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    延安地區(qū)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的RT-PCR檢測與序列分析

    2014-12-05 02:59:44馮光惠杜虎平李夏隆亢福仁
    作物研究 2014年5期
    關鍵詞:紡錘塊莖一致性

    馮光惠,杜虎平,李夏隆,亢福仁

    (榆林學院生命科學學院,陜西榆林 719000)

    馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(Potato spindle tuber viroid,PSTVd)是由類病毒(viroid)引起的危害馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害,PSTVd通常減產(chǎn)20% ~60%,嚴重可導致馬鈴薯種質(zhì)退化,與馬鈴薯X病毒、Y病毒等病毒復合侵染時減產(chǎn)更嚴重,給農(nóng)民造成巨大的經(jīng)濟損失。PSTVd極易通過種薯(苗)、花粉、種子、機械或昆蟲等多種途徑傳播,侵染后潛伏期長并持續(xù)感染,不能經(jīng)過莖尖脫毒除去,因而篩選無毒馬鈴薯種苗是減輕病害、保持優(yōu)良種質(zhì)、提高馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)的有效措施。建立快速、靈敏、準確的類病毒檢測技術是保證無毒種苗(薯)生產(chǎn)的關鍵[1]。

    PSTVd是一種無蛋白質(zhì)外殼的侵染性單鏈環(huán)狀RNA分子。由于沒有蛋白質(zhì)外殼,不具有抗原性,不能采用血清學方法檢測。近年來,RT-PCR檢測技術廣泛應用于馬鈴薯各種病毒和紡錘塊莖類病毒的檢測,在病毒或類病毒含量極低時也可以快速檢測,該方法具有靈敏、快速、準確度高、特異性強等優(yōu)點,適用于馬鈴薯及其他植物病毒或類病毒的檢測。國內(nèi)研究者采用RT-PCR方法檢測了不同地區(qū)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒。董代幸等[2]檢測了烏魯木齊地區(qū)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒,并擴增出251 bp的目的片段,與國內(nèi)外已報道的核酸序列同源性達93.6% ~99.2%;吳志明等[3]檢測了河北地區(qū)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒,并擴增出360 bp的目的片段,與國內(nèi)外已報道的核酸序列同源性達98%以上;呂典秋等[4]檢測了東北地區(qū)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒,擴增出359 bp的目的片段,在與國外序列比較中發(fā)現(xiàn)了互換和突變現(xiàn)象。在RT-PCR檢測技術基礎上,王中康等[5]和 Nie等[6]應用多重 RT -PCR技術分別檢測了馬鈴薯PVX、PVY、PVA、PVS、PLRV 5種病毒和1種紡錘類病毒(PSTVd),極大地提高了馬鈴薯病毒和類病毒的檢測效率。

    延安地區(qū)的馬鈴薯種植面積約占陜西省馬鈴薯種植總面積的20%,馬鈴薯是帶動地方農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展的重要農(nóng)作物,每年不斷增加脫毒種薯種植面積和引進新品種,隨著種植年代的增加,病毒在馬鈴薯體內(nèi)不斷積累,嚴重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前尚未見用RT-PCR法檢測和分析延安地區(qū)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的報道。本試驗以延安地區(qū)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)種植2~3代的疑似帶病毒馬鈴薯為研究對象,采用RT-PCR方法檢測該地區(qū)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd),并對PSTVd基因序列進行分析,了解PSTVd的變異程度,以期為脫毒馬鈴薯的種苗(薯)繁育和推廣種植提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    (1)樣品的采集。在馬鈴薯生長盛期至成熟期,采集馬鈴薯疑似帶病毒植株葉片,于常溫下保存于保濕組織培養(yǎng)瓶中,運回實驗室后于4℃冰箱保存。馬鈴薯樣品信息見表1。

    表1 本研究中所用馬鈴薯樣品信息

    (2)儀器與試劑。主要儀器有PCR儀、高速冷凍離心機、電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)。Trizol試劑及cDNA合成試劑盒、DNA膠回收試劑盒、pGEMTeasy載體、Taq DNA 聚合酶、dNTP、10×buffer均購自北京全式金生物科技有限公司。

    (3)引物設計。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中登錄的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒基因組序列,利用引物設計軟件Primer 5設計1對特異引物,上游引物為5'-GAAACCTGGAGCGAACTG-3',下游引物為5'-CG GTTCCAAGGGCTAAAC-3'。預期擴增片段長度為251 bp,引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,將其用滅菌TE(pH 8.0)稀釋至濃度為10 μmol/L。

    1.2 方法

    (1)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的RT-PCR檢測。

    馬鈴薯總RNA的提取。采用Trizol法,參照文獻[7]方法進行,略做改動。具體步驟是:稱取0.1 g馬鈴薯葉片在研缽中用液氮研磨,取1.5 mL離心管加入1 mL Trizol液,將研磨液與Trizol液混合均勻;4℃、12 000 r/min離心15 min;轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中,加入0.2 mL氯仿,渦旋混勻,室溫放置5 min,4℃、12 000 r/min 離心 15 min;取上清液(水相)于另一離心管中,按上清液體積分別加入1/2體積的異戊醇、0.8 mol/L檸檬酸鈉和1.2 mol/L氯化鈉,混合均勻,室溫放置5~10 min,4℃、12 000 r/min離心8 min,棄上清液,用1 mL 75%的乙醇洗滌沉淀2次,4℃、12 000 r/min離心15 min,小心倒掉乙醇,室溫自然干燥后溶于用 DEPC處理過的ddH2O,于-80℃條件下保存。

    cDNA的合成。按照cDNA合成試劑盒說明書操作,對提取的馬鈴薯葉片總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。具體反應體系如下:馬鈴薯總RNA 5 μL,Anchored Oligo(dT)18(0.5 μg/μL)1 μL,2 × ES Reaction Mix 10 μL,EasyScript RT Enzyme Mix 1 μL,加 RNase -free Water至20 μL?;靹蚝螅″佒?2℃孵育30 min,PCR儀中于85℃條件下加熱失活5 min。

    PCR反應及產(chǎn)物檢測。PCR反應體系:cDNA 3 μL,上游引物 1 μL,下游引物 1 μL,10 × buffer 5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 4 μL,Taq DNA 聚合酶1 μL,加ddH2O至 50 μL。PCR反應程序:94℃ 5min;94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,35 個循環(huán);72℃10 min。取 6 μL PCR 擴增產(chǎn)物與 1 μL Loading Buffer混勻,用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,于凝膠成像系統(tǒng)中照相。

    (2)克隆及序列分析。用DNA膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物,將其與pGEM-Teasy載體連接過夜,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞,在加有IPTG和X-gal的LB平板上篩選白色菌落,于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),采用堿裂解法提取質(zhì)粒,采用EcoRⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒進行鑒定。將含目的條帶的陽性重組質(zhì)粒送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。用DNAstar軟件分析類病毒基因序列相似性,并與GenBank中搜索國內(nèi)外14個不同地區(qū)(表2)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒基因進行序列相似性分析。

    表2 國內(nèi)外14個不同地區(qū)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒序列的信息

    2 結果與分析

    2.1 馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的RT-PCR檢測

    對采自延安地區(qū)8個縣(區(qū))不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)馬鈴薯葉片所含紡錘塊莖類病毒的 RT-PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,結果發(fā)現(xiàn)均能擴增出預期長度的目的條帶(圖1),表明這些馬鈴薯植株均感染了PSTVd。

    圖1 馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的RT-PCR檢測結果

    2.2 馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的序列一致性分析

    用DNAstar軟件對馬鈴薯紡錘塊莖類病毒序列進行分析,結果表明,延安地區(qū)8個縣(區(qū))各鄉(xiāng)鎮(zhèn)PSTVd序列大小為247~251 bp,出現(xiàn)少量堿基突變或缺失,并對編碼的氨基酸產(chǎn)生影響,該地區(qū)8個采樣點之間的序列一致性也有所差異,處在98.2% ~99.7%之間,表明該地區(qū)部分鄉(xiāng)鎮(zhèn)的PSTVd基因序列發(fā)生了一定程度的變異。其中,志丹縣順寧鎮(zhèn)、安塞縣化子坪鎮(zhèn)和寶塔區(qū)萬花鄉(xiāng)之間的序列一致性為99.7%;子長縣欒家坪鄉(xiāng)和延川縣馬家河鄉(xiāng)之間的序列一致性為99.5%;宜川縣丹川鎮(zhèn)、富縣直羅鎮(zhèn)、吳起縣鐵邊城鎮(zhèn)和其它鄉(xiāng)鎮(zhèn)之間的序列一致性相對較低。就地理位置而言,延安地區(qū)中南部的宜川縣丹川鎮(zhèn)、富縣直羅鎮(zhèn)的PSTVd變異程度較高,北部縣區(qū)各鄉(xiāng)鎮(zhèn)的PSTVd變異較輕。以志丹縣順寧鎮(zhèn)、延川縣馬家河鄉(xiāng)、宜川縣丹川鎮(zhèn)、富縣直羅鎮(zhèn)的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒基因序列為對照,與國內(nèi)外其他地區(qū)14個樣品的PSTVd基因進行比較,序列一致性在80.4% ~99.2%(表3)。

    表3 馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的序列一致性分析

    3 討論

    本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn),延安地區(qū)8個縣(區(qū))不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)最近幾年都在推廣種植脫毒馬鈴薯,但一級脫毒種薯種植2~3年后,馬鈴薯植株出現(xiàn)不同癥狀,產(chǎn)量也呈逐年下降趨勢,說明馬鈴薯單一病毒(類病毒)或各種復合病毒在馬鈴薯體內(nèi)存在。原因之一是地方檢疫部門對馬鈴薯脫毒苗及各級種薯的檢驗檢疫監(jiān)督不嚴,造成將帶毒種薯發(fā)放給農(nóng)民種植;二是脫毒馬鈴薯都是通過莖尖剝離組織培養(yǎng)脫毒的,而馬鈴薯紡錘塊莖類病毒很難通過莖尖剝離脫毒,造成多數(shù)脫毒種苗(薯)脫除了病毒,實際還攜帶類病毒,只是單獨類病毒對產(chǎn)量和品質(zhì)的影響不夠明顯,在田間種植2~3代后,與其他病毒復合感染,從而造成產(chǎn)量和品質(zhì)明顯下降。

    RT-PCR分子檢測技術可快速、準確地檢測馬鈴薯的帶毒情況,是近年來國內(nèi)外應用較為普遍的病毒檢測技術,該技術的應用對脫毒馬鈴薯種薯的推廣及馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。筆者認為,在普通RT-PCR體系中,只要提取的馬鈴薯總RNA品質(zhì)高,在檢測不同種類的病毒和類病毒時,設計不同的特異引物,就能擴增出預期的目的條帶,而且不會發(fā)生假陰性現(xiàn)象,檢測效果好。另外,在用RT-PCR檢測類病毒PSTVd以及常見的6種病毒PVX、PVY、PVS、PVA、PVM 和 PLRV 時,可通過改變PCR反應體系中的溫度,從而在PCR儀中實現(xiàn)多種病毒的同步檢測。

    通過克隆測序,可了解馬鈴薯病毒或類病毒的變異程度。馬鈴薯不同病毒或類病毒的變異也有差異,本試驗研究延安地區(qū)8縣(區(qū))不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)馬鈴薯紡錘類病毒基因的序列一致性在98.2%~99.7%,而同為陜北地區(qū)的榆林10縣區(qū)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的PSTVd的序列一致性均在99.7%以上,病毒變異率高低以及不同地區(qū)病毒變異率差異大小是否會對馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生影響,單一病毒或類病毒及復合病毒感染對產(chǎn)量和品質(zhì)的影響關系都有待進一步研究。

    [1]Navarro B,Silletti MR,Serio FD.Identification and characterization of potato spindle tuber viroid infecting tomato in Italy[J].Journal of Plant Pathology,2009,91(3):723-726.

    [2]董代幸,羅 明,王麗麗,等.烏魯木齊地區(qū)馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的檢測與序列分析[J].西北農(nóng)業(yè)學報,2010,19(9):38 -42.

    [3]吳志明,賈曉梅,謝曉亮,等.馬鈴薯紡錘塊莖類病毒RT-PCR檢測及全序列分析[J].華北農(nóng)學報,2003,18(S1):63-65.

    [4]呂典秋,李學湛,楊希才,等.馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd)東北分離物的核苷酸序列分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術學報,2005,13(1):131 -132.

    [5]王中康,夏玉先,袁 青,等.馬鈴薯種苗復合感染病毒多重RT-PCR同步快速檢測[J].植物病理學報,2005,35(2):109 -115.

    [6]Nie X,Singh RP.A novel usage of random primers for multiplex RT-PCR detection of virus and viroid in aphids,leaves,and tubers[J].Journal of Virological Methods,2001,91(1):37 -49.

    [7]Courtney EJ,Amy OC,David KW.Evaluation of isolation methods and RNA integrity for bacterial RNA quantitation[J].Journal of Microbiological Methods,2008,75(2):318-324.

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