合感染病毒多重RT－PCR同步快速檢測［J］.植物病理學報，2005，35(2):109 －115.

［6］Nie X，Singh RP.A novel usage of random primers for multiplex RT－PCR detection of virus and viroid in aphids，leaves，and tubers［J］.Journal of Virological Methods，2001，91(1):37 －49.

［7］Courtney EJ，Amy OC，David KW.Evaluation of isolation methods and RNA integrity for bacterial RNA quantitation［J］.Journal of Microbiological Methods，2008，75(2):318－324.