紫杉醇與人血清白蛋白的相互作用

楊少梅，侯 瑾，黃志寧，李福男

（廈門(mén)大學(xué)藥學(xué)院，福建 廈門(mén)361102）

紫杉醇（Paclitaxel）又名泰素，最早由 Monroe E Wall和 Mansukh C Wani從太平洋紅豆杉（Taxusbrevifolia）的樹(shù)皮中分離得到，并命名為紫杉醇［1］.紫杉醇具有獨(dú)特的作用機(jī)制，研究報(bào)道指出其能誘導(dǎo)與促進(jìn)微管蛋白聚合、微管裝配與微管穩(wěn)定，抑制細(xì)胞有絲分裂，從而阻止腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［2］.臨床數(shù)據(jù)表明，紫杉醇對(duì)乳腺癌、卵巢癌、肺癌等有良好的療效.對(duì)其藥物機(jī)理的研究一直是該藥的研究熱點(diǎn)之一［3］.

人血清白蛋白（HSA）是血漿中含量最豐富的重要載體蛋白，具有儲(chǔ)運(yùn)內(nèi)源性代謝產(chǎn)物和外源性藥物小分子（離子）等重要生理功能，參與許多重要的生命過(guò)程［4］.藥物進(jìn)入血液后，先和 HSA結(jié)合成復(fù)合物（可逆），然后再被運(yùn)輸?shù)綑C(jī)體的各個(gè)部位進(jìn)行釋放.因此研究HSA與藥物的結(jié)合具有多重的理論和現(xiàn)實(shí)意義.

本研究采用等溫滴定量熱法對(duì)紫杉醇分子與HSA間的相互作用進(jìn)行了研究，對(duì)傳統(tǒng)的光譜學(xué)研究是一種補(bǔ)充，同時(shí)也取得了一些有意義的結(jié)果.測(cè)定物質(zhì)相互作用焓變和熵變，可從原子和基團(tuán)的性質(zhì)、取向、位置和距離的變化等更加微觀的層面上理解對(duì)其與HSA相互作用的規(guī)律，能夠系統(tǒng)地研究紫杉醇分子在血液中的運(yùn)輸與傳遞等與HSA的相互作用.配體的熱力學(xué)特征與配體－蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)特征相結(jié)合，深入揭示配體－受體的結(jié)合本質(zhì)，對(duì)開(kāi)發(fā)安全高效的抗腫瘤藥物作用提供分子機(jī)制的理論支持.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Cary eclipse型熒光分光光度計(jì)（Varian，USA），Cary 50－bio型 紫 外－可 見(jiàn) 分 光 光 度 計(jì) （Varian，Australia），ITC 200型等溫滴定量熱儀（GE，USA），ICM 3.3－04a（Molsoft，USA），Millipore超純水系統(tǒng)（Millipore）.紫杉醇（Sigma，USA），HSA （Sigma，USA）.

1.2 方 法

1.2.1 熒光光譜實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)從3個(gè)溫度（293，303和310K）考察紫杉醇對(duì)HSA的熒光猝滅.HSA濃度為5μmol／L（溶于1 mol／L的pH為7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）中）.紫杉醇溶于二甲基亞砜（DMSO）中，使用時(shí)用PBS稀釋至終濃度5mmol／L，以含等量的DMSO的PBS作為陰性對(duì)照.實(shí)驗(yàn)激發(fā)波長(zhǎng)為285nm，狹縫寬度為5nm.

1.2.2 紫外－可見(jiàn)吸收光譜實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)于303K下進(jìn)行，HSA濃度為1μmol／L（溶于1mol／L的pH 為7.4的PBS中）.紫杉醇溶于DMSO中，使用時(shí)用PBS稀釋至終濃度1mmol／L，以含等量的DMSO的PBS作為陰性對(duì)照.掃描范圍250～300nm.

1.2.3 等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)

等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)在ITC200型等溫滴定量熱儀上進(jìn)行.設(shè)定起始補(bǔ)償功率（DP）值為5.將50μmol／L HSA（溶于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%DMSO的PBS中）溶液注入200μL的量熱池，紫杉醇溶于1mol／L的PBS（5%DMSO，pH 7.4）中，滴定濃度為5mmol／L.反應(yīng)維持溫度在303K，控制攪拌速率為1 000r／min，間隔時(shí)間120s，每次的滴定體積為2μL，分20次完成，基線穩(wěn)定后啟動(dòng)實(shí)驗(yàn).以等濃度的紫杉醇滴定200μL的1 mol／L的PBS（5%DMSO，pH 7.4）作為扣除紫杉醇的稀釋熱的空白對(duì)照.

1.2.4 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)

紫杉醇與 HSA的結(jié)合作用在 Molsoft ICM3.3－04a軟件進(jìn)行模擬.選擇蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中HSA的晶體結(jié)構(gòu)（ID 4IW1）作為對(duì)接模型，運(yùn)用ICM3.3－04a進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換和構(gòu)象調(diào)整，并由Icmpocketfinder自動(dòng)產(chǎn)生結(jié)合位點(diǎn).通過(guò)Refine程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)與紫杉醇對(duì)接結(jié)構(gòu)進(jìn)行柔性處理后進(jìn)行對(duì)接實(shí)驗(yàn).

2 結(jié)果與討論

2.1 紫杉醇與HSA相互作用的熒光光譜

2.1.1 熒光猝滅機(jī)制

由于HSA分子中存在色氨酸和酪氨酸2個(gè)生色基團(tuán)，因此使其具有內(nèi)源熒光的特性［5］.本文以285 nm的激發(fā)光為激發(fā)波長(zhǎng)，在290～500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定HSA溶液的熒光發(fā)射光譜.結(jié)果表明，在高能量激發(fā)光作用下，HSA在340nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)了熒光（圖1（a））.從圖1（a）可以看出，HSA 濃度保持不變，其內(nèi)源性熒光隨著紫杉醇濃度的增加逐步猝滅，說(shuō)明紫杉醇改變了HSA的微環(huán)境，提示二者可能發(fā)生相互作用［6］.

熒光猝滅過(guò)程通常分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩類.動(dòng)態(tài)猝滅是由猝滅劑和熒光物質(zhì)之間發(fā)生相互碰撞而引起，而靜態(tài)猝滅則是猝滅劑和熒光物質(zhì)形成了穩(wěn)定的復(fù)合物而引起的猝滅［7］.對(duì)于純動(dòng)態(tài)或者純靜態(tài)猝滅，其作用過(guò)程均遵循方程（1）［8］：

式中，F(xiàn)0是HSA溶液的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)是加入紫杉醇后HSA溶液的熒光強(qiáng)度，cQ是體系中紫杉醇的總濃度，KSV是Stern－Volmer猝滅常數(shù)，且由下式定義：

式中，Kq是由擴(kuò)散過(guò)程控制的碰撞動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)［L／（mol·s）］，τ0生物大分子內(nèi)源性熒光壽命值為10－8s［9］.本文在不同溫度下（293，303，310K），根據(jù)式（1）以F0／F對(duì)cQ的關(guān)系作圖（圖1（b））.結(jié)果顯示，Stern－Volmer曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，且隨著溫度升高曲線斜率逐漸降低，表明動(dòng)態(tài)碰撞不是引起HSA熒光猝滅的主要原因，而是由于藥物和蛋白形成了復(fù)合物，從而引起的靜態(tài)猝滅［10］.經(jīng)式（1）擬合計(jì)算得出，猝滅常數(shù) Ksv分別為15.1×103，13.6×103和11.8×103L／mol.由式（2）進(jìn)一步得到碰撞動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)Kq分別為15.1×1011，13.6×1011和11.8×1011L／（mol·s），由于各類猝滅劑對(duì)生物大分子最大擴(kuò)散控制的碰撞動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)為2.0×1010L／（mol·s），進(jìn)一步說(shuō)明紫杉醇對(duì)HSA的熒光猝滅是由于形成復(fù)合物引起的靜態(tài)猝滅［11］.

圖1 紫杉醇與HAS熒光測(cè)定結(jié)果Fig.1 The fluorescence result of HSA and Paclitaxel

2.1.2 紫杉醇與HSA的結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

設(shè)紫杉醇與HSA形成n個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的復(fù)合物，由Lineweaver－Burk公式（3）可獲得 KA和n［12－13］：

圖2 紫杉醇與HSA結(jié)合的Lineweaver－Burk線性圖Fig.2 Lineweaver－Burk plot for the binding of Paclitaxel with HSA

2.2 紫杉醇與HSA相互作用的熱力學(xué)分析

2.2.1 紫杉醇與HSA作用力類型的判斷

猝滅體和生物大分子的相互作用力主要有氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水力［14］.當(dāng)溫度相差不大時(shí)，可以把反應(yīng)焓變看成一個(gè)常數(shù)，兩物質(zhì)間相互作用的熱力學(xué)參數(shù)符合下列關(guān)系［15］：

其KA為不同溫度下對(duì)應(yīng)的結(jié)合常數(shù)，與為焓變與熵變，為吉布斯自由能，是判斷一個(gè)反應(yīng)是否能自發(fā)進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn).R是熱力學(xué)氣體常數(shù)，取值為8.314（mol·K）／J，T 是熱力學(xué)溫度.通過(guò)式（4）和（5）可以求出熱力學(xué)常數(shù)的變化，結(jié)果見(jiàn)表1.

2.2.2 等溫滴定量熱法檢測(cè)HSA與紫杉醇的相互作用

大分子與小分子間的相互作用常伴隨著一個(gè)能量的改變.由于小分子的加入，大分子在溶液中微環(huán)境的改變，原有的各種化學(xué)鍵被破壞，小分子與大分子間重新形成新的化學(xué)鍵，因此會(huì)產(chǎn)生一個(gè)吸熱或者放熱的效應(yīng).本文以測(cè)定注入紫杉醇后含HSA的樣品池所釋放或吸收的熱量為基礎(chǔ)，獲得兩物質(zhì)相互作用的熱力學(xué)參數(shù).如圖3所示，紫杉醇與HSA反應(yīng)屬于放熱反應(yīng)，隨著紫杉醇濃度的逐漸增大，二者之間的結(jié)合呈現(xiàn)一個(gè)飽和的趨勢(shì).

對(duì)于藥物配體（紫杉醇）與蛋白質(zhì)（HSA）的結(jié)合過(guò)程，其基本假設(shè)為一個(gè)蛋白質(zhì)分子可有：1）i類結(jié)合位點(diǎn)，它們可結(jié)合相同的配體，同類中的所有位點(diǎn)在熱力學(xué)意義上是相同的；2）i類結(jié)合位點(diǎn)相互獨(dú)立，即蛋白質(zhì)分子的每一類受體位點(diǎn)與藥物配體的結(jié)合率彼此互不依賴.基于上述假設(shè)和Langmuir結(jié)合理論有［17－18］：

式中cL，0和cP，0分別為藥物配體紫杉醇和HSA的初始濃度，cL是結(jié)合過(guò)程達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)藥物配體的游離濃度，θi、Ki和Ni分別是第i類結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合率、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù).將式（6）代入式（7）可得公式（8）：

表1 HSA與紫杉醇相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Tab.1 The thermodynamic parameters for the interaction between Paclitaxel and HSA

圖3 紫杉醇與HSA等溫滴定結(jié)果Fig.3 The isothermal titration result of HSA and Paclitaxel

等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)中第j次注射所得到的熱量（Qj）可表示為：

式中，Vcell是反應(yīng)池中被滴定劑的體積，Δθi是從第（j－1）次滴定到第j次滴定第i類結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合率的變化是第i類位點(diǎn)的結(jié)合焓，也就是每摩爾的藥物分子與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)焓的變化.cL，0和cP，0是已知量并且Qj可以通過(guò)量熱實(shí)驗(yàn)得到.事實(shí)上，Qj是關(guān)于Ni，Ki和的函數(shù).基于上述理論，假設(shè)HSA與紫杉醇的結(jié)合位點(diǎn)為1，利用ITC200自帶的origin7.0軟件的one bindsite模式以紫杉醇與HSA物質(zhì)的量濃度比為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)反應(yīng)放熱量為縱坐標(biāo)作圖，進(jìn)行非線性最小方差擬合，如圖3（b）所示，可以得到紫杉醇與HSA之間相互作用的熱力學(xué)參數(shù).經(jīng)擬合，確定二者間結(jié)合常數(shù)Ki為8.8×103L／mol，焓變?yōu)?－99.1kJ／mol，熵 變?yōu)?－183.6 J／（mol·K），吉布斯自由能為－43.5kJ／mol，與熒光光譜分析結(jié)果基本一致.

2.3 紫杉醇與HSA相互作用的紫外－可見(jiàn)吸收光譜

動(dòng)態(tài)猝滅僅影響熒光體的激發(fā)態(tài)，卻不影響熒光體的吸收光譜，而基態(tài)配合物的形成則會(huì)引起熒光體的吸收光譜的變化.本實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了HSA、HSA與紫杉醇混合溶液（以相應(yīng)的紫杉醇為空白）的紫外吸收光譜 （圖4－a，b，c，d，e，f）.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：HSA 在278nm處有一吸收峰，一般認(rèn)為278nm處的吸收主要來(lái)源于芳香族氨基酸色氨酸，酪氨酸以及苯丙氨酸.加入紫杉醇后，HSA在250～300nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸光度增大，說(shuō)明HSA與紫杉醇確實(shí)有結(jié)合.

圖4 溫度為303K時(shí)紫杉醇對(duì)HSA紫外吸收光譜的影響Fig.4 The ultraviolet absorption spectra of HSA which caused by Paclitaxel at 303K

由圖4可以看出，紫杉醇的加入使HSA在278 nm波長(zhǎng)處的吸收峰強(qiáng)度升高，峰的位置稍微藍(lán)移，這說(shuō)明紫杉醇與HSA基態(tài)分子發(fā)生了相互作用，形成了基態(tài)配合物，從而引起了HSA紫外吸收光譜的變化.動(dòng)態(tài)猝滅只影響熒光分子的激發(fā)態(tài)，并不改變熒光物質(zhì)的吸收光譜，因此可以進(jìn)一步說(shuō)明紫杉醇對(duì)HSA的熒光猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅.

2.4 紫杉醇與HSA之間的距離

根據(jù)Fǒrster提出的偶極－偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論，當(dāng)2種化合物分子滿足以下條件將會(huì)發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象［19－20］：1）供體能發(fā)熒光；2）供體的熒光發(fā)射光譜與受體的紫外－可見(jiàn)吸收光譜有足夠重疊；3）供體與受體足夠接近，最大距離不超過(guò)7 nm.HSA有很強(qiáng)的熒光，觀察紫杉醇的紫外－可見(jiàn)吸收光譜，發(fā)現(xiàn)其與HSA的熒光光譜有著較大程度的重疊.HSA的熒光光譜和紫杉醇的紫外－可見(jiàn)吸收光譜見(jiàn)圖5.

圖5 HSA熒光發(fā)射光譜（a）與紫杉醇紫外－可見(jiàn)吸收光譜（b）的重疊圖Fig.5 The overlap spectra of the fluorescence emission spectrum of HSA （a）and the absorbance spectrum of Paclitaxel（b）

供體分子與受體分子發(fā)生能量轉(zhuǎn)移時(shí)，非輻射能量轉(zhuǎn)移效率E、供體與受體間距離r及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0有如下關(guān)系［21］：

式中，F(xiàn)0為熒光發(fā)射體的初始熒光強(qiáng)度；F為當(dāng)微環(huán)境中受體分子濃度與熒光發(fā)射體濃度相等時(shí)熒光發(fā)射體的熒光強(qiáng)度；k2為偶極空間取向因子，平均值為2／3；N為介質(zhì)折射常數(shù)，值為1.366；Φ 為 HSA的熒光量子產(chǎn)率，通常取蛋白質(zhì)中色氨酸的量子產(chǎn)率0.15；J為供體熒光發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊區(qū)域，其積分公式為：

式中，F(xiàn)（λ）和ε（λ）分別代表在波長(zhǎng)λ處 HSA的熒光強(qiáng)度和紫杉醇的摩爾吸光系數(shù).當(dāng)二者濃度均為5 μmol／L時(shí)（圖5），重疊面積J可由式（13）計(jì)算得到，值為1.413（cm3·L）／mol.經(jīng)計(jì)算得出在溫度為303 K時(shí)，供體分子（HSA）與受體分子（紫杉醇）的熒光共振能量轉(zhuǎn)移的效率E為4.5%，二者間的作用距離r為3.1nm.

2.5 紫杉醇與HSA的分子對(duì)接

運(yùn)用ICM3.3－04a軟件進(jìn)行HSA蛋白的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換和加氫處理，由Icmpocketfinder自動(dòng)產(chǎn)生一個(gè)半徑約為8nm的結(jié)合口袋，其兩側(cè)主要由α－螺旋和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)圍成，該口袋即為紫杉醇與其的結(jié)合位點(diǎn)（圖6（a））.

如圖6（b）所示，疏水性氨基酸殘基（如L115，V186，F(xiàn)509以及L529等）組成疏水核心，而E17，K195，R212，D340，R222及K436等則位于親水表面.分子對(duì)接結(jié)果表明，紫杉醇通過(guò)與K58，K195，R222及K436殘基之間的氫鍵等作用力結(jié)合在HSA的結(jié)合口袋中，氫鍵和范德華力是二者間結(jié)合的主要結(jié)合作用力，該結(jié)果與熒光光譜和等溫滴定量熱法所推斷的結(jié)果相一致.

3 結(jié) 論

圖6 HSA與紫杉醇的對(duì)接結(jié)果Fig.6 Docking result of Paclitaxel with HSA

本實(shí)驗(yàn)采用光譜法及等溫滴定量熱法研究了模擬生理?xiàng)l件下紫杉醇與HSA的相互作用.結(jié)果表明，靜態(tài)猝滅是導(dǎo)致紫杉醇對(duì)HSA熒光猝滅的主要原因.根據(jù)Fǒrster提出的偶極－偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論得出紫杉醇與HSA二者間的相互作用距離是3.1 nm，該作用距離表明了HSA與紫杉醇之間可發(fā)生非輻射能量轉(zhuǎn)移，其熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率為4.5%.由不同溫度的熒光實(shí)驗(yàn)得到二者間反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)可知，紫杉醇與HSA間的反應(yīng)是熵驅(qū)動(dòng)下自發(fā)進(jìn)行（＜0）的反應(yīng)，二者間的作用力以氫鍵和范德華力為主＜0，＜0）.等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了熒光光譜實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證明了紫杉醇與HSA相互作用屬于自發(fā)進(jìn)行的放熱反應(yīng).紫杉醇與HSA二者在303K時(shí)的結(jié)合常數(shù)僅為10.7×103L／mol（熒光結(jié)果）和8.8×103L／mol（等溫滴定量熱結(jié)果），遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于配體與受體之間特異性結(jié)合的結(jié)合常數(shù)（107～1014L／mol），說(shuō)明二者的結(jié)合屬于非特異性結(jié)合.二者間較弱的相互作用有利于紫杉醇在血液中的運(yùn)輸及達(dá)到靶蛋白后的交換結(jié)合.

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