真蛸谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶基因克隆、序列特性分析

洪婧妮，蘇永全，毛 勇，孫田田，王 軍

（廈門(mén)大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建 廈門(mén)361102）

真 蛸 （Octopus vulgaris）隸 屬 于 軟 體 動(dòng) 物 門(mén)（Mollusca）、頭足綱（Cephalopoda）、八腕目（Octopoda）、無(wú)須亞目（Incirrata）、蛸科（Octopodidae）、蛸屬（Octopus），具有生活史短、生長(zhǎng)速度快、食物轉(zhuǎn)化率高、對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境和人工運(yùn)輸具有較強(qiáng)的耐受力和適應(yīng)力等諸多優(yōu)良的養(yǎng)殖生物學(xué)特性［1－2］.真蛸是暖溫種，在26℃以上水溫難于生存，有關(guān)其適宜生長(zhǎng)溫度已有所研究［3－4］.

生物體在常態(tài)下保持體內(nèi)活性氧的收支平衡，已有研究發(fā)現(xiàn)，高水溫會(huì)使變溫生物細(xì)胞吞噬活性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致大量活性氧爆發(fā)［5－6］，過(guò)量的自由基如未能及時(shí)清除，會(huì)對(duì)機(jī)體的脂質(zhì)代謝、酶活性和DNA等造成嚴(yán)重?fù)p害［7］.為了避免過(guò)剩的自由基對(duì)機(jī)體造成損傷，生物體內(nèi)形成一套抗氧化系統(tǒng)，在清除過(guò)量自由基，保持機(jī)體活性氧動(dòng)態(tài)平衡中起到了重要作用［8－10］.

1957年Mills等在牛紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽（GSH）過(guò) 氧 化 物 酶 （glutathione peroxidase，GPX）［11］，之后發(fā)現(xiàn)該基因?yàn)槲?白，具 有催化 基團(tuán)——硒代半胱氨酸（Selenocysteine，Sec U）［12－13］.至今已發(fā)現(xiàn)了7種GPX種類(lèi)，其中細(xì)胞內(nèi)GPX1（cGPX）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物硒蛋白，也是目前克隆得到較多的類(lèi)型.1863年首次發(fā)現(xiàn)一類(lèi)具有分解過(guò)氧化氫作用的酶，1901年該酶被正式命名為過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT），之后通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)卟啉環(huán)是CAT的活性中心［14］.這2個(gè)基因主要在抗氧化系統(tǒng)中起到了清除過(guò)氧化氫的作用，保護(hù)生物體免受過(guò)氧化氫過(guò)量積累所帶來(lái)的損傷［15］.

本文克隆了真蛸GPX（OvGPX）和真蛸CAT（OvCAT）基因全長(zhǎng)，研究了2個(gè)基因氨基酸結(jié)構(gòu)特性，以及其在高溫條件下的表達(dá)特征，以期詮釋真蛸抗氧化酶蛋白的功能，揭示環(huán)境脅迫下OvGPX和OvCAT蛋白對(duì)于真蛸的保護(hù)作用，為真蛸的良種選育和資源保護(hù)等方面提供基礎(chǔ)資料和理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的暫養(yǎng)和取樣

本文所用的真蛸來(lái)自福建省霞浦縣北壁海區(qū)，帶回實(shí)驗(yàn)室以活蟹和貝類(lèi)喂食、蓄養(yǎng)1周（水溫22～24℃，鹽度26～27）后：1）選活潑正常的真蛸，取其消化腺置于由百泰克公司購(gòu)買(mǎi)的RNA fixer保存液中，4℃過(guò)夜后移入－20℃冰柜保存、備用；2）選28只健康活潑的個(gè)體，經(jīng)相應(yīng)水溫馴化恒定后，分別暫養(yǎng)在4個(gè)溫度組（24，26，28，30℃）中，每個(gè)溫度組7只個(gè)體，2h后各組隨機(jī)取3只個(gè)體，分別取其消化腺和櫛鰓，同上處理保存?zhèn)溆?

1.2 RNA提取、cDNA合成和基因全長(zhǎng)的獲得

總RNA提取利用Trizol方法，Trizol試劑購(gòu)自TaKaRa公司，具體實(shí)驗(yàn)步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.提取的RNA樣品存放于－80℃冰箱中保存，采用ND1000微量紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度和濃度；RNA第1鏈反轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa公司的Reverse Transcriptase M－MLV 試 劑 盒 進(jìn) 行，利 用 Oligo dT－RA為反轉(zhuǎn)錄引物，反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)根據(jù)說(shuō)明書(shū)操作，所得cDNA用作3′RACE模板.

反轉(zhuǎn)錄后的第1鏈cDNA，用NEB公司的RNahase試劑在37℃降解1h，加入2倍體積乙醇于－20℃ 靜置30min，4℃離心沉淀30min，加入超輕水（DDW）溶解，作為5′加尾的模板.5′加尾反應(yīng)體系為：19μL cDNA溶液，依次加入5×TdT緩沖液10μL，TdT 酶 （15U／μL）1μL，dATP（0.5mmol／L）2.5 μL，0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）牛血清白蛋白（BSA）5μL，加DDW補(bǔ)齊至50μL，試劑均購(gòu)自TaKaRa公司，37℃溫育30min，所得即為5′端模板.

利用cDNA 末端快速克隆（rapid amplification of cDNA ends，RACE）［16］的方法對(duì) OvGPX 和 OvCAT基因全長(zhǎng)進(jìn)行克隆，基因片段序列源自本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的真蛸神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)［17］，片段用于進(jìn)一步擴(kuò)增.設(shè)計(jì)參與3′RACE的特異性引物分別為GPX－F1、GPX－F2、CAT－F1、CAT－F2；5′RACE 的反應(yīng)特異性引物為 GPX－R1、GPX－R2、CAT－R1、CAT－R2（引物序列詳見(jiàn)表1）.

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，利用鷺隆公司的凝膠回收試劑盒進(jìn)行膠回收；將純化后的PCR產(chǎn)物利用TaKaRa公司的pMD19－T載體進(jìn)行克隆，用DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，感受態(tài)細(xì)胞試劑盒購(gòu)自鷺隆公司，具體操作步驟根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.轉(zhuǎn)化后氨芐培養(yǎng)基培養(yǎng)16h，隨機(jī)挑選6個(gè)克隆，PCR反應(yīng)和瓊脂糖凝膠檢測(cè)后送南京金斯瑞公司測(cè)序.

1.3 序列分析和多重序列比對(duì)

通過(guò) Blast（http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）查找同源序列，利用ClustalX和Dnaman軟件進(jìn)行多序列同源比對(duì)；以O(shè)RFfinder（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／orfig.cgi）進(jìn)行開(kāi)放閱讀框（ORF）查找；在線 Protparam （http：∥web.expasy.org／cgi－bin／protparam／protparam）軟件分析氨基酸序列組成、分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；Smart在線軟件、Interproscan在線軟件預(yù)測(cè)編碼蛋白的基因特征基序、功能域（http：∥www.ebi.ac.uk／Tools／pfa／iprscan／、http：∥smart.embl－h(huán)eidelberg.de／）；利用 SECISearch2.19在 線 軟 件 （http：∥genome.unl.edu／SECISearch.html）預(yù)測(cè)GPX是否存在硒半胱氨酸（Sec）插入序列（SECIS）結(jié)構(gòu)；利用 NetNGlyc軟件（http：∥www.cbs.dtu.dk／services／NetNGlyc／）預(yù)測(cè)GPX和CAT糖基結(jié)合位點(diǎn).

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）檢測(cè)不同溫度下OvGPX和OvCAT的基因表達(dá)變化

為了解OvGPX和OvCAT基因在不同溫度應(yīng)激下的表達(dá)變化，本文以不同溫度組的消化腺和櫛鰓的cDNA第1鏈為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng).RNA提取和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)分別采用百泰克公司的RNA Plus試劑盒和TaKaRa公司的 PrimeScript?RT reagent Kit試劑盒，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作.應(yīng)用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM II試劑盒，在 Rotor－gene3000熒光實(shí)時(shí)定量熱循環(huán)儀上進(jìn)行qPCR反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.合成基因特異性引物GPX－F、GPX－R、CAT－F和 CAT－R用于該實(shí)驗(yàn)，以β－actin 基因作為qPCR的內(nèi)參基因（序列見(jiàn)表1）.根據(jù)qPCR給出的Ct值，取3個(gè)平行樣本的平均值，利用2－ΔΔCt方法計(jì)算2個(gè)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量.

表1 實(shí)驗(yàn)用引物表Tab.1 Primers used in this study

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式，顯著性分析水平為p＜0.05，并做柱狀圖.

2 結(jié) 果

2.1 OvGPX和OvCAT基因序列分析

以RACE方法，拼接得到OvGPX基因.得到的OvGPX cDNA全長(zhǎng)為925bp，包含5′非編碼區(qū)（5′UTR）36bp，3′非編碼區(qū)（3′UTR）316bp，ORF 573 bp，共編碼190個(gè)氨基酸，推測(cè)分子質(zhì)量21.5ku，等電點(diǎn)pI為7.81.OvGPX推導(dǎo)的氨基酸序列（圖1）含有GPX家族2個(gè)典型酶活性位點(diǎn)基序，分別是從28GKVILVENVASLUGTT43和64LGFPCNQF71；并含有特有的Sec，利用SECISearch2.19在線軟件在OvGPX基因的3′UTR處預(yù)測(cè)到1個(gè)SECIS，全長(zhǎng)91bp（圖2），含1個(gè)頂環(huán)和1個(gè)AG－GA SECIS核，頂環(huán)處存在保守的AAA序列.

得到的 OvCAT 全長(zhǎng)為2 109bp，包含5′UTR 135bp、3′UTR 435bp和ORF 1 539bp，共編碼512個(gè)氨基酸，推測(cè)分子質(zhì)量58.3ku，等電點(diǎn)pI為8.76（圖3）.通過(guò)功能域預(yù)測(cè)，推導(dǎo)的OvCAT氨基酸序列含有1個(gè)過(guò)CAT活性位點(diǎn)（61FNRERIPERVVHAKGAG77）、1個(gè)近端血紅素配體標(biāo)簽序列（351RLYSYSDT358）和1個(gè)酶免疫響應(yīng)區(qū)（位點(diǎn)428～494）.并發(fā)現(xiàn)了3個(gè)參與過(guò)氧化氫酶催化位點(diǎn)（His－71，Asn－144和 Tyr－354），同時(shí)預(yù)測(cè)到了3個(gè)糖基結(jié)合位點(diǎn)NASL、NYSQ、NVSS.

圖1 OvGPX的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of OvGPX cDNA

圖2 OvGPX基因的SECIS元件示意圖.2The SECIS functional element of OvGPX

2.2 OvGPX和OvCAT基因氨基酸序列同源性分析

通過(guò)Blast、Clustal X和DNAman等分析軟件，將OvGPX推導(dǎo)的氨基酸序列與8種脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物的GPX氨基酸序列進(jìn)行多序列分析（圖4）.結(jié)果表明OvGPX氨基酸序列高度保守，所有比對(duì)序列基本都含有GPX的2個(gè)酶活性位點(diǎn)基序，且都有Sec.與曼氏無(wú)針烏賊（Sepiella maindroni）的 GPX氨基酸序列同源性最高（74%），與人類(lèi)（Homo sapiens）的GPX氨基酸序列同源性也達(dá)60%.

將本實(shí)驗(yàn)得到的OvCAT的氨基酸序列與8種已有動(dòng)物的CAT氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)（圖5）.結(jié)果顯示，所比對(duì)物種的CAT氨基酸序列高度保守，基本都含有CAT的特征基序和3個(gè)參與催化的殘基.比對(duì)結(jié)果顯示，不同物種相似性較高，OvCAT氨基酸序列與同是軟體動(dòng)物門(mén)的香港巨牡蠣（Crassostrea hongkongensis）和 盤(pán) 鮑 （Haliotis discus）的CAT氨基酸序列相似性高達(dá)76%和75%，與人類(lèi)的CAT氨基酸序列相似性也有68%.

圖3 OvCAT的核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of OvCAT cDNA

圖4 OvGPX氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Alignment of OvGPX amino acid sequences

2.3 OvGPX和OvCAT基因mRNA在不同溫度下的表達(dá)分析

以qPCR方法分析了OvGPX基因在24，26，28和30℃不同溫度組處理2h后消化腺和櫛鰓的mRNA表達(dá)量差異（圖6）.

在消化腺和櫛鰓中，OvGPX mRNA表達(dá)量均在28℃組最高，分別達(dá)到24℃組的7.57倍（p＜0.01）和2.19倍.在30℃組，櫛鰓OvGPX mRNA的表達(dá)水平下降，只有24℃組的1／3（p＜0.05）；而消化腺中OvGPX mRNA的表達(dá)量與室溫組沒(méi)有顯著差異.

不同溫度組處理2h，真蛸消化腺和櫛鰓中OvCAT mRNA的表達(dá)量差異如圖7，在消化腺和櫛鰓中，28℃組OvCAT mRNA表達(dá)量明顯升高，分別達(dá)到24℃的2.36倍（p＜0.01）、2.13倍（p＜0.01）；在消化腺中26和30℃組的OvCAT mRNA表達(dá)量與24℃組無(wú)顯著差異；櫛鰓的OvCAT mRNA表達(dá)水平在30℃組低于24℃組，為24℃組的0.57.

不同溫度組qPCR結(jié)果表明，OvGPX和OvCAT 2個(gè)基因的表達(dá)水平在不同溫度組的表達(dá)差異相似，但是OvGPX的mRNA表達(dá)量變化波動(dòng)較OvCAT明顯.

3 討 論

本文研究得到的OvGPX cDNA全長(zhǎng)，除了具有2個(gè)高度保守的特征基序，預(yù)測(cè)的氨基酸序列中還發(fā)現(xiàn)了由UGA編碼的Sec U，這是GPX的中心催化基團(tuán)，能夠催化GSH分解體內(nèi)的氫過(guò)氧化物，從而防止細(xì)胞膜和其他生物組織遭受過(guò)氧化損傷［12－13］.UGA在一般情況下作為終止密碼子，但在OvGPX基因中，其主要編碼被稱(chēng)為第21種氨基酸的Sec［18］.該編碼依賴(lài)硒元素，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)缺乏硒時(shí)，硒蛋白的翻譯會(huì)在UGA密碼子處中止，成為不完整而沒(méi)有功能的蛋白；而破譯UGA使其編碼Sec需要SECIS元件［19］的作用，SECIS元件是一個(gè)位于GPX基因3′UTR部分的一個(gè)莖－環(huán)發(fā)卡結(jié)構(gòu)，本文得到的OvGPX基因，在3′UTR區(qū)同樣發(fā)現(xiàn)了SECIS序列，這段序列由螺旋莖和頂環(huán)、內(nèi)環(huán)組成，在莖的基部具有保守的AUGAC和UGAC形成的形成非 Watson－Crick雙鏈，結(jié)構(gòu)完整，這個(gè)完整的SECIS元件保證了OvGPX基因的正確轉(zhuǎn)錄.SECIS元件的分類(lèi)主要根據(jù)保守的AAA序列是否位于頂環(huán)進(jìn)行判斷，本研究得到的OvGPX基因的SECIS元件，AAA序列位于頂環(huán)，與人類(lèi)的OvGPX1一樣屬于一類(lèi)［20－21］.

圖5 OvCAT氨基酸序列比對(duì)Fig.5 Alignment of OvCAT amino acid sequences

圖6 qPCR方法下的OvGPX在不同溫度的表達(dá)量Fig.6 The expression of OvGPX at different temperatures by qPCR

圖7 qPCR方法下的OvCAT在不同溫度的表達(dá)量Fig.7 The expression of OvCAT at different temperatures by qPCR

水生動(dòng)物受到熱應(yīng)激后的抗氧化酶的活性變化有所差異，翡翠貽貝（Perna viridis）熱激后，SOD、CAT、GST、GPX等酶活力都明顯的高于對(duì)照組［22］；雙線血蛤（（Hiatula diphos）和中國(guó)血蛤（Hiatula chinensis）在20～70℃不同的水溫刺激下，CAT酶活性變化趨勢(shì)表現(xiàn)為先上升，后下降，且雙線血蛤的變化幅度比中國(guó)文蛤明顯［23］；在對(duì)盤(pán)鮑的28℃熱應(yīng)激研究中發(fā)現(xiàn)，GPX、CAT和SOD 3個(gè)基因的mRNA表達(dá)量在熱應(yīng)激后均上調(diào)［24］.可見(jiàn)，熱激強(qiáng)度不同和熱激時(shí)間的長(zhǎng)短，對(duì)抗氧化酶活性造成的變化并不相同，而同一實(shí)驗(yàn)條件下，不同物種的GPX或CAT酶活性變化也有差異.這些結(jié)果說(shuō)明GPX和CAT這2種抗氧化酶參與熱應(yīng)激后的自由基清除活動(dòng)，保證了機(jī)體免受過(guò)度自由基損傷.本實(shí)驗(yàn)中，不同的溫度應(yīng)激后，消化腺中的OvGPX和OvCAT基因的mRNA表達(dá)量在應(yīng)激條件下均有上升，體現(xiàn)了2個(gè)抗氧化基因在熱應(yīng)激壓力下清除過(guò)氧化氫，保護(hù)機(jī)體的積極作用；櫛鰓OvGPX和OvCAT的mRNA表達(dá)量在28℃組有所升高，26和30℃組表達(dá)量下降，說(shuō)明消化腺和櫛鰓抗氧化能力可能有所不同.本文不同強(qiáng)度的熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OvGPX mRNA表達(dá)量的變化幅度明顯大于OvCAT，顯示了OvGPX對(duì)氧化應(yīng)激較為敏感.

本文克隆了OvGPX和OvCAT基因全長(zhǎng)，并探索2個(gè)基因在不同熱激強(qiáng)度下的表達(dá)情況，初步確定2個(gè)基因參與熱應(yīng)激脅迫后的抗氧化反應(yīng).這些數(shù)據(jù)為進(jìn)一步研究OvGPX和OvCAT的生物學(xué)功能提供有效信息，并為深入探索頭足類(lèi)動(dòng)物的抗氧化體系奠定理論基礎(chǔ).

［1］Navarro J C，Villanueva R.The fatty acid composition of Octopus vulgaris paralarvae reared with live and inert food：deviation from their natural fatty acid profile［J］.Aquaculture，2003，219：613－631.

［2］Iglesias J，Otero J J，Moxica C，et al.The completed life cycle of the octopus （Octopus vulgaris，Cuvier）under culture conditions：paralarval rearing using Artemia and zoeae，and first data on juvenile growth up to 8months of age［J］.Aquaculture International，2004，12 （4／5）：481－487.

［3］徐實(shí)懷，馬之明，賈曉平，等.人工養(yǎng)殖條件下真蛸的生物學(xué)特性及胚胎發(fā)育［J］.南方水產(chǎn)，2009，5（2）：63－68.

［4］Delgado M，Gairin J I，Carbo R，et al.Growth of Octopus vulgaris （Cuvier，1797）in tanks in the Ebro Delta（NE Spain）：effects of temperature，salinity and culture density［J］.Scientia Marina，2011，75：53－59.

［5］Chilmonczyk S，Monge D.Rainbow trout gill pillar cells：demonstration of inert particle phagocytosis and involvement in viral infection［J］.Journal of the Reticuloendothelial Society，1980，28（4）：327－332.

［6］Halliwell B.Free radicals，antioxidants，and human disease：curiosity，cause or consequence ［J］.Lancet，1994，344：721－724.

［7］Wiseman H，Halliwell B.Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen species：role in inflammatory disease and progression to cancer［J］.The Biochemical Journal，1996，313：17－29.

［8］Gotia S，Popovici I，Hermeziu B.Antioxidant enzymes levels in children with juvenile rheumatoid arthritis［J］.Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi，2001，105（3）：499－503.

［9］Cetinkaya O，Silig Y，Cetinkaya S，et al.The effects of Rumex patientia extract on rat liver and erythrocyte antioxidant enzyme system［J］.Die Pharmazie，2002，57（7）：487－488.

［10］Muruganandan S，Gupta S，Kataria M，et al.Mangiferin protects the streptozotocin－induced oxidative damage to cardiac and renal tissues in rats［J］.Toxicology，2002，176（3）：165－173.

［11］Mills G C.Hemoglobin catabolism.I.Glutathione peroxidase，an erythrocyte enzyme which protects hemoglobin from oxidative breakdown［J］.The Journal of Biological Chemistry，1957，229（1）：189－197.

［12］Flohe L，Genzler W A，Schock H H.Glutathione peroxidase：a selenoenzyme［J］.FEBS Letters，1973，32（1）：132－134.

［13］Rotruck J T，Pope A L，Ganther H E，et al.Selenium：biochemical role as a component of glutathione peroxidase［J］.Science，1973，179：588.

［14］劉冰，梁嬋娟.生物過(guò)氧化氫酶研究進(jìn)展［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21（5）：223－224.

［15］Nordberg J，Arner E S J.Reactive oxygen species，antioxidants and the mammalian thioredoxin system ［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，2001，31：1287－1312.

［16］薩姆布魯克J，拉塞爾 D W，著.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］.3版.黃培堂，等譯.北京：科學(xué)出版社，2002.

［17］Zhang X，Mao Y，Huang Z，et al.Transcriptome analysis of the Octopus vulgaris central nervous system［J］.PLoS One，2012，7（6）：e40320.

［18］Stadtman T C.Selenocysteine［J］.Annual Review of Biochemistry，1996，65：83－100.

［19］Fagegaltier D，Lescure A，Walczak R，et al.Structural analysis of new local features in SECIS RNA hairpins［J］.Nucleic Acids Research，2000，28（14）：2679－2689.

［20］Grundener－Culemann E，Martin G W，Harney J W，et al.Two distinct SECIS structures capable of directing selenocysteine incorporation in eukaryotes［J］.RNA，1999，5（5）：625－635.

［21］Kryukov G V，Castellano S，Novoselov S V，et al.Characterization of mammalian selenoproteomes［J］.Science，2003，300（5624）：1439－1443.

［22］Verlecar X N，Jena K B，Chainy G B.Biochemical markers of oxidative stress in Perna viridis exposed to mercury and temperature［J］.Chemico－biological Interactions，2007，167（3）：219－226.

［23］孫業(yè)勇，高如承，溫?fù)P敏.溫度對(duì)中國(guó)血蛤、雙線血蛤肝臟中水解酶和抗氧化酶活性的影響［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2008，10（27）：543－544.

［24］De Zoysa M，Whang I，Lee Y，et al.Transcriptional analysis of antioxidant and immune defense genes in disk abalone（Haliotis discus discus）during thermal，low－salinity and hypoxic stress［J］.Comparative Biochemistry and Physiology：Part B，2009，154（4）：387－395.