當(dāng)歸補血湯對膿毒癥小鼠脾臟Treg細(xì)胞比例、Foxp3 mRNA表達(dá)的影響

劉 濤，黃瑞峰，王 毅

(貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴陽550002)

膿毒癥病死率較高，目前研究認(rèn)為細(xì)胞免疫功能紊亂在其發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)作為CD+4T細(xì)胞亞群之一，不僅能控制自身免疫反應(yīng)，也是調(diào)節(jié)炎癥、感染、移植排斥和腫瘤免疫的重要細(xì)胞群［1，2］。Foxp3是 Treg的特異性轉(zhuǎn)錄因子，也是調(diào)節(jié)Treg發(fā)育和功能的關(guān)鍵因子。IL-2、TGF-β 可影響 Foxp3 基因轉(zhuǎn)錄［3，4］，調(diào)控機體免疫功能。諸多研究已表明，當(dāng)歸補血湯具有免疫調(diào)節(jié)功能，本研究旨在觀察當(dāng)歸補血湯水煎劑及當(dāng)歸補血湯多糖能否通過調(diào)節(jié)膿毒癥小鼠脾Treg細(xì)胞的發(fā)育，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 當(dāng)歸補血湯水煎劑和當(dāng)歸補血湯多糖的制備 當(dāng)歸和黃芪產(chǎn)地為內(nèi)蒙古，購自貴州省中醫(yī)院藥房。將黃芪和當(dāng)歸按5∶1比例混合，依照傳統(tǒng)方法分別水煎煮3次混合加熱濃縮成1 g/mL的當(dāng)歸補血湯水煎劑，冷卻后裝瓶置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩．?dāng)歸補血湯多糖用Sevag法［5］提取，當(dāng)歸補血湯多糖含量為31.5 mg/g。

1.1.2 實驗動物 清潔級C57BL/6小鼠(野生型)80只，20 d齡，雌雄各半，體質(zhì)量9～12 g，常規(guī)動物飼料喂食(均由貴陽醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，飼料執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14924.9-2001)。

1.1.3 主要試劑和儀器 小鼠IL-2 ELISA試劑盒購自四川阿比丁生物工程有限公司;CD4-PE、CD8-PE單克隆抗體為美國BD公司產(chǎn)品。熒光標(biāo)記抗體(PF-anti-CD25/FITC-anti-CD4)購自美國 Serotec公司。流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。PCR引物由四川阿比丁生物工程有限公司合成:β-actin上游引物為5'-CCTC TATG CCAA CACA GTGC-3'，下游引物為5'-GTAC TCCT GCTT GCTG ATCC-3';Foxp3上游引物為5'-GTGG CCTC AGTG GACA AGAGC-3'，下游引物為5'-TGTC TCCG CACA GCAA ACAA G-3'。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理 80只小鼠隨機分成正常對照組、模型對照組、當(dāng)歸補血湯組、當(dāng)歸補血湯多糖組，各20只。正常對照組、模型對照組灌服0.2 mL無菌生理鹽水，1次/d，連續(xù)15 d;當(dāng)歸補血湯組灌服當(dāng)歸補血湯水煎劑0.35 g/kg，當(dāng)歸補血湯多糖組灌服當(dāng)歸補血湯多糖15 mg/kg，1次/d，連續(xù)15 d。第15天時，除正常對照組外，其余各組均注射內(nèi)毒素(10 mg/kg)，正常對照組注射相同體積生理鹽水。各組隨機抽取10只小鼠，觀察各組96 h死亡情況;每組其余10只小鼠于注射生理鹽水或內(nèi)毒素后8 h處死，于酒精中浸泡1 min后無菌切取小鼠脾臟，留取300 mg及100 mg各1塊脾組織備用。經(jīng)心臟采集各組小鼠血液5 mL，高速低溫離心后取血清于-80℃冷凍保存。

1.2.2 血清IL-2、TGF-β 檢測 采用ELISA法。操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 脾臟Treg細(xì)胞比例檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。取脾組織約300 mg，常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液。取脾細(xì)胞懸液，分別加入細(xì)胞標(biāo)記抗體 CD4-ECD、CD25、PC5-CD127-PE及相應(yīng)的同型對照單抗各10 μL，混勻，溫室避光孵育15 min，加入 1.5 mL 紅細(xì)胞裂解液?；靹蚝笫覝乇芄夥胖?0 min，破壞紅細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清，每管加入1.5 mL PBS混勻，1 500 r/min離心5 min。棄上清，重復(fù)1次，0.5 mL PBS重懸細(xì)胞。2 h內(nèi)用三色流式細(xì)胞儀術(shù)檢測。CD+4CD25+CD-127細(xì)胞即為Treg細(xì)胞。計算Treg細(xì)胞占脾細(xì)胞比例及占脾單核細(xì)胞比例。

1.2.4 脾臟Foxp3 mRNA表達(dá)檢測 采用RT-PCR法。取約100 mg脾組織，加入1 mL Trizol試劑，勻漿后用氯仿進(jìn)行二相分離，溶解至水相的RNA用異丙醇沉淀，離心后清洗RNA沉淀。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。對目的基因和管家基因分別進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，F(xiàn)oxp3為35個PCR 循環(huán)(94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，87 ℃10 s)，β-actin為35個PCR循環(huán)(94℃ 20 s，60℃20 s，72℃ 20 s，86℃ 10 s)。以標(biāo)準(zhǔn)品梯度的測量結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各標(biāo)本所測基因的表達(dá)量，各標(biāo)本目的基因的表達(dá)量除以管家基因的表達(dá)量，即得到樣品校正后的基因相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。病死率比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 死亡率 正常對照組無小鼠死亡。腹腔注射內(nèi)毒素9 h后模型對照組小鼠開始出現(xiàn)死亡，觀察至96 h共死亡6只(30%);當(dāng)歸補血湯組小鼠注射內(nèi)毒素后16 h出現(xiàn)首例死亡，至96 h死亡4只(20%);當(dāng)歸補血湯多糖組小鼠注射內(nèi)毒素后96 h內(nèi)死亡3只(15%)。模型對照組小鼠死亡率高于其余3組(P均＜0.05)。

2.2 血清IL-2、TGF-β 各組小鼠血清 IL-2、TGF-β水平見表1。由表1可見，模型對照組血清 IL-2、TGF-β水平高于正常對照組(P均＜0.05)，當(dāng)歸補血湯組、當(dāng)歸補血湯多糖組與模型對照組相比，P均＞0.05。

2.3 脾臟中Treg細(xì)胞比例 各組小鼠Treg細(xì)胞占脾細(xì)胞和脾單核細(xì)胞比例見表1。由表1可見，當(dāng)歸補血湯組、當(dāng)歸補血湯多糖組Treg細(xì)胞占脾細(xì)胞及脾單核細(xì)胞比例高于模型對照組(P均＜0.05)，上述三組均低于正常對照組(P均＜0.05)，當(dāng)歸補血湯組和當(dāng)歸補血湯多糖組相比，P 均 ＞0.05。

2.4 脾臟Foxp3 mRNA 各組小鼠脾臟Foxp3 mRNA相對表達(dá)量見表1。由表1可見，當(dāng)歸補血湯組、當(dāng)歸補血湯多糖組脾臟Foxp3 mRNA相對表達(dá)量高于模型對照組(P均＜0.05)，上述三組均低于正常對照組(P均＜0.05)，當(dāng)歸補血湯組與當(dāng)歸補血湯多糖組相比，P均＞0.05。

表1 各組小鼠血清IL-2、TGF-β水平、脾臟Treg細(xì)胞比例、Foxp3 mRNA表達(dá)水平比較(±s)

表1 各組小鼠血清IL-2、TGF-β水平、脾臟Treg細(xì)胞比例、Foxp3 mRNA表達(dá)水平比較(±s)

注:與正常對照組相比，*P＜0.05;與模型對照組相比，#P＜0.05

組別 n IL-2(pg/mL) TGF-β(pg/mL) Treg細(xì)胞占脾細(xì)胞比例(%)Foxp3 mRNA相對表達(dá)量正常對照組 20 23.78 ± 7.46 14.72 ± 5.97 4.05 ±1.92 4.28 ±1.42 Treg細(xì)胞占脾單核細(xì)胞比例(%)5.99 ±1.47模型對照組 20 47.49 ±17.37*30.71 ±13.79* 1.83 ±0.79* 1.25 ±0.42* 0.65 ±0.18*當(dāng)歸補血湯組 20 35.52 ±13.02*37.54 ±12.75* 2.68 ±1.47* 2.52 ±0.35*# 2.83 ±0.31*#當(dāng)歸補血湯多糖組 20 34.18 ±12.13*35.32 ±17.67* 2.61 ±1.32*# 2.62 ±1.26*# 3.36 ±0.36*#

3 討論

膿毒癥常伴免疫調(diào)節(jié)紊亂，最終引起內(nèi)環(huán)境紊亂，導(dǎo)致組織器官損傷，發(fā)生MODS，其發(fā)病率持續(xù)升高［6，7］。近期流行病學(xué)研究證實自1997年后膿毒癥休克的發(fā)生率呈增加趨勢，病死率可達(dá)30%［8，9］。一項對三級甲等教學(xué)醫(yī)院ICU患者的調(diào)查結(jié)果顯示，嚴(yán)重膿毒癥的發(fā)病率和病死率分別為8.68%和 48.70%［10］。因此，膿毒癥仍是目前 ICU臨床及科研亟需解決的難題。

Treg存在于胸腺和外周淋巴組織中，占外周血CD4+T細(xì)胞的1%～2%。天然產(chǎn)生的Treg不同于Th1和Th2細(xì)胞，是具有調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞群體，對維持機體免疫耐受和免疫應(yīng)答穩(wěn)態(tài)具有非常重要的作用，IL-2、TGF-β 為其重要的調(diào)節(jié)因子［11，12］。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對膿毒癥發(fā)病機制的認(rèn)識與中醫(yī)學(xué)有相似之處。中醫(yī)認(rèn)為各種嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、大手術(shù)等均耗傷人之氣血，導(dǎo)致氣損血衰。感染屬熱毒之邪，即《內(nèi)經(jīng)》所說的“壯火”，“壯火”耗氣又耗血傷陰;而創(chuàng)傷、大手術(shù)、病理產(chǎn)科均可出現(xiàn)大出血或合并感染，出血者氣隨血脫，感染者熱毒耗傷氣陰，使氣血更虛［13］。當(dāng)歸補血湯是經(jīng)典的益氣補血復(fù)方［14］。近代研究表明，當(dāng)歸補血湯具有補血、調(diào)節(jié)免疫功能等藥理作用，其臨床應(yīng)用十分廣泛。當(dāng)歸補血湯水煎劑主要的有效成分為皂甙類、多糖類、氨基酸類及酮類［15，16］。本研究結(jié)果顯示，模型對照組小鼠病死率高于當(dāng)歸補血湯組及當(dāng)歸補血湯多糖組。模型對照組小鼠脾臟Treg細(xì)胞比例和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA表達(dá)量低于正常對照組，給予當(dāng)歸補血湯水煎劑或當(dāng)歸補血湯多糖干預(yù)的小鼠脾臟中Treg細(xì)胞比例及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA表達(dá)量較模型對照組有所提高，但當(dāng)歸補血湯組與當(dāng)歸補血湯多糖組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。我們還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補血湯組、當(dāng)歸補血湯多糖組小鼠血清IL-2、TGF-β水平低于模型對照組。上述結(jié)果表明當(dāng)歸補血湯水煎劑或多糖上調(diào)脾臟Treg細(xì)胞比例和Foxp3基因表達(dá)不需要小鼠處于免疫被激活狀態(tài);Foxp3基因表達(dá)的增強反映Treg細(xì)胞的功能活性增強，當(dāng)歸補血湯對Treg比例的調(diào)節(jié)可能是通過直接或間接促進(jìn)Treg的特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3基因表達(dá)來實現(xiàn)的。當(dāng)歸補血湯水煎劑與當(dāng)歸補血湯多糖效果相當(dāng)，推測當(dāng)歸補血湯多糖可能是當(dāng)歸補血湯發(fā)揮作用的有效成分。

［1］Jason DF，Alexander YR.A well adapted regulatory contrivance:regulatory T cell development and the forehead family transcription factor Fox03［J］.Nat Immunol，2005，6(4):33l-337.

［2］羅曉紅，萬東君，馮小明，等.CD4+CD2+5調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在多臟器功能障礙綜合征中的變化及藥物干預(yù)［J］.山東醫(yī)藥，2013，29(9):938-941.

［3］Shohei H，Shimon S.Foxp3:a critical regulator of the development and function of regulatory T cells［J］.Microb Infect，2004，6(8):745-751.

［4］Clemente AM.Effects of soluble extracts from Leishmania infantum promastigotes，Toxoplasma gondii tachyzoites on TGF-b mediated pathways in activated CD4+T lymphocytes［J］.Microb Infect，2014，12(8):1-10.

［5］梁惠花，劉曉河，王志寶，等.雷公藤多糖的提取和含量測定方法研究［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2004，21(1):8-10.

［6］Wenzel RP.Treating sepsis［J］.NEJM，2002，347(13):966-967.

［7］Lagu T，Rothberg MB，Shieh MS，et al.Hospitalizations，costs，and outcomes of severe sepsis in the United States 2003 to 2007［J］.Crit Care Med，2012，40(5):754-761.

［8］Hein F，Massin F，Cravoisy-Popovic A，et al.The relationship between CD4+CD2+5CD1-27regulatory T cells and inflammatory response and outcome during shock states［J］.Crit Care，2010，14(1):1120-1133.

［9］Moran JL，Myburgh JA，Syres GA，et al.The outcome of patients with sepsis and septic shock presenting to emergency departments in Australia and New Zealand［J］.Crit Care Resusc，2007，9(4):8-18.

［10］Cheng BL，Xie GH，Yao SL，et al.Epidemiology of severe sepsis in critical ill surgical patients in ten university hospitals in China［J］.Crit Care Med，2007，35(11):2538-2546.

［11］Yu W，Du H，F(xiàn)u Q，et al.The influence of Th1/Th2 and CD+4regulatory T cells of mesenteric lymph nodes on systemic lipopolysaccharide［J］.Pol J Pathol，2014，65(2):125-129.

［12］Sakguchi S，Sakguchi N，Asano M，et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25).Breakdown of a single mechanism of selftolerance cauvarious autoimmune disease［J］.J Immunol，1995，155(1):1151-1164.

［13］姚詠明，盛志勇.膿毒癥防治學(xué)［M］.北京:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2008:552-554.

［14］周向明，周昕，李毅民.當(dāng)歸補血湯的研究進(jìn)展［J］.世界中醫(yī)藥，2013，8(6):120-123.

［15］苗明三，方曉艷.當(dāng)歸補血湯多糖對大鼠血虛模型血清EL-2，IL-6，EPO水平的影響［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2004，12(3):23-25.

［16］苗明三，方曉艷，孫艷紅.當(dāng)歸補血湯多糖及其單味藥多糖對正常小鼠免疫功能的影響［J］.中藥藥理與臨床，2003，14(4):43-45.