夏眠期間仿刺參生長、腸體比以及RNA／DNA比值變化的研究

王青林，于姍姍，董云偉

（廈門大學 海洋與地球學院，近海海洋環(huán)境科學國家重點實驗室，福建 廈門361102）

仿刺參（Apostichopus japonicus Selenka），又名刺參，主要分布于北緯35～44°N的西北太平洋沿岸［1－2］.當水溫超過25 ℃時，仿刺參進入夏眠（aestivation）狀態(tài)［3－4］.夏眠期間，仿刺參會出現代謝減弱，體質量減輕，內臟器官退化等現象［5－6］.夏眠是仿刺參生活史中的一個重要環(huán)節(jié)，有研究指出夏眠是仿刺參應對夏季高溫期的一種適應策略［4，7］.但是由于夏眠持續(xù)時間長達4個月，期間仿刺參體質量下降，且死亡率高達30%～40%，嚴重影響了仿刺參的生長以及產量的提高［8］.因此研究夏眠期間仿刺參的生理有助于了解其夏眠機制，對仿刺參夏季高溫養(yǎng)殖提供一定的理論指導.

動物的生長是通過蛋白質生物合成實現的［9－10］.Bulow［11］研究認為：在蛋白質合成過程中，mRNA和tRNA是重要的參與者，當組織中的蛋白質合成速度加快時，RNA濃度也增加.組織中的RNA濃度與動物的生長速度、外界食物密度以及溫度等因素相關［12－13］，而 DNA是生物的遺傳物質，含量一般保持穩(wěn)定，不受外界因子的影響［14］.因此，RNA／DNA（簡稱R／D）比值能準確地反映組織蛋白質合成水平.20世紀70年代以來，人們開始利用R／D比值來判斷魚類生長的優(yōu)劣，認為其可以作為魚類生長狀況的評價 指 標［15－18］.司 亞 東 等［19］通 過 對 比 研 究 表 明 鯉（Cyprinus carpio）白肌中的 R／D比值在饑餓與飽食狀態(tài)下有差異，認為R／D比值可以推斷魚幼體的營養(yǎng)狀況.在甲殼動物的研究中也得到了類似的結果［20］.此外，Kobari等［21］指出 R／D比值可以作為辨別橈足類動物是否進入休眠狀態(tài)的簡單有效的生理指標.但是關于R／D比值在棘皮動物特別是仿刺參方面的研究還尚未見報道.因此，本實驗通過測定分析仿刺參夏眠過程中腸體比以及腸、呼吸樹和體壁中R／D比值變化，研究夏眠期間仿刺參R／D比值與其生理狀況之間的關系.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所需仿刺參幼參采自山東省即墨市育苗場，平均體質量為（50.43±0.11）g.購買的仿刺參在實驗室內16℃暫養(yǎng).暫養(yǎng)期間不間斷充氣，光照周期為14 L∶10D.水源為沙濾自然海水，每天換水1／2，海水鹽度為30左右.換水前對海水進行預加熱，防止換水造成水族箱溫度變化過大.每天4：00pm投喂仿刺參配合飼料，組成（質量分數）為：粗蛋白（22.9±0.2）%、粗脂肪（2.1±0.1）%、灰分（34.7±0.6）%，含水量（9.0±0.1）%，能值（10.6±0.0）kJ／g.

1.2 實驗方法

1.2.1 溫度變化模式

實驗分夏眠組和對照組，共持續(xù)49d.夏眠組水溫以每周5℃（0.7℃／d）的速度由16℃逐漸升至26℃，水溫達到26℃后維持5周.對照組16℃恒溫維持7周.

1.2.2 生長實驗

將仿刺參放置在6個玻璃缸中（長×寬×高：450 mm×250mm×350mm），分夏眠組和對照組，每組3個缸，每缸3只.仿刺參初始平均濕體質量為（50.72±1.05）g，對照組和夏眠組沒有顯著性差異（p＞0.05）.在整個實驗過程中，每7天稱仿刺參體質量一次，實驗持續(xù)49d.實驗結束后，稱仿刺參末體質量.稱體質量時，先對仿刺參進行24h饑餓，然后用滅菌紗布拭去體表水后用MP－120型電子天平進行濕體質量的稱量.

仿刺參特定生長率（SGR）由以下公式計算［22］：

其中，W2和W1分別表示仿刺參的末體質量（g）和初始體質量（g）；D為實驗持續(xù)的時間（d）.

1.2.3 腸體比實驗

將仿刺參放置在10個玻璃缸中（長×寬×高：450mm×250mm×350mm），分夏眠組和對照組，每組5個缸，每缸10只.分別在0，7，14，21，28，35，42和49d每缸隨機取1只仿刺參，迅速解剖并分離出腸、呼吸樹、體壁，稱量后保存于液氮中，待測.對腸、呼吸樹、體壁進行稱量時，先用濾紙吸去表面水分，然后用MP－120型電子天平稱量.

腸體比（viserosomatic index，VI）按照以下公式計算：

其中，Wi為腸質量（g）；W 為仿刺參體質量（g）.

1.2.4 R／D比值測定

采用劉存歧等［20］的方法進行.

把適量腸、呼吸樹或體壁與緩沖液（0.05mol／L Tris－HCl，pH＝7.4）混合，勻漿，取1.4mL勻漿液與0.7mL冷的0.6mol／L HClO4混合.放置冰上冷卻15min后，4℃離心（12 000r／min）10min（GL－20G－II冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠），棄去上清液.在沉淀中加入1.12mL 0.3mol／L的 KOH 37 ℃水浴1h，然后冰浴30min，4℃離心10min（同上）.取上清液，于751G型分光光度計（上海分析儀器廠）上讀取260nm處的吸光值，此為RNA在260nm處的吸光值.將沉淀用2.0mL冷的0.2mol／L的 HClO4洗滌，離心，去掉上清液.在沉淀中加入2.2mL 0.6 mol／L的HClO4，5℃水浴15min后，冰浴15min，離心，沉淀為蛋白質.取上清液，在260nm處測吸光值，此為DNA在260nm處的吸光值.從而估測RNA和DNA的含量，計算R／D（質量比）比值.

1.3 數據分析

數據統(tǒng)計采用SPSS 13.0進行，同組不同時間點之間仿刺參體質量以及R／D比值的差異采用單因子方差分析（one－way ANOVA）；同組不同時間點之間腸體比差異采用體質量為協(xié)變量的協(xié)方差分析（analysis of covariance）；相同時間點不同組之間仿刺參體質量、腸體比以及R／D比值的差異采用t檢驗進行分析，以p＜0.05作為差異顯著的標準.

2 結 果

2.1 生 長

如圖1所示，實驗期間對照組仿刺參體質量持續(xù)增加，不同時間點仿刺參體質量差異顯著（p＝0.011）.夏眠組仿刺參體質量呈下降趨勢，第49天時仿刺參濕體質量降至（41.34±0.57）g，且不同時間點差異顯著（p＜0.001）.從第21天開始對照組和夏眠組仿刺參體質量差異顯著（21d：p＝0.012；28d：p＝0.004；35d：p＝0.002；42d：p＝0.001；49d：p＝0.001）.

2.2 腸體比

如圖2，對照組仿刺參的腸體比比較穩(wěn)定，各時間點差異不顯著（p＝0.279）.夏眠組仿刺參不同時間點腸體比變化差異顯著（p＜0.001），可以分成2個階段，在0～28d仿刺參腸體比急劇下降，從（2.73±0.07）%降至（0.34±0.04）%；在28～49d腸體比維持在較低的水平.且體質量和取樣點對腸體比的交互作用不顯著（夏眠組：p＝0.451；對照組：p＝0.553）.從第14天開始對照組和夏眠組仿刺參腸體比比值差異顯著（14d：p＝0.012；21d：p＝0.016；28d：p＝0.003；35d：p＜0.001；42d：p＝0.001；49d：p＜0.001）.

圖1 2種溫度模式下仿刺參體質量變化Fig.1 The body weight of the sea cucumber

圖2 2種溫度模式下仿刺參腸體比的變化Fig.2 The viserosomatic index of sea cucumbers

2.3 R／D比值

2.3.1 體壁、呼吸樹、腸中R／D比值

體壁的R／D比值如圖3（a）所示.實驗過程中，對照組R／D比值始終維持在較低的水平，且各時間點之間差異不顯著（p＝0.258）.夏眠組R／D比值的變化分2個階段：溫度升高的過程中，R／D比值逐漸升高，溫度恒定后R／D比值開始逐漸下降，至實驗結束時恢復到初始水平，不同時間點之間差異顯著（p＝0.001）.7，14，21和28d夏眠組R／D比值顯著高于對照組（7d：p＝0.024；14d：p＝0.024；21d：p＝0.003；28d：p＝0.036）.

呼吸樹中R／D比值如圖3（b）所示.對照組R／D比值始終維持在較低的水平，且各時間點之間差異不顯著（p＝0.975）.夏眠組R／D比值在升溫過程中逐漸升高，然后在14～28d維持在較高的水平，隨后逐漸下降，至49d恢復至初始水平，各時間點之間差異顯著（p＝0.001）.7，14，21和28d夏眠組R／D比值顯著高于對照組（7d：p＝0.034；14d：p＝0.017；21d：p＝0.006；28d：p＝0.026）.

腸中R／D比值如圖3（c）所示.對照組R／D比值始終維持在較低的水平，且各時間點之間差異不顯著（p＝0.334）.夏眠組 R／D比值變化總體呈現先升高后降低的趨勢，各時間點之間差異顯著（p＜0.001）.7，21和28d夏眠組R／D比值顯著高于對照組（7d：p＝0.026；21d：p＝0.026；28d：p＝0.032）.

2.3.2 夏眠組仿刺參腸、呼吸樹和體壁中R／D比值的對比

圖3 2種溫度模式下仿刺參體壁（a）、呼吸樹（b）以及腸（c）R／D比值的變化Fig.3 The R／D ratio in body wall（a），respiratory tree（b）and intestine（c）of sea cucumbers A.japonicus in the two treatments in a 49dtrial

如圖4所示，夏眠組腸、呼吸樹和體壁中R／D比值總體呈現相同的變化趨勢，其中呼吸樹變化幅度最小，體壁變化幅度最大，腸表現出了較高的初始值.各取樣點3個部位R／D比值差異不顯著（0d：p＝0.148；7d：p＝0.086；14d：p＝0.224；21d：p＝0.051；28d：p＝0.680；35d：p＝0.486；42d：p＝0.812；49d：p＝0.806）.

圖4 夏眠組仿刺參腸、體壁及呼吸樹R／D比值的對比Fig.4 The R／D ratio in intestine，body wall and respiratory tree of sea cucumbers A.japonicus in aestivation group in a 49dtrial

3 討 論

夏眠是動物應對食物缺乏、環(huán)境高溫等極端生存條件的一種生存策略［23－25］.夏眠期間仿刺參處于休眠狀態(tài)，腸道退化，攝食停止，體質量減輕［4，26－27］.高溫期仿刺參攝食情況可以作為判斷其是否進入夏眠階段的依據［28－30］.實驗過程中，夏眠組仿刺參體質量持續(xù)下降（圖1）.期間，觀察發(fā)現，隨著溫度緩慢升高仿刺參攝食逐漸減少.當溫度升至26℃，并維持1周時仿刺參攝食基本為0，因此可以認為仿刺參進入了夏眠階段.

實驗期間夏眠組仿刺參的腸體比呈下降的趨勢，按比值下降的程度可分為3個階段：第1階段從0～14d；第2階段從14～21d；第3階段從21～49d.其中第2階段腸體比急劇下降，至第3階段時腸體比維持在較低的水平.腸體比比值的下降表明仿刺參腸的退化，李霞等［31］和蘇琳等［32］根據消化道外部形態(tài)和組織結構變化特點，將夏眠退化過程分為早、中、晚3個階段，其中中期消化道萎縮現象明顯，組織結構退化嚴重，此期對應本實驗第2階段，到晚期時消化道已經萎縮成細線狀，此時仿刺參進入夏眠狀態(tài).因此21d時仿刺參進入夏眠狀態(tài).這與根據攝食情況判斷仿刺參是否進入夏眠階段的結果一致.夏眠期間消化道急劇萎縮，攝食停止，此時沒有外源食物攝入，仿刺參只能消耗自身物質來維持基本的代謝活動，導致體質量持續(xù)下降（圖1）.

本實驗的結果顯示，從7～28d夏眠組仿刺參腸、體壁及呼吸樹中R／D比值均高于對照組，且21d（夏眠開始）和28d（夏眠狀態(tài)持續(xù)1周）的R／D比值要顯著高于對照組（p＜0.05）.我們之前的研究表明，當水溫由16℃升至26℃的過程中，HSP70的表達水平隨溫度的升高而上調，進入夏眠階段后，初期HSP70表達維持在較高的水平，隨后隨著夏眠時間的持續(xù)呈現下降的趨勢［4］.本實驗中，相同的溫度模式下，HSP70的表達應該具有相同的表達趨勢，即：從0～14d，熱休克蛋白（HSPs）表達量逐漸升高，隨后在21～28d維持在較高的水平，然后隨著實驗的進行，表達量逐漸下降至初始水平.HSPs表達水平與R／D比值呈現出的相同趨勢，說明這種比值的升高與體內大量合成用于抵抗高溫脅迫的蛋白質有關.HSP70具有幫助變性蛋白重新折疊，防止變性蛋白凝聚沉淀的作用［33－35］.在高溫脅迫條件下，機體會優(yōu)先合成 HSPs，因此HSPs表達水平和R／D比值有所升高.但是這種過程不能持續(xù)太長時間，這是因為HSPs的合成以及發(fā)揮作用需要消耗大量的能量，機體中存在著熱耐受和代謝輸出之間的一種平衡［35］.在夏眠階段為維持生存，必須降低代謝，因此蛋白質的合成不能較長時間維持高水平，故在本實驗中后期HSPs和R／D比值逐漸下降.

體壁、呼吸樹以及腸R／D比值不同（圖4），這是因為不同器官對溫度脅迫的敏感性不同［36］.體壁R／D比值變化幅度較大，說明相比呼吸樹和腸，體壁能夠更敏感地反映夏眠狀態(tài)仿刺參R／D比值的變化.夏眠組腸R／D比值在14d較7d下降，且差異顯著（p＜0.05），主要是由于升溫過程中，仿刺參腸的退化（圖3（c））.從圖2可以看出14d開始腸體比急劇下降，且與7和21d差異顯著（p＜0.05），說明腸在此階段結構退化非常嚴重，這種組織結構的退化通過R／D比值的降低來體現.從14～21d，夏眠組仿刺參仍有少量攝食，到21d時基本為0.攝食活動說明21d時腸仍然具有一定的結構和功能，因此此時R／D比值較實驗后期有較高的水平.

Kobari等［21］通過對比水體表層和中層橈足類R／D比值發(fā)現，中層的處于休眠狀態(tài)的橈足類R／D比值顯著低于表層活躍個體，認為R／D比值可以作為評價此種動物是否進入夏眠的指標.目前尚未發(fā)現有關于其他水生動物的相關報道.本實驗結果表明，在夏眠初期夏眠組R／D比值顯著高于對照組，表明R／D比值能夠反映夏眠仿刺參的一些特征，但是關于R／D比值能否作為評價仿刺參進入夏眠的指標還需要進一步的研究.

總體來說，夏眠過程中仿刺參腸道嚴重退化，R／D比值可以用來反映夏眠階段仿刺參的生長特征，夏眠初期腸、體壁及呼吸樹中R／D比值的升高可能與HSPs的上調表達有關.

［1］LiaoY L.The aspidochirote holothurians of China with erection of a new genus［C］∥Proceedings of the European Colloquium on Echinoderms.Rotterdam，Holland：A A Balkema，1980：115－120.

［2］廖玉麟.中國動物志：棘皮動物門，海參綱［M］.北京：科學出版社，1997.

［3］Yang H S，Zhou Y，Zhang T，et al.Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus（Selenka）during aestivation［J］.Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，2006，330：505－510.

［4］Ji T T，Dong Y W，Dong S L.Growth and physiological responses in the sea cucumber，Apostichopus japonicus Selenka：aestivation and temperature［J］.Aquaculture，2008，283（1／2／3／4）：180－187.

［5］YangH S，Yuan X T，Zhou Y，et al.Effects of body size and water temperatureon food consumption and growth in the sea cucumber Apostichopus japonicus （Selenka）with special reference to aestivation［J］.Aquaculture Research，2005，36：1085－1092.

［6］Dong Y W，Dong S L.Induced thermotolerance and expression of heat shock protein 70in sea cucumber Apostichopus japonicus［J］.Fishery Science，2008，74：573－578.

［7］Yuan X T，Yang H S，Wang L L，et al.Effects of aestivation on the energy budget of sea cucumber Apostichopus japonicas（Selenka）（Echinodermata：Holothuroidea）［J］.Acta Ecologica Sinca，2007，27：3155－3161.

［8］劉永安，李馥馨，宋本祥，等.刺參（Apostichopus japonicus SelenKa）夏眠習性研究Ⅰ——夏眠生態(tài)特點的研究［J］.中國水產科學，1996，3（2）：41－48.

［9］Valente L M P，Moutou K A，Concei??o L E C，et al.What determines growth potential and juvenile quality of farmed fish species［J］.Reviews in Aquaculture，2013，5（Sup.1）：S168－S193.

［10］Carter C G，Mente E.Protein synthesis in crustaceans：a review focused on feeding and nutrition［J］.Central European Journal of Biology，2014，9：1－10.

［11］Bulow F J.Seasonal variations in RNA／DNA ratios and in indicators of feeding，reproduction，energy storage，and condition in population of Bluegill，Lepomis macrochirus Rafinesque［J］.Journal of Fish Biology，1981，18（3）：237－244.

［12］Wagner M，Durbin E，Buckley L.RNA∶DNA ratios as indicators of nutritional condition in the copepod Calanus finmarchicus［J］.Marine Ecology Progress Series，1998，162：173－181.

［13］Wagner N D，Hillebrand H，Wacker A，et al.Nutritional indicators and their uses in ecology ［J］.Ecology Letters，2013，16：535－544.

［14］Sivaraman G K，Barat A，Ali S，et al.Prediction of fish growth rate and food availability in the Himalayan Waterbodies by estimation of RNA／DNA ratios［J］.IUP Journal of Genetics ＆ Evolution，2011，4（3）：15－19.

［15］Grimm C，Lehmann K，Clemmesen C，et al.RNA／DNA ratio is an early responding，accurate performance parameter in growth experiments of noble crayfish Astacus astacus（L.）［J］.Aquaculture Research，2013（Article first published online）.doi：10.1111／are.12348.

［16］Zehra S，Khan M A.Dietary lysine requirement of fingerling Catla catla （Hamilton）based on growth，protein deposition，lysine retention efficiency，RNA／DNA ratio and carcass composition［J］.Fish Physiology and Bio－Chemistry，2013，39（3）：503－512.

［17］BuckleyL J.Relationships between RNA／DNA ratio，prey density，and growth rate in Atlatic cod （Gadus morhua）larvae［J］.Journal ofthe Fisheries Board of Canada，1979，36（12）：1497－1502.

［18］Mercaldo－Allen R，Kuropat C A，Perry D M，et al.Relation between nucleic acid indices and growth rate in fed and fasting juvenile scup［J］.North American Journal of Aquaculture，2014，76（1）：1－8.

［19］司亞東.鯉魚白肌中的RNA／DNA值與其生長的關系［J］.上海水產大學學報，1992，1（3／4）：159－167.

［20］劉存歧，沈會濤，吳玲玲.日本沼蝦體內RNA／DNA比值與其生長關系的研究［J］.河北大學學報：自然科學版，2006，26（5）：524－528.

［21］Kobari T，Mori H，Tokushige H.Nucleic acids and protein content in ontogenetically migrating copepods in the Oyashio region as influenced by development stage and depth distribution ［J］.Journal of Plankton Research，2013，35（1）：97－104.

［22］董云偉，董雙林，田相利，等.不同水溫對刺參幼參生長、呼吸機體組成的影響 ［J］.中國水產科學，2005，12（1）：33－37.

［23］Abe A S.Estivation in South American amphibians and reptiles［J］.Brazilian Journal of Medical and Biological Research，1995，28：1241－1247.

［24］LandS C，BernierN J.Estivation，mechanisms and control of metabolic suppression［M］.Amsterdam，Holland：Elsevier Science，1995.

［25］Withers P C，Cooper C E.Metabolic depression：a historical perspective［J］.Prog Mol Subcell Biol，2010，49：1－23.

［26］Yang H S，Zhou Y，Zhang T，et al.Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus（Selenka）during aestivation［J］.Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，2006，330（2）：505－510.

［27］Fangyu W，Yang Y H，Xiaoyu W，et al.Antioxidant enzymes in sea cucumber Apostichopus japonicus （Selenka）during aestivation［J］.Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom，2011，91（1）：209－214.

［28］Choe S.Study of sea cucumber：morphology，ecology and propagation of sea cucumber［M］.Tokyo，Japan：Kaibundou Publisher，1963.

［29］李馥馨，劉永宏，宋本祥，等.海參（Apostichopus japonicus Selenka）夏眠習性研究II.夏眠致因的探討 ［J］.中國水產科學，1996，3（2）：49－57.

［30］袁秀堂.刺參生理生態(tài)學及其生物修復作用的研究［D］.青島：中國科學院海洋研究所，2005.

［31］李霞，王霞.仿刺參在實驗性夏眠過程中消化道和呼吸樹的組織學變化［J］.大連水產學院學報，2007，22（2）：82－85.

［32］蘇琳，陳慕雁，王天明，等.刺參夏眠不同時期劃分以及前腸各組織層厚度定量分析［J］.海洋科學，2012，12：1－5.

［33］Kostenko S，Jensen K L，Moens U.Phosphorylation of heat shock protein 40（Hsp40／DnaJB1）by mitogen－activated protein kinase－activated protein kinase 5 （MK5／PRAK）［J］.The International Journal of Biochemistry＆ Cell Biology，2014，47：29－37.

［34］EllisR J.Stress proteins as molecular chaperones［M］.New York，USA：Marcel Dekker，1996.

［35］Somero G N.Thermal physiology and vertical zonation of intertidal animals：optima，limits，and costs of living［J］.Integrative and Comparative Biology，2002，42：780－789.

［36］Selvakumar S，Geraldine P.Heat shock protein induction in the freshwater prawn Macrobrachium malcolmsonii：acclimation－influenced variations in the induction temperatures for Hsp70［J］.Comparative Biochemical Physiology，2005，140A：209－215.