醛糖還原酶基因多態(tài)性與2型糖尿病視網(wǎng)膜病變的關(guān)系

任 珉，趙莉莉，張 瑩，師 瑩，毛用敏，齊秀英

(1天津市心血管病研究所，天津300222;2天津市胸科醫(yī)院;3天津醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，是糖尿病患者視力受損和致盲的重要原因［1～4］。除高血糖和環(huán)境因素影響之外，遺傳因素在視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展中也起重要作用。醛糖還原酶(AR)是葡萄糖代謝多元醇通路上的限速酶，該酶基因表達(dá)異常與DR的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5］。既往對(duì)AR的研究多集中于其5'端的(AC)n核苷酸重復(fù)序列的多態(tài)性，近年來(lái)AR基因上游啟動(dòng)區(qū)-106 C/T單核苷酸多態(tài)性開(kāi)始受到關(guān)注。為探討AR基因上游啟動(dòng)區(qū)-106 C/T單核苷酸多態(tài)性與DR發(fā)病的關(guān)系，我們于2009年6月～2011年3月進(jìn)行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年6月～2010年10月收治的2型糖尿病患者374例，均經(jīng)1997年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］確診。其中病例組 161例，男 84例，女 77例，年齡(59.93±10.68)歲，病程7～16年，有DR病史或住院期間眼底鏡檢查有視網(wǎng)膜病變，排除其他原因引起的視覺(jué)損害、視力下降;對(duì)照組213例，男114例，女99例，年齡(58.40±12.96)歲，病程2～12年，無(wú) DR 病史且住院期間眼底鏡檢查未發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜病變，排除其他原因引起的視覺(jué)損害、視力下降者。病例組與對(duì)照組年齡和性別分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)。

1.2 DNA的提取與擴(kuò)增 兩組均于入院次日清晨采集空腹靜脈血5 mL，加EDTA抗凝，-80℃保存。采用血液DNA快速提取法(TKM法，TaKaRa公司)提取全血DNA，紫外分光光度計(jì)下測(cè)定OD260/OD280大于1.7，且瓊脂糖凝膠電泳顯示DNA完整性良好。采用PCR法行DNA擴(kuò)增。AR基因上游引物序列為5'-CCT TTC TGC CAC GCG GGG CGC GGG-3'，下游引物序列為 5'-CAT GGC TGC TGC GCT CCC AG-3'(由TaKaRa公司合成)。PCR反應(yīng)體系中各組分的終濃度為 DNA樣本0.5 μg，10×PCR Buffer 2.5 μL，Taq DNA 聚合酶 2.5 U，dNTPs 0.25 μmol/L，上下游引物各 0.4 μmol/L，滅菌純凈水補(bǔ)足體積至25 μL。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變5 min，95℃1 min，66 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次，72 ℃延伸7 min。于2%瓊脂糖凝膠電泳，恒定電壓90 V，紫外透射反射儀下觀察結(jié)果。

1.3 AR基因-106CT多態(tài)性檢測(cè) 取10 μL PCR產(chǎn)物，加限制性內(nèi)切酶 BfaⅠ(10 U)1.0 μL，10 ×Buffer K 2.0 μL，雙蒸水(ddH2O)7.0 μL，組成 20 μL的反應(yīng)體系。置于37℃恒溫水浴箱中反應(yīng)6 h。酶切反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL酶切產(chǎn)物與2 μL上樣緩沖液混合均勻，置于3.5%瓊脂糖凝膠，在恒定電壓90 V、紫外透射反射儀下觀察結(jié)果。計(jì)算AR基因-106 bp C/T等位基因頻率，等位基因頻率=(2×純合子數(shù)+雜合子數(shù))/(2×受檢者例數(shù))。分析AR基因-106 C/T多態(tài)性與DR的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用單因素Logistic回歸分析對(duì)DR發(fā)病的危險(xiǎn)因素進(jìn)行分析，計(jì)算OR及其95%CI，并對(duì)可能的混雜因素進(jìn)行調(diào)整。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AR基因-106 C/T多態(tài)性 AR基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為263 bp，其中含有一個(gè)非特異性BfaⅠ酶切位點(diǎn)，經(jīng)酶切后產(chǎn)生206、57 bp的兩個(gè)片段。AR基因啟動(dòng)子區(qū)域-106 bp C/T為SNP基因多態(tài)位點(diǎn)(在206 bp片段中)。當(dāng)此位點(diǎn)為C時(shí)PCR產(chǎn)物不存在BfaⅠ酶切位點(diǎn)，電泳顯示為206 bp的條帶，此為CC型(野生型);為T時(shí)產(chǎn)生BfaⅠ酶切位點(diǎn)，206 bp DNA片段被切成147、59 bp的兩條片段，此為TT型(變異型);出現(xiàn)206、147、59 bp三個(gè)片段，此為雜合子。見(jiàn)圖1。病例組中，AR基因型頻率CC型為53.42%，CT 型為35.40%，TT 型為11.18%;對(duì)照組分別為 39.91%、47.88%、12.21%。病例組 CT/TT基因型頻率低于對(duì)照組(χ2=7.104，P=0.029)。病例組等位基因C頻率為71.12%，T為 28.88%;對(duì)照組分別為63.85%、36.15%。病例組T等位基因頻率低于對(duì)照組 (χ2=4.380，P=0.036)，見(jiàn)表1。

圖1 AR基因PCR限制性酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 AR基因Hardy-Weinberg遺傳平衡性檢驗(yàn)對(duì)照組中CC、CT、TT基因型分布頻率與期望頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05)，符合Hardy-Weinberg定律，說(shuō)明達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。詳見(jiàn)表2。

表1 病例組與對(duì)照組AR基因型和等位基因分布［例(%)］

表2 AR基因型頻率的Hardy-Weinberg遺傳平衡性檢驗(yàn)

2.3 AR基因-106 C/T多態(tài)性與DR的關(guān)系 單因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，-106C/T的CT/TT基因型與 DR 發(fā)病有關(guān)(OR=0.579，95%CI:0.383～0.876)，且經(jīng)糖尿病家族史調(diào)整后二者間的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)仍然存在。攜帶T等位基因的2型糖尿病患者發(fā)生 DR 的危險(xiǎn)性降低(OR=0.717，95%CI:0.525～0.980)。見(jiàn)表3。

表3 AR基因-106C/T多態(tài)性與AR的關(guān)系

3 討論

AR基因位于人類染色體7q35，全長(zhǎng)約18 kb，含有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子，存在多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。已有研究證明，葡萄糖代謝多元醇通路與糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［7］。AR作為還原型輔酶Ⅱ依賴型醛酮還原酶家族的單體酶，是多元醇通路中的限速酶，對(duì)葡萄糖的親和力較低。在正常血糖濃度下，該酶活性不高，葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞后很快被分解，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，氧化供能。在高血糖狀態(tài)下，AR活性增高將導(dǎo)致大量葡萄糖轉(zhuǎn)化為山梨醇，由于山梨醇極性很強(qiáng)，難以透過(guò)細(xì)胞膜，而在細(xì)胞內(nèi)堆積，并引起還原型輔酶Ⅱ、肌醇和Na+-K+-ATP酶活性降低，干擾細(xì)胞代謝，破壞組織結(jié)構(gòu)，影響血管通透性，使毛細(xì)血管基底膜增厚，導(dǎo)致視網(wǎng)膜微動(dòng)脈和毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)改變(如周細(xì)胞變性、基底膜增厚和內(nèi)皮細(xì)胞增生等)，最終導(dǎo)致 DR 的發(fā)生［8，9］。

近年來(lái)，AR基因啟動(dòng)子-106 C/T多態(tài)性與DR的關(guān)系逐漸受到學(xué)者們的關(guān)注。澳大利亞學(xué)者［10］率先發(fā)現(xiàn)AR基因上游啟動(dòng)區(qū)-106 C/T堿基突變，攜帶C等位基因的糖尿病患者發(fā)生DR的危險(xiǎn)性增加。有學(xué)者［11～15］分別對(duì)中國(guó)北方漢族、美國(guó)、巴西及日本的2型糖尿病患者進(jìn)行研究，均發(fā)現(xiàn)-106C/T的CC基因型與DR的易感性有關(guān)。但也有研究［6，16］報(bào)道未發(fā)現(xiàn)AR基因-106 C/T的多態(tài)性與DR的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，攜帶CC基因型和C等位基因的糖尿病患者發(fā)生DR的危險(xiǎn)性高于CT/TT基因型和T等位基因攜帶者，經(jīng)DM家族史調(diào)整后這種關(guān)聯(lián)仍然存在，提示AR基因-106C/T的這兩種基因型與DR發(fā)病有關(guān)。AR基因-106C/T的多態(tài)性可能會(huì)引起AR表達(dá)增加，導(dǎo)致多元醇代謝通路激活，使大量山梨醇在細(xì)胞內(nèi)蓄積，形成細(xì)胞內(nèi)高滲狀態(tài)，大量細(xì)胞外液滲入，導(dǎo)致細(xì)胞水腫。同時(shí)，山梨醇改變了細(xì)胞膜的通透性，使K+、肌醇等大量丟失，引起組織結(jié)構(gòu)和功能異常，最終導(dǎo)致DR的發(fā)生。由于不同研究人群、樣本量不同等原因的影響，本研究結(jié)論與相關(guān)研究尚存在一定差異，關(guān)于AR基因-106 C/T多態(tài)性與DR的關(guān)聯(lián)性，還有待進(jìn)一步深入研究。

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