螺旋藻藻藍(lán)蛋白萃取條件的響應(yīng)曲面優(yōu)化

金怡雯，謝友坪，吳意珣，盧英華，敬科舉

（廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門361005）

螺旋藻（Spirulina platensis）是一種生長(zhǎng)在熱帶及亞熱帶堿性湖泊中的微藻類植物，富含各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及活性成分［1］，被聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織稱之為“21世紀(jì)人類最理想的天然保健食品”［2］.螺旋藻屬藍(lán)藻門（Cyomophyta）顫藻科（Oscilatoriaceae），又稱藍(lán)細(xì)菌，具有蛋白含量高、繁殖快等特點(diǎn)，藻粉中藻藍(lán)蛋白含量高達(dá)20%［3］.

藻藍(lán)蛋白是由脫輔基蛋白與藻藍(lán)膽素（開鏈線性四吡咯）共價(jià)結(jié)合而成，其基本結(jié)構(gòu)由α亞基（17 000u）和β亞基（19 500u）構(gòu)成單聚體（αβ），然后單聚體間通過(guò)連接肽構(gòu)成三聚體（αβ）3或者六聚體（αβ）6［4－5］.大量實(shí)驗(yàn)表明，螺旋藻藻藍(lán)蛋白具有提高人體免疫力［6］、促進(jìn)動(dòng)物血細(xì)胞再生［7］、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)［8］等作用，同時(shí)在抗輻射、抗疲勞、清除自由基［9］等方面也具有一定的生理活性.目前國(guó)內(nèi)外對(duì)藻藍(lán)蛋白提取過(guò)程中細(xì)胞破碎方法主要有：化學(xué)試劑處理法、溶脹法、凍融法和超聲波法，其中凍融法和超聲法效果較好［10］.而Chen等［11］使用直接的滲透壓法也得到了較高的藻藍(lán)蛋白得率，且此法與其他方法相比操作簡(jiǎn)單快捷.諸多因素影響螺旋藻藻藍(lán)蛋白的萃取效果，其中質(zhì)量濃度、萃取時(shí)間和萃取溫度對(duì)藻藍(lán)蛋白的萃取效果影響較為顯著［12］.本文對(duì)這3個(gè)因素進(jìn)行考察，用響應(yīng)曲面（response surface methodolo－gy，RSM）模型設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)螺旋藻藻藍(lán)蛋白萃取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到藻藍(lán)蛋白的最佳萃取條件.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藻株：螺旋藻（FACHB－314），購(gòu)自中科院武漢水生生物研究所.

螺旋藻粉，本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的螺旋藻體冷凍干燥所得；所有化學(xué)試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為去離子水.

FD－1000冷凍干燥機(jī)，上海愛朗儀器有限公司；JA403電子天平，上海?？惦娮觾x器廠；SKY－200B搖床，SUKUN；D－78532臺(tái)式冷凍離心機(jī)，ZENTRIFUGEN；UV－1800紫外可見分光光度計(jì)，SHIMADZU CORPORATION.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取與分析

取2～10mg／mL的螺旋藻粉，加入10mL磷酸鹽緩沖液（0.15mol／L，pH 值7.0），混勻后在某一固定溫度下靜置12～60h，離心（10 370 g，5min）后得到清透的藍(lán)色上清液，在620與652nm處測(cè)定液體的吸光度，根據(jù)下式［13］計(jì)算藻藍(lán)蛋白的濃度：

式中，ρ（C－PC），藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度（g／L）；A620，樣品在620nm處的吸光值；A652，樣品在652nm處的吸光值.

根據(jù)下式計(jì)算藻體中藻藍(lán)蛋白得率：

式中，Y，藻藍(lán)蛋白得率（%）；V，磷酸鹽緩沖液體積（L）；M，螺旋藻粉質(zhì)量（g）.

1.2.2 單因素試驗(yàn)

1）萃取時(shí)間對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響

在溫度為25℃，螺旋藻粉質(zhì)量濃度為6mg／mL的條件下研究不同萃取時(shí)間對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響.如圖1（a）所示，在萃取時(shí)間從12h增加到60h的過(guò)程中，藻藍(lán)蛋白得率先上升后下降.當(dāng)萃取時(shí)間為36 h的時(shí)候，藻藍(lán)蛋白得率達(dá)到最高值.隨著萃取時(shí)間的增加，螺旋藻細(xì)胞逐漸破碎釋放出自身的藻藍(lán)蛋白，所以其得率逐漸增加；當(dāng)達(dá)到一定的值后，再延長(zhǎng)萃取時(shí)間，藻藍(lán)蛋白得率反而有所下降，這可能是因?yàn)殡S著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，藻藍(lán)蛋白全部釋放出來(lái)之后發(fā)生一定程度上的自我降解.因此，選用36h作為藻藍(lán)蛋白萃取時(shí)間的最優(yōu)值做進(jìn)一步優(yōu)化.

2）萃取溫度對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響

在萃取時(shí)間為36h，螺旋藻粉質(zhì)量濃度為6mg／mL的條件下研究不同萃取溫度對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響.如圖1（b）所示，萃取溫度在一定的范圍內(nèi)（13～37℃）呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在25℃時(shí)藻藍(lán)蛋白得率最高，達(dá)到13.37%.在萃取溫度從13℃升高到25℃的過(guò)程中，藻藍(lán)蛋白得率迅速上升，而超過(guò)25℃以后，變化不明顯甚至有略微下降.故選擇25℃為藻藍(lán)蛋白萃取的最佳溫度點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化.

3）質(zhì)量濃度對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響

在萃取時(shí)間為36h，萃取溫度為25℃的條件下研究不同螺旋藻粉質(zhì)量濃度對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響.如圖1（c）所示，在螺旋藻粉質(zhì)量濃度從2mg／mL增加到10mg／mL的過(guò)程中，藻藍(lán)蛋白得率變化較小，略微呈現(xiàn)少許的下降趨勢(shì)，這說(shuō)明螺旋藻粉自身的質(zhì)量濃度可能相對(duì)于其他因素而言，對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響較小.

1.2.3 RSM 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用三因素的Box－Behnken設(shè)計(jì)（BBD）優(yōu)化萃取工藝參數(shù)，以質(zhì)量濃度、萃取時(shí)間和萃取溫度3個(gè)因素為自變量，藻藍(lán)蛋白得率為響應(yīng)值設(shè)計(jì)三因素三水平的RSM試驗(yàn).根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，規(guī)定了3個(gè)因素的變動(dòng)范圍及中心點(diǎn)值（表1）.BBD有17個(gè)析因點(diǎn)，其中有5個(gè)重復(fù)的中心點(diǎn)（表2），采用Design Expert軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).

表1 Box－Behnken設(shè)計(jì)的因素與水平Tab.1 Factors and levels of Box－Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用Design Expert軟件對(duì)表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到藻藍(lán)蛋白得率對(duì)3個(gè)因素的多元二次回歸模型：

2.2 RSM結(jié)果分析

從二次響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果可知，回歸模型極顯著（p＝0.000 6＜0.01）、失擬項(xiàng)不顯著（p＝0.135 2＞0.05）、R2＝0.955 0、＝0.897 1、CV＝4.37，這些數(shù)據(jù)表明回歸方程擬合度和可信度均很高，能很好地對(duì)最優(yōu)工藝條件進(jìn)行預(yù)測(cè).

圖1 萃取時(shí)間（a）、萃取溫度（b）、質(zhì)量濃度（c）對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響Fig.1 Effect of different extraction time（a），extraction temperature（b），solid－to－liquid ratio（c）on extraction yield

表2 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of Box－Behnken design

由回歸方程系數(shù)顯著性檢測(cè)結(jié)果可知，試驗(yàn)中一次項(xiàng) A 極 顯 著 （p 值 ＜0.01），B、C 顯 著 （p 值 ＜0.05）；二次項(xiàng)A2不顯著，B2、C2極顯著；交互項(xiàng)AB、AC不顯著，BC極顯著.

2.3 各因素之間的交互作用

根據(jù)Box－Behnken試驗(yàn)結(jié)果做RSM圖，考察擬合的RSM的形狀，分析螺旋藻粉質(zhì)量濃度、萃取時(shí)間、萃取溫度三者之間交互作用對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響，其RSM和等高線如圖2～4所示.各因素及交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響結(jié)果以圖2～4直觀地反映出來(lái).

圖2 質(zhì)量濃度與萃取時(shí)間對(duì)藻藍(lán)蛋白得率影響的RSM（a）及等高線（b）Fig.2 Response surface（a）and contour line（b）of interaction effect of solid－to－liquid ratio and extraction time on C－PC extraction yieid

從RSM中可以看出，萃取時(shí)間和萃取溫度之間的交互作用對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響最為顯著，在姚毅等［14］、佟萬(wàn)兵等［15］和孫長(zhǎng)霞等［16］的研究結(jié)果中，萃取時(shí)間和萃取溫度之間的交互作用對(duì)所萃取物質(zhì)得率的影響也很顯著.從圖4可以看出，一定范圍內(nèi)，藻藍(lán)蛋白得率隨萃取時(shí)間和萃取溫度的增加而提高，兩者交互作用顯著.根據(jù)動(dòng)力學(xué)理論，時(shí)間的延長(zhǎng)有利于藻藍(lán)蛋白的充分?jǐn)U散析出，同時(shí)溫度的提高使得分子解附和擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)速率加快、水溶液黏度和傳質(zhì)阻力降低以及化合物之間的結(jié)合削弱，從而增加了藻藍(lán)蛋白的析出速率及其得率.因此，適當(dāng)增加萃取時(shí)間和萃取溫度有助于提高藻藍(lán)蛋白的得率.

另外，從圖3可以看出，質(zhì)量濃度和萃取溫度之間的交互作用對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響次之.質(zhì)量濃度不變萃取溫度增加，藻藍(lán)蛋白得率逐漸增大到最大值然后下降；而萃取溫度不變質(zhì)量濃度增加，藻藍(lán)蛋白得率呈現(xiàn)略微下降的趨勢(shì)，這和之前單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析相吻合.Chaiklahan等［17］的研究表明，在螺旋藻多糖的萃取過(guò)程中質(zhì)量濃度越低多糖析出效果越好，因?yàn)楦叩暮坑欣诙嗵堑姆稚ⅲ龠M(jìn)多糖離開固體顆粒表面，同時(shí)增強(qiáng)了溶劑擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，因此提高了萃取效率，這和本文中藻藍(lán)蛋白得率隨質(zhì)量濃度增加而略微下降的結(jié)果相似.質(zhì)量濃度的增加并未取得更好的萃取效果，也可能是由于在萃取溶液中溶質(zhì)已達(dá)到完全飽和［18］.

2.4 優(yōu)化工藝結(jié)果

利用Design Expert軟件對(duì)模型方程求解，對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo)并使之等于0，解得A＝2.996，B＝－0.034，C＝1.716，為曲面最大點(diǎn)，所對(duì)應(yīng)各因子的量分別為螺旋藻粉質(zhì)量濃度2.00mg／mL，萃取時(shí)間37.14h，萃取溫度25.61℃，此條件下藻藍(lán)蛋白得率Y理論值為13.72%.

圖3 質(zhì)量濃度與萃取溫度對(duì)藻藍(lán)蛋白得率影響的響應(yīng)面（a）及等高線（b）Fig.3 Response surface（a）and contour line（b）of interaction effect of solid－to－liquid ratio and extraction temperature on C－PC extraction yieid

圖4 萃取時(shí)間與萃取溫度對(duì)藻藍(lán)蛋白得率影響的響應(yīng)面（a）及等高線（b）Fig.4 Response surface（a）and contour line（b）of interaction effect of extraction time and extraction temperature on C－PC extraction yieid

按照模型預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件，根據(jù)實(shí)際情況，在螺旋藻粉質(zhì)量濃度為2.0mg／mL、萃取時(shí)間為37.1h、萃取溫度為25.6℃的工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，得到的藻藍(lán)蛋白得率（13.66±0.87）% （n＝3）和預(yù)測(cè)值吻合較好，表明該模型工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際情況.

相關(guān)研究表明，超聲波提取法藻藍(lán)蛋白得率為10.76%，凍融法藻藍(lán)蛋白得率為7.89%，以及恒溫浸提法藻藍(lán)蛋白得率為6.57%［12］.而采用本文優(yōu)化之后的直接滲透壓法藻藍(lán)蛋白得率可達(dá)到13.66%，該值要明顯高于文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果.另外，優(yōu)化之前的萃取工藝條件為：質(zhì)量濃度10.0mg／mL、萃取時(shí)間21h和萃取溫度4℃，在此條件下萃取得到的藻藍(lán)蛋白得率為10.29%.與之相比較，萃取工藝條件優(yōu)化后其藻藍(lán)蛋白含量提高了32.8%.雖然萃取時(shí)間較長(zhǎng)，但萃取溫度更接近室溫，因此降低了能耗，更節(jié)約成本.

3 結(jié) 論

1）在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取質(zhì)量濃度、萃取時(shí)間和萃取溫度3個(gè)因素進(jìn)行RSM的Box－Behnken設(shè)計(jì)，采用Design Expert軟件進(jìn)行回歸擬合，建立藻藍(lán)蛋白得率工藝數(shù)學(xué)模型：Y＝12.74－1.36A＋0.44B＋0.59C ＋0.26AB ＋0.44AC －1.25BC －0.40A2－1.24B2－0.88C2.回歸分析表明，該模型的穩(wěn)定性較好；通過(guò)模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，萃取時(shí)間和萃取溫度的交互作用對(duì)藻藍(lán)蛋白得率的影響最為顯著.

2）由RSM試驗(yàn)，優(yōu)化了螺旋藻藻藍(lán)蛋白的萃取工藝，分析結(jié)果得到萃取的最佳工藝條件為：質(zhì)量濃度2.0mg／mL、萃取時(shí)間37.14h和萃取溫度25.61℃.在此條件下藻藍(lán)蛋白得率可達(dá)到13.66%，較優(yōu)化前提高了32.8%.

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