國(guó)內(nèi)外不同廠家馬來(lái)酸依那普利片在4種溶出介質(zhì)中溶出曲線的比較

孫 婷，姜建國(guó)，宋更申，張西如（河北省藥品檢驗(yàn)研究院，石家莊 050011）

考察在多種pH溶出介質(zhì)中的溶出曲線是評(píng)價(jià)口服固體制劑內(nèi)在質(zhì)量的一種重要手段。該試驗(yàn)可用于評(píng)估不同來(lái)源的同一品種制劑內(nèi)在質(zhì)量的差異[1]。馬來(lái)酸依那普利片系血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，是一種非處方藥，臨床上主要用于各期原發(fā)性高血壓、腎性高血壓、充血性心力衰竭等的治療。大量的臨床研究證明，馬來(lái)酸依那普利片在減輕左心室肥厚及胰島素抵抗方面優(yōu)于其他部分降壓藥物，其已被公認(rèn)為對(duì)靶器官有保護(hù)作用[2]?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上生產(chǎn)馬來(lái)酸依那普利片仿制藥的企業(yè)較多，而不同企業(yè)生產(chǎn)的仿制藥產(chǎn)品質(zhì)量可能存在一定的差異，導(dǎo)致臨床療效反應(yīng)不一。這種療效的差異與藥物生物利用度緊密相關(guān)[3]，而溶出度是反映藥物生物利用度最直接的方式。

本試驗(yàn)參考有關(guān)文獻(xiàn)[4-6]，采用高效液相色譜（HPLC）法，按照《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄ⅩC第二法（槳法）進(jìn)行操作[7]，比較了市售3個(gè)國(guó)內(nèi)企業(yè)生產(chǎn)的馬來(lái)酸依那普利片與國(guó)外原研藥在4種不同pH溶出介質(zhì)中的溶出曲線，以期為仿制藥質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)工作開展以及該制劑生產(chǎn)工藝提高提供參考。

1 材料

RC12A型溶出儀（天津天大天發(fā)科技有限公司）；Agilent 1260型HPLC儀，包括G1311C四元泵、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1314紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器等（美國(guó)Agilent公司）；XS105型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

馬來(lái)酸依那普利對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100705-200902，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99.8%）；馬來(lái)酸依那普利片（國(guó)內(nèi)A企業(yè)，批號(hào)：11081511，規(guī)格：每片5mg；國(guó)內(nèi)B企業(yè)，批號(hào)：120401，規(guī)格：每片5mg；國(guó)內(nèi)C企業(yè)，批號(hào)：12060802，規(guī)格：每片5mg；國(guó)外D企業(yè)——美國(guó)默沙東公司，批號(hào)：120849，規(guī)格：每片5mg）；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、馬來(lái)酸和鹽酸均為分析純，試驗(yàn)用水為去離子純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C8（150m×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)pH至2.2）-乙腈（75∶25，V/V）；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm；進(jìn)樣量：50μl，柱溫：50℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 4種溶出介質(zhì)的制備 pH 1.0鹽酸溶液：取鹽酸9.0ml，加水稀釋至1000ml，搖勻，即得。pH 4.5磷酸鹽緩沖液：取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液250ml，加水稀釋至1000ml，搖勻，即得。pH 6.8磷酸鹽緩沖液：取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液250ml，與0.2mol/L氫氧化鈉溶液112ml混合后，加水稀釋至 1000ml，搖勻，即得。水：為去離子純凈水（經(jīng)測(cè)定pH為6.5）。上述4種溶出介質(zhì)用水均采用脫氣裝置經(jīng)40℃脫氣40 min后立即使用。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取馬來(lái)酸依那普利對(duì)照品約10mg，以甲醇溶解于100ml量瓶中，并稀釋至刻度。精密量取上述溶液適量，分別加相應(yīng)的“2.2.1”項(xiàng)下4種不同pH溶出介質(zhì)定量稀釋制成每1ml中約含5μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣品適量，按照《中國(guó)藥典》2010年版（二部）附錄ⅩC第二法（槳法），分別采用“2.2.1”項(xiàng)下4種不同pH溶出介質(zhì)，溶出介質(zhì)體積900ml，溶出溫度（37.0±0.5）℃，轉(zhuǎn)速50r/min，依法操作，經(jīng)時(shí)30min，取溶出液適量，濾過(guò)，作為供試品溶液。

2.2.4 空白對(duì)照溶液的制備 精密稱取馬來(lái)酸約10mg，以甲醇溶解于100ml量瓶中，稀釋至刻度。精密量取上述溶液適量，分別加相應(yīng)的“2.2.1”項(xiàng)下4種不同pH溶出介質(zhì)定量稀釋制成每1ml中約含5μg的溶液，作為空白對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性考察

取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白對(duì)照溶液各適量（溶出介質(zhì)為水），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，馬來(lái)酸依那普利峰保留時(shí)間約為6.0min，理論板數(shù)按馬來(lái)酸依那普利峰計(jì)算不低于900，拖尾因子應(yīng)不大于2.0；在該色譜條件下，待測(cè)成分峰與溶劑及其他雜質(zhì)峰分離良好。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取馬來(lái)酸依那普利對(duì)照品約10mg，置于100ml量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取1、2、5、10、15、20ml，置于100ml量瓶中，分別加“2.2.1”項(xiàng)下4種不同pH溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，分別量取50μl注入HPLC儀，記錄色譜。以馬來(lái)酸依那普利的質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程分別為 y＝99.27×105x+23.24×105（r＝0.9999）、y＝99.22×105x－10.34×105（r＝0.9999）、y＝99.23×105x－10.36×105（r＝0.9999）、y＝99.22×105x－10.35×105（r＝0.9999）。結(jié)果表明，馬來(lái)酸依那普利檢測(cè)質(zhì)量濃度在1.0～20μg/ml范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下4種對(duì)照品溶液各適量，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果，馬來(lái)酸依那普利峰面積的RSD分別為0.04%（pH 1.0鹽酸溶液）、0.02%（pH 4.5磷酸鹽緩沖液）、0.02%（pH 6.8磷酸鹽緩沖液）、0.03%（水），表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備的供試品溶液（D企業(yè)樣品，批號(hào)：120849）適量，于室溫下放置，在12h內(nèi)每隔2h進(jìn)樣1次，測(cè)定峰面積。結(jié)果，馬來(lái)酸依那普利峰面積的RSD分別為0.66%（pH 1.0鹽酸溶液）、0.04%（pH 4.5磷酸鹽緩沖液）、0.23%（pH 6.8磷酸鹽緩沖液）、0.14%（水），表明供試品溶液在室溫放置12h穩(wěn)定性良好。

2.7 回收率試驗(yàn)

根據(jù)D企業(yè)樣品（批號(hào)：120849）處方，按處方量50%、80%、100%精密稱取馬來(lái)酸依那普利對(duì)照品，輔料按處方量100%稱取，每個(gè)水平各3份，置于不同的900ml量瓶中，分別用“2.2.1”項(xiàng)下4種不同pH溶出介質(zhì)稀釋制成4種待測(cè)溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

2.8 溶出曲線的繪制

取樣品12片，按《中國(guó)藥典》2010年版（二部）附錄ⅩC第二法（槳法），分別采用“2.2.1”項(xiàng)下4種不同pH溶出介質(zhì)，溶出介質(zhì)體積900ml，溶出溫度（37.0±0.5）℃，轉(zhuǎn)速50r/min，依法操作，分別于5、10、15、20、30、45、60、90、120min時(shí)取溶出液適量（3～5ml），濾過(guò)（具備在線過(guò)濾功能的溶出儀無(wú)需重復(fù)濾過(guò)），取續(xù)濾液作為供試品溶液，并即時(shí)補(bǔ)充相同溫度相同體積的溶出介質(zhì)，繼續(xù)試驗(yàn)（當(dāng)連續(xù)兩點(diǎn)的累積溶出率達(dá)85%以上，且差值在5%以內(nèi)時(shí)，試驗(yàn)可以提前結(jié)束）。另取馬來(lái)酸依那普利對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋制成每1ml中約含100μg的溶液。精密量取上述溶液適量，分別加相應(yīng)的“2.2.1”項(xiàng)下4種不同pH溶出介質(zhì)定量稀釋制成每1ml中約含5μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密量取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液各50μl，分別注入HPLC儀，記錄色譜，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算每片在不同時(shí)間點(diǎn)的累積溶出率。以12片的平均累積溶出率（%）為縱坐標(biāo)，時(shí)間（min）為橫坐標(biāo)，繪制溶出曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 4種馬來(lái)酸依那普利片在不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線Fig 2 Dissolution curves of 4 kinds of enalaprilmaleate tab?lets in different mediums

2.9 溶出曲線的評(píng)價(jià)

采用美國(guó)食品與藥品管理局（FDA）推薦使用的f2相似因子法來(lái)評(píng)價(jià)國(guó)內(nèi)企業(yè)仿制藥（試驗(yàn)藥品）與國(guó)外原研藥（對(duì)照藥品）體外溶出曲線的相似性，以考察其內(nèi)在質(zhì)量的差異。f2計(jì)算公式如下：

式中，Rt為t時(shí)點(diǎn)對(duì)照藥品的溶出度；Tt為t時(shí)點(diǎn)試驗(yàn)藥品的溶出度；n為取樣點(diǎn)的個(gè)數(shù)。f2從統(tǒng)計(jì)學(xué)上度量了兩條溶出曲線之間的相似性，f2值越大，說(shuō)明兩條溶出曲線差異越小，若50≤f2≤100，可以推斷兩條溶出曲線相似；完全相同的兩條溶出曲線，其f2＝100。選擇合適的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行國(guó)產(chǎn)馬來(lái)酸依那普利片在4種溶出介質(zhì)中的溶出曲線的f2值計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)速的選擇

對(duì)國(guó)內(nèi)A、B、C企業(yè)以及國(guó)外D企業(yè)樣品分別在“2.2.1”項(xiàng)下4種不同pH溶出介質(zhì)中進(jìn)行50r/min和75r/min轉(zhuǎn)速對(duì)比。結(jié)果，50r/min和75r/min轉(zhuǎn)速下，樣品溶出曲線無(wú)顯著差異，參考USP35、《日本藥局方》16版馬來(lái)酸依那普利片溶出度測(cè)定的方法和轉(zhuǎn)速，同時(shí)考慮本品多數(shù)為中老年患者使用，而中老年患者通常胃蠕動(dòng)較為緩慢，因此將轉(zhuǎn)速選定為50r/min。

表2 4種溶出介質(zhì)中國(guó)產(chǎn)馬來(lái)酸依那普利片的溶出曲線的f2值Tab 2 The f2 factors of the dissolution curves of domestic Enalaprilmaleate tablets in 4 kinds of dissolution medium

3.2 方法的耐用性

對(duì)國(guó)內(nèi)A、B、C企業(yè)和國(guó)外D企業(yè)樣品，分別采用Agilent ZORBAX XDB-C8（150mm×4.6mm，5μm）和Waters Sym?metry Shield RP C18（150mm×4.6mm，5μm）進(jìn)行測(cè)定并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，采用不同色譜柱所達(dá)到的理論板數(shù)基本一致，說(shuō)明“2.1”項(xiàng)下色譜條件具有良好的耐用性。

3.3 溶解度的考察

精密稱取國(guó)外D企業(yè)樣品（批號(hào)：120849）共4份，每份約0.1g，分別加入到“2.2.1”項(xiàng)下不同pH溶出介質(zhì)（3ml）中，置于（37.0±0.5）℃水浴中加熱24h（前2h，每30min振搖一次，每次約1min），24h后分別取上清液；同時(shí)取馬來(lái)酸依那普利對(duì)照品配制成15μg/ml的對(duì)照品溶液，同法操作。取上述兩種溶液分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，馬來(lái)酸依那普利在4種pH溶出介質(zhì)中的溶解度分別為29、36、35、36mg/ml，說(shuō)明選擇上述不同pH溶出介質(zhì)進(jìn)行溶出試驗(yàn)具有可行性。

3.4 色譜條件的選擇

3.4.1 色譜柱的選擇 USP35、《日本藥局方》16版、《中國(guó)藥典》2010年版均選用C8柱測(cè)定馬來(lái)酸依那普利片的溶出度。通過(guò)以上耐用性試驗(yàn)考察可知，采用C18柱與C8柱測(cè)定其溶出度，無(wú)明顯區(qū)別。因各國(guó)藥典均采用C8柱，具有一定的普遍性，因此本次試驗(yàn)仍選用C8柱測(cè)定。

3.4.2 流動(dòng)相的選擇 USP35、《日本藥局方》16版、《中國(guó)藥典》2010年版均采用了磷酸鹽溶液（用磷酸調(diào)pH至2.2）-乙腈作為流動(dòng)相，不同之處是，USP35、《日本藥局方》16版采用磷酸二氫鈉，而《中國(guó)藥典》2010年版采用磷酸二氫鉀。鉀的離子強(qiáng)度大于鈉，離子強(qiáng)度增加將使得色譜柱理論板數(shù)增加，同時(shí)還會(huì)縮短馬來(lái)酸依那普利的保留時(shí)間，因此本試驗(yàn)選擇采用磷酸二氫鉀。

3.5 試驗(yàn)結(jié)果探討

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定的溶出介質(zhì)水中，3家國(guó)內(nèi)企業(yè)生產(chǎn)的馬來(lái)酸依那普利片與國(guó)外企業(yè)生產(chǎn)的原研藥均可在30min時(shí)達(dá)到溶出標(biāo)示量75%以上。然而，就“2.2.1”項(xiàng)下4種不同pH溶出介質(zhì)中總體的溶出曲線而言，3家國(guó)內(nèi)企業(yè)仿制藥樣品與國(guó)外原研藥樣品比較，僅有1家具有相似性。A企業(yè)樣品在4種溶出介質(zhì)中均比原研藥樣品釋放速率慢，到達(dá)平臺(tái)期時(shí)間較長(zhǎng)，且其自身在4種溶出介質(zhì)中的溶出曲線亦存在差異；B企業(yè)樣品雖然到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間有所提前，但卻在上升期出現(xiàn)拐點(diǎn)，仍與原研藥樣品存在差異；C企業(yè)樣品與原研藥樣品的溶出曲線基本相似，但其自身在4種溶出介質(zhì)中的溶出曲線仍存在一定差異。

3.6 思考與建議

溶出度試驗(yàn)技術(shù)是評(píng)價(jià)口服固體制劑內(nèi)在質(zhì)量的一種重要手段，該試驗(yàn)不僅可為建立其體內(nèi)外相關(guān)性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，而且有望成為通過(guò)體外試驗(yàn)評(píng)價(jià)其質(zhì)量的簡(jiǎn)易、有效、可行的方法。日本自1998年開始實(shí)施“藥品品質(zhì)再評(píng)價(jià)工程”[8]，陸續(xù)出版了《醫(yī)部用醫(yī)藥品品質(zhì)情報(bào)集》[即日本參比制劑目錄（橙皮書）]，其中詳細(xì)羅列了所收載制劑的4條標(biāo)準(zhǔn)溶出曲線。美國(guó)FDA藥品審評(píng)中心的仿制藥辦公室屬下的生物等效部也于2004年1月起，在其官方網(wǎng)站上推出了“固體制劑溶出曲線數(shù)據(jù)庫(kù)”[9]。目前我國(guó)雖未推出“溶出曲線數(shù)據(jù)庫(kù)”，但對(duì)口服固體制劑多條溶出曲線的測(cè)定已愈發(fā)受到關(guān)注與重視。我國(guó)于2012年開始實(shí)施“仿制藥質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)”工程。馬來(lái)酸依那普利片屬于非處方藥，即患者自主用藥。若各個(gè)廠家生產(chǎn)的制劑與療效較好的原研制劑存在較大差異，則患者容易在不知情的情況下遭受血壓的過(guò)度波動(dòng)及過(guò)度變異，從而可能使重要器官受到損害。

由本試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，用單點(diǎn)單一溶出介質(zhì)檢測(cè)藥物體外溶出度，各樣品的最終溶出度結(jié)果都符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求，而采用多種pH溶出介質(zhì)時(shí)部分國(guó)內(nèi)仿制藥樣品溶出曲線與原研藥樣品相比卻存在較大差異。因此，通過(guò)多pH溶出介質(zhì)進(jìn)行溶出試驗(yàn)更能全面、準(zhǔn)確地反映藥品的體外釋藥情況和內(nèi)在質(zhì)量，特別是反映了同一廠家不同批次同一樣品、不同廠家同一樣品間的質(zhì)量差異，可為仿制藥質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)工作開展提供參考。因此，臨床應(yīng)用時(shí)應(yīng)多加注意，有必要加強(qiáng)對(duì)其多pH溶出曲線的實(shí)時(shí)監(jiān)控，確保藥品質(zhì)量的有效性、均一性和穩(wěn)定性，以保障人民群眾用藥的安全性和有效性。

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