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    與抗原結合的結締組織肥大細胞促進特異性T細胞反應①

    2014-11-27 10:26:36南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院檢驗科南京210006
    中國免疫學雜志 2014年8期
    關鍵詞:肥大細胞共培養(yǎng)復合物

    湯 巧 丁 潔(南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院檢驗科,南京 210006)

    肥大細胞(Mast cells)在傳統(tǒng)意義上是參與速發(fā)型超敏反應及變態(tài)反應的關鍵效應細胞[1],表面表達 Fcγ 受體(FcγRs)和 Toll-樣受體(TLRs)等多種受體,與多種生理、病理反應有關。小鼠肥大細胞可分為黏膜肥大細胞(Mucosal mast cell,MMCs)和結締組織肥大細胞(Connective tissue mast cell,CTMCs)兩個群體[2]。所有的小鼠肥大細胞均表達抑制型受體FcγRⅡB,但僅有CTMCs表達興奮型受體FcγRⅢA。

    近年來,肥大細胞在獲得性免疫中的作用受到廣泛重視。目前觀點認為,激活的肥大細胞除了促成炎癥微環(huán)境而作用于非特異性T細胞,也通過參與抗原遞呈作用于特異性T細胞[3,4]。小鼠骨髓源性肥大細胞(BMMC)可以通過IgE受體FcεR內吞抗原,凋亡的肥大細胞被樹突狀細胞吞噬、處理,遞呈抗原多肽給表達特異性受體的T細胞[3]。我們推測肥大細胞也可通過FcγRs促進對特異性抗原的結合,進而影響特異性T細胞反應。

    CTMCs代表更成熟的肥大細胞類型,其表面平衡表達兩種FcγR。本文初步研究小鼠CTMCs通過FcγRs結合抗原、進而影響特異性T細胞反應的能力和機理,希望進一步闡明CTMCs在獲得性免疫中發(fā)揮的作用。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 C57BL/6小鼠購自Taconic Farms(Ry,Denmark)6~8周齡,OT-II.2a/Rag1(OT-II)mice(6~8周齡)來自 MIVAC breeding unit,University of Gothenburg。

    1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Sigma-Aldrich,Steinheim,Germany),小鼠干細胞因子(stem cell factor,SCF,PeproTech,Rocky Hill,NJ,USA),重組小鼠白細胞介素4(Interleukin-4,Immunotools),7-amino-actinomycinD(7-AAD;Sigma-Aldrich),PE-標記的抗小鼠 cKit(Clone 2B8;eBioscience),Alexa Fluor 647-標記的倉鼠抗小鼠 FcεRI alpha(Clone MAR-1;eBioscience,San Diego,CA,USA),F(xiàn)ITC標記的大鼠抗小鼠 FcγRⅢA(Clone 275003;mouse IgG2a,R&D Systems,Minneapolis,USA),雞卵清蛋白(Ovalbumin,OVA,Sigma-Aldrich),AlexaFluor 488-conjugated OVA(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA) ,小鼠抗 OVA IgG1(Sigma-Aldrich),PE標記的抗小鼠 CD69(Clone H1.2F3,eBioscience),PE-cy7標記的抗小鼠 CD4(Clone GK1.5,eBioscience),F(xiàn)ITC mouse anti/human Ki-67 set(BD Pharmingen)。

    1.3 細胞培養(yǎng)和分化檢測

    1.3.1 小鼠CTMCs的培養(yǎng) 取C57BL/6小鼠的股骨,用1 ml注射器抽取培養(yǎng)基將股骨腔內的骨髓細胞沖出,裂解紅細胞,直接調整細胞濃度(1×106ml-1)加入到含10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),從骨髓細胞分化CTMCs。培養(yǎng)體系含青霉素 100 U/ml、鏈霉素 100 μg/ml、4 mmol/L L-谷氨酰胺、50 μmol/L 2-巰基乙醇、1 mmol/L 丙酮酸鈉。為促進肥大細胞向CTMCs分化,50 ng/ml SCF、2 ng/ml重組小鼠IL-4作為補充成分加入體系。CTMCs培養(yǎng)6~8周,每周一次更換新鮮培養(yǎng)液。通過檢測cKit(CD117)、FcεRⅠ和 FcγRⅢA 表達而判斷CTMCs的分化。

    1.3.2 免疫復合物形成 將雞卵清蛋白OVA或AlexaFluor 488-conjugated OVA與小鼠抗OVA IgG1(Sigma-Aldrich)在37℃混勻,培養(yǎng)20 min。

    1.3.3 CTMCs與抗原抗體復合物共培養(yǎng) 在96孔培養(yǎng)板中將80 μl CTMC 與20 μl AlexaFluor 488-OVA或AlexaFluor 488-OVA/抗OVA IgG1免疫復合物混勻。OVA終濃度為130 μg/ml,IgG1終濃度為280 μg/ml。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h 后進行流式檢測。

    1.3.4 CTMCs與T細胞共培養(yǎng) 在96孔圓底培養(yǎng)板中將 80 μl CTMC 與 20 μl OVA 或 OVA/抗OVA IgG1免疫復合物混勻,OVA終濃度為130 μg/ml,IgG1 終濃度為 280 μg/ml。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。充分洗滌后,將1×105結合OVA抗原的CTMC在96孔圓底培養(yǎng)板中與4×105未分選的OT-II小鼠而來的脾臟單個核細胞共培養(yǎng),37℃孵育72 h,檢測CD4+T細胞的CD69表達。T細胞增殖用Ki-67染色。

    1.3.5 流式檢測 細胞用含1%BSA的冷PBS洗滌,與相應熒光染料4℃避光染色20 min,洗滌,檢測。Ki-67染色按試劑說明書進行,簡述如下:收集細胞懸液,用70%冰乙醇固定2 h、洗滌后再用Ki-67熒光抗體室溫30 min避光染色,洗滌,檢測。用LSR-Ⅱ(BD Biosciences,San Jose,CA) 儀器檢測熒光強度并用FlowJo軟件(FlowJo,Ashland,OR)分析,根據(jù)前向散射光(FSC)和側向散射光(SSC)以及7-AAD染色,選擇活細胞設門,然后對染色細胞作相應熒光染料的熒光強度檢測。

    2 結果

    2.1 CTMCs表面標志的檢測 小鼠骨髓源性培養(yǎng)的肥大細胞(Bone marrow-derived cultured mast cells,BMMC)經(jīng)常被用來研究肥大細胞的生物學活性。然而,在富含IL-3的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的BMMC類似 MMCs,并不表達 FcγRⅢA[5]。小鼠骨髓細胞在富含SCF和IL-4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)可得到表達FcγRⅢA 的 CTMCs[6]。已知 FcεRⅠ和 cKit雙陽性細胞為肥大細胞表面標志陽性細胞。我們選擇活細胞設門檢測其表型,發(fā)現(xiàn)95%以上的細胞表達肥大細胞特異性表面標志cKit和FcεRⅠ(圖1A)進一步檢測其FcγRⅢA的表達,發(fā)現(xiàn)熒光染色(線型曲線)后與同型對照(陰影曲線)相比較,F(xiàn)cγRⅢA峰顯著右移(圖1B)。結果表明成功誘導小鼠骨髓細胞向CTMCs分化。

    2.2 IgG促進CTMCs對特異性抗原的結合 對外來抗原進行遞呈或交叉遞呈的第一步是將其內吞入細胞進行加工處理。為了證明CTMCs可能以一種抗原依賴性方式作用于T細胞,我們檢測了CTMCs內吞抗原的能力。OVA是一種模式蛋白,我們用流式細胞術檢測CTMCs通過FcγR對OVA-488熒光蛋白的內吞作用。結果表明,將CTMCs與OVA-488/抗OVA-IgG免疫復合物孵育后,與僅僅加入OVA-488蛋白相比,可以觀察到明顯的 OVA攝取增加,熒光強度增高(圖2)。因此,IgG通過 FcγR促進CTMCs對特異性抗原的結合。

    2.3 結合了免疫復合物的CTMCs促進抗原特異性T細胞的激活 本研究中所用的OT-II.2a/Rag1(OT-II)小鼠表達 MHCⅡ類抗原限制性OVA多肽323-339特異性TCR,我們分離脾臟單個核混合細胞作為抗原特異性T細胞的來源,在混合細胞中還包含樹突狀細胞等抗原遞呈細胞。CTMCs與OVA/抗OVA-IgG免疫復合物孵育后,將CTMC充分洗滌以去除未結合的免疫復合物。通過細胞表面FcγRs結合了抗原的 CTMC與抗原特異性T細胞共同孵育3 d,以未加抗原共培養(yǎng)的CTMC作為陰性對照,抗原特異性T細胞與OVA抗原共培養(yǎng)72 h為陽性對照,可觀察到明顯的T細胞激活和增殖(圖3)。CD69是細胞表面一種磷酸化的同二聚體蛋白,是淋巴細胞早期活化標記物,在刺激物作用下會迅速表達。Ki-67是一種與細胞分裂增殖有關的核蛋白,在有絲分裂的G1中期到晚期出現(xiàn),M期到最高值。我們的結果表明,僅結合OVA的CTMC僅微弱刺激CD69和Ki-67的表達,而通過FcγRs結合 OVA/抗OVA免疫復合物的CTMC可較大程度刺激CD69和Ki-67的表達。

    圖1 FACS檢測CTMCs表面 FcγRⅠ、cKit以及 FcγRⅢA的表達Fig.1 FACS analysis of FcγRⅠ,cKit and FcγRⅢA expression on surface of cultured CTMCs

    圖2 抗原特異性IgG促進CTMCs對抗原的內吞Fig.2 Enhancement of antigen internalization by antigenspecific IgG in cultured CTMCs

    圖3 結合抗-OVA IgG/OVA復合物的CTMCs促進CD4+T細胞增殖和活化Fig.3 Anti-OVA IgG/OVA complexes-incorporated CTMCs promote proliferation and activation of CD4+T cells

    3 討論

    黏膜免疫系統(tǒng)是執(zhí)行局部免疫防御的主要場所。肥大細胞廣泛分布于黏膜層和黏膜下層,這種分布特點使它成為黏膜免疫系統(tǒng)中首先與外界變應原及病原體相互作用的“哨兵”。CTMCs主要分布在無菌的結締組織部位,而MMCs分布在非無菌的胃腸道和消化道黏膜固有層,因此,從理論而言,CTMCs在對外來抗原的反應上更為“警覺”,故CTMCs對抗原特異性T細胞的激活作用可能具有重要的生理意義。此外,CTMCs也可通過FcγRs交聯(lián)參與抗體反饋(Antibody feedback)。肥大細胞激活劑可促進機體的細胞免疫和體液免疫反應,被認為可發(fā)揮黏膜佐劑的功能。有研究認為,將肥大細胞激活劑與IgG形成復合物,通過IgG可進一步對免疫反應進行調控[7-9]。

    本文進一步揭示了IgG抗體的自然佐劑的作用,部分是由于IgG抗體與抗原形成復合物后,通過肥大細胞以抗原依賴的方式對細胞和體液免疫進行調控;CTMCs在抗原特異性T細胞激活中發(fā)揮重要作用。CTMCs通過其表面的FcγRs結合抗原后,以抗原特異性的方式刺激CD4+T淋巴細胞增殖,但其機理還有待進一步探討。

    小鼠肥大細胞表達的受體有FcγRⅢA和FcγRⅡB兩種FcγRs,所有肥大細胞均表達抑制型受體FcγRⅡB,但僅有 CTMCs表達 FcγRⅢA[10]。首先,CTMCs通過FcγRs攝取抗原后,可能作為抗原遞呈細胞而直接作用于T細胞。肥大細胞含有溶酶體、酸性水解酶[11],有加工處理抗原所需的特性。Frandji[12]分析了小鼠骨髓源性培養(yǎng)的肥大細胞(BMMC)的抗原遞呈細胞(APC)功能,認為肥大細胞遞呈外源性和內源性抗原的能力有差別。Malaviya的研究[13]表明,肥大細胞可吞噬革蘭氏陰性桿菌并對細菌抗原進行加工,通過MHCⅠ類分子遞呈給T雜交瘤細胞。我們的研究表明,盡管IgE的高親和力受體FcεRⅠ交聯(lián)是肥大細胞上研究最多的調控途徑,F(xiàn)cγRs交聯(lián)途徑也發(fā)揮重要作用,而IgG是表達FcγRs的CTMCs攝取特異性抗原的有效橋梁。其次,CTMCs細胞表面有2種FcγRs,F(xiàn)cγRⅡB和FcγRⅢA,對抗原抗體復合物所引起的凋亡有一定程度的抵抗作用,OVA/抗OVA-IgG復合物并不引起CTMCs細胞的凋亡[14]。有文獻報道,BMMC通過IgE受體FcεRI內吞抗原并發(fā)生凋亡,凋亡后樹突狀細胞吞噬凋亡小體,從而成為一個持續(xù)的抗原庫,使T細胞激活[3]。我們在對MMCs的研究中也觀察到類似于BMMC的通過FcγRⅡB交聯(lián)而發(fā)生的上述現(xiàn)象(文章待發(fā)表)。如果CTMCs通過FcγRs結合免疫復合物后,不能通過凋亡、繼而被APC吞噬成為一種抗原儲存庫的方式激活 T細胞,那么提示著尚有其他途徑激活T細胞,在今后的研究中必須關注這個問題。第三,CTMCs的MHCⅠ類和Ⅱ類抗原、共刺激分子的表達也會影響抗原特異性T細胞的激活,但在本文的研究體系中可能并不發(fā)揮重要作用[3]。

    本文研究提示,CTMCs也可能參與抗體反饋的調控過程,通過 IgG/FcγRs交聯(lián)對抗原特異性CD4+T細胞、繼而對B細胞活性產(chǎn)生影響。

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