利用正交設(shè)計優(yōu)選NR2A的Western Blot成像條件

高嵐岳，苑 潔，姜 泓

（中國醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧 沈陽 110001）

Western Blot中文稱為蛋白質(zhì)印跡法，是蛋白質(zhì)分析的最流行的技術(shù)之一，現(xiàn)己廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等方面.Western Blot測定結(jié)果采用目的蛋白的灰度值計算法，在自動曝光成像過程中，常由于背景干擾大的原因，而出現(xiàn)測量結(jié)果不準(zhǔn)確及測定結(jié)果重現(xiàn)性差等問題.為保證良好的成像質(zhì)量及準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性好的條帶灰度值，有必要對成像條件進行優(yōu)化，以確保Western Blot結(jié)果的準(zhǔn)確性.

NR2A是興奮性氨基酸谷氨酸的特異性受體（NMDA受體）的調(diào)節(jié)亞單位之一，具有調(diào)制突觸傳遞、觸發(fā)突觸可塑性以及參與學(xué)習(xí)與記憶等重要的生理功能［1-2］.在前期研究中，作者通過調(diào)整蛋白上樣量、電泳和轉(zhuǎn)膜條件、封閉時間、一抗和二抗稀釋倍數(shù)用以增強雜交信號、降低背景.但采用自動曝光的凝膠成像系統(tǒng)，NR2A成像結(jié)果仍然不理想，所以本研究采用手動曝光的凝膠成像系統(tǒng)，以雙指標(biāo)（條帶灰度值和背景灰度值）進行綜合評價優(yōu)化NR2A的成像條件，以期得到理想的成像結(jié)果.

本研究以NR2A為切入點，研究其最佳成像條件，采用正交實驗法，對影響條帶灰度值和背景灰度值的因素如光圈（A）、焦距（B）、曝光時間（C）等進行考查；探討NR2A的Western Blot最佳手動成像條件，以期為采用該技術(shù)的應(yīng)用提供依據(jù).

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

BCA試劑盒（全士金公司）、山羊抗NR2A抗體（SANTA公司）、山羊抗β-actin抗體（SANTA公司）、ECL顯影試劑盒（全士金公司）.

超聲波細胞粉碎機（寧波科生儀器廠）、3K18型超速低溫離心機（美國Sigma公司）、水平及垂直搖床（海門市麒麟醫(yī)用儀器廠）、蛋白質(zhì)電泳裝置（TANON公司）、蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印裝置（TANON公司）、Gel Logic 2200型成像系統(tǒng)（KODAK公司）、Gel-Pro analyzer4圖像分析軟件.

1.2 組織蛋白的提取及濃度測定

取50mg大鼠腦海馬置于2mL EP管中，用干凈的剪刀將組織塊剪碎，加入450μL細胞裂解液進行裂解，然后置于冰上；用超聲波細胞粉碎機超聲60s后再置于冰上，重復(fù)3次使細胞破碎；4℃下12 000r/min離心15min×2次，取上清液，分裝于新離心管中；采用BCA試劑盒法測定上清液中蛋白濃度，并調(diào)整蛋白濃度至3g/L.

1.3 蛋白的分離與含量測定

采用Western Blot法進行蛋白含量分析.每孔道加15uL蛋白樣品，依次經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜（采用PVDF膜），TBS-T洗膜，脫脂奶粉封閉，TBS-T洗膜，4℃下一抗（NR2A1∶1 000，β-actin 1∶3 000）孵育過夜，TBS-T洗膜，二抗（兔抗山羊1∶3 000）孵育2h，TBS-T洗膜，ECL法顯色.用成像系統(tǒng)采集圖像，重復(fù)3次，利用圖像分析軟件測量蛋白條帶和背景的灰度值.

1.4 正交實驗優(yōu)選成像條件與實驗安排

以條帶和背景的灰度值為考查指標(biāo)，以光圈（A）、焦距（B）、曝光時間（C）作為3個因素，因素水平見表1.采用L9（34）正交設(shè)計表安排實驗.

表1 成像的因素水平Table 1 The factor level of imaging

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0軟件對所測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用正交設(shè)計方差分析進行比較，各因素內(nèi)各水平進行多重比較，檢驗水準(zhǔn)P＜0.05.

2 結(jié)果與討論

2.1 成像條件的選擇

如前所述，Western Blot是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法，用于研究目的蛋白的表達特性分析、組織定位、表達量分析及與其他蛋白的相互作用.Western Blot具有電泳技術(shù)分辨力強、免疫反應(yīng)特異性強和免疫標(biāo)記技術(shù)靈敏度高的特點，是一種便捷、可靠的實驗方法.Western Blot實驗結(jié)果要求所得圖片清晰，即雜交信號強、背景低，測定的目的蛋白灰度值準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好.在實驗過程中，除通過調(diào)整封閉時間、膜的處理、一抗和二抗稀釋倍數(shù)降低非特異性結(jié)合背景外，還需要通過調(diào)整成像效果排除背景色干擾，這是Western Blot實驗的最后、最關(guān)鍵的一步.

光圈、焦距和曝光時間是影響成像效果的三個主要因素.光圈和曝光時間調(diào)節(jié)明暗，焦距調(diào)節(jié)清晰度.光圈是用來控制光線透過鏡頭，進入機身內(nèi)感光面光量的裝置.光圈大小用F值表示，F(xiàn)值愈小，通光孔徑越大，在同一單位時間內(nèi)的進光量便越多，例如光圈從F8調(diào)整到F5.6，進光量便多一倍.此外，上一級的進光量是下一級的一倍，所以光圈F值越小，圖像越亮，反之越暗.本實驗光圈的F值范圍是1.2～16mm.前期實驗證明光圈為2～4mm時，灰度值無顯著差異（P＞0.05），所以本實驗對光圈范圍（4mm≤F≤8mm）進行研究.曝光時間是為了將光投射到照相感光材料的感光面上，快門所要打開的時間，主要指CCD成像平面的感光時間.曝光時間越長，進光量便越多，拍攝的圖像越亮，反之圖像越暗.前期實驗證明曝光時間為60～120s時，灰度值無顯著差異（P＞0.05）.考慮到工作效率問題，選定曝光時間在60s內(nèi)進行研究.焦距指平行光入射時透鏡光心到光聚集之焦點的距離，亦是從照相機鏡片中心到CCD成像平面的距離.本實驗焦距的范圍是2.5～30mm.除以上三個因素外，視場（ZOOM＝30%）、像素合并（binning＝4＊）均為固定值.

NR2A是NMDA受體的亞單位之一，在腦內(nèi)分布廣泛，以海馬、皮層和小腦最豐富，具有調(diào)制突觸傳遞、觸發(fā)突觸可塑性以及參與學(xué)習(xí)與記憶等重要的生理功能［3-4］.已有研究發(fā)現(xiàn)，在突觸后致密體（PSD）中，NMDA受體中NR2A蛋白質(zhì)C末端由于受到鈣/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）同突觸后致密體95（PSD-95）之間競爭性地結(jié)合從而影響海馬的突觸可塑性［5］.決定受體的電生理學(xué)和藥理學(xué)特性［6-7］.實驗過程中，我們采用凝膠成像系統(tǒng)自動曝光，未得到理想的NR2A成像結(jié)果，所以本研究采用具有均衡分散、綜合可比及可伸縮、效應(yīng)明確等特性的正交實驗設(shè)計法，以便最快的找到最優(yōu)的水平組合［8-9］.

2.2 正交實驗結(jié)果

目前關(guān)于Western Blot成像條件的優(yōu)化研究未見報道，本實驗以NR2A為切入點，以條帶灰度值和背景灰度值為考查指標(biāo)進行研究.按實驗部分1.2、1.3進行操作，測量條帶和背景的灰度值，并進行方差分析，結(jié)果見表2和表3.

表2 成像的因素水平L9（34）正交實驗表Table 2 L9（34）orthogonal design table for the factor level of imaging

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

從表2和表3的結(jié)果分析上可以看出，三個因素的影響大小依次為A＞C＞B，且A1＞A2＞A3，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，A因素和C因素的影響具有顯著性.綜合分析各個因素對條帶和背景灰度值的影響，確定最佳成像條件：光圈為4mm、焦距為30mm、曝光時間為60s.

2.3 驗證實驗

為了驗證所選條件的合理性，進行了三次驗證實驗，從表4結(jié)果可知，所選成像條件較穩(wěn)定，故確定最佳成像條件：光圈為4mm、焦距為30mm、曝光時間為60s.采集圖像如圖1所示.

表4 三次驗證實驗結(jié)果Table 4 Results of three verification tests

圖1 三次驗證實驗圖像Fig.1 Images of three verification tests

3 結(jié)論

采用正交設(shè)計的方法得到NR2A的Western Blot最佳成像條件：光圈為4mm、焦距為30mm、曝光時間為60s.

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