麻風(fēng)病患者外周血IL-10與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的相關(guān)性研究①

李彩霞 陸 林 周曉鴻 鄒子宏 徐元品 王笑彬 丁文立 張曉虹 李曉嵐

(昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院皮膚科，昆明 650051)

麻風(fēng)病是一種由麻風(fēng)分枝桿菌引起，可導(dǎo)致毀容、殘疾的慢性接觸性傳染病。該病潛伏期長，被麻風(fēng)桿菌感染后一般要經(jīng)過2～7年才會發(fā)病，但不是所有感染者都會發(fā)展成為麻風(fēng)病。在與傳染性麻風(fēng)患者同等接觸的條件下，只有少數(shù)人會發(fā)病，這是因為麻風(fēng)患者存在著不同程度的細(xì)胞免疫功能缺陷［1，2］，但目前對此機(jī)制的研究仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)麻風(fēng)患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)比正常人明顯增高［3，4］，而 IL-10 在 Treg 細(xì)胞的分化及功能維持等方面起著重要作用，所以我們對麻風(fēng)患者血清IL-10的濃度進(jìn)行了檢測，并分析它與外周血Treg細(xì)胞的關(guān)系，以進(jìn)一步探討麻風(fēng)患者免疫功能缺陷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗分組 現(xiàn)癥麻風(fēng)患者51例［5］，來源于昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科門診、云南昆明市晉寧縣皮膚病防治站、昆明市西山區(qū)疾病預(yù)防控制中心及昆明市官渡區(qū)疾病預(yù)防控制中心。其中男38例，女13例，病程2～20個月，平均(31±30.49)個月;治療時間:1～52個月，平均(19.56±10.16)個月。對照組:56例，為本院健康體檢人群，其中男34例，女22例。血清學(xué)及肝腎功能檢查正常，排除感染結(jié)核、麻風(fēng)、HBV、HCV、腫瘤及患自身免疫系統(tǒng)疾病的人群。

1.2 儀器和試劑 IL-10檢測試劑盒、PerCP標(biāo)記的抗人CD4抗體、FITC標(biāo)記的抗人CD25抗體、PE標(biāo)記的抗人 Foxp3抗體、同型對照 FITC-mouse IgG1、PE-mouse IgG1、Human Foxp3 Buffer Set及緩沖液Stain Buffer(FBS)購自美國Becton-Dickinson(B-D)公司。流式細(xì)胞儀為Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Epics XL型。

1.3 流式細(xì)胞微球芯片捕獲技術(shù)(Cytometric bead array，簡稱CBA)檢測麻風(fēng)患者和正常對照組血清IL-10的水平。

1.3.1 取被檢測者肘靜脈血4 ml于普通真空采血管中，室溫下靜置2 h，3 000 r/min離心10 min后收取上層血清，置于EP管中－20℃凍存，待標(biāo)本全部收集完畢后統(tǒng)一檢測IL-10。

1.3.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 先將試劑盒內(nèi)的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品按照梯度法稀釋為1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256 幾種濃度，然后加入空白對照管制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣本制備，獲取數(shù)據(jù) 在12×75 mm FALCON上樣管中各加入50 ml捕獲微球混懸液，混勻;各管加入50 μl的IL-10 PE信號抗體;各管加入50 μl檢測樣本;室溫避光孵育3 h;各管加入1 ml洗液，1 500 r/min，離心5 min，洗滌1次;各管加入300 μl洗液，重新懸浮微球;上機(jī)前充分混勻3～5 s，用流式細(xì)胞儀分析樣本。使用CellQuest軟件獲取樣本數(shù)據(jù)，使用BD CBA軟件分析結(jié)果。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測Treg細(xì)胞 取一流式試管，加入 FITC anti-human CD4/PE，anti-human CD25m Ab/AF647，anti-human CD127 各 2 μl，再加 100 μl新鮮肝素抗凝血，混勻，避光孵育20 min，然后加入1 ml溶血素溶血，避光放置5 min，以2 ml 1×PBS洗滌2次，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。經(jīng)檢驗，數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性和方差齊性條件，兩組數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗，數(shù)據(jù)用表示。兩組數(shù)據(jù)滿足線性、等方差性、獨立性及正態(tài)性條件，采用Pearson相關(guān)檢驗驗，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 麻風(fēng)患者血清 IL-10濃度(n=30，130.00±54.27)pg/ml比對照組(n=25，15.64 ±7.11)pg/ml高(P＜0.05)。見圖1。

2.2 麻風(fēng)患者外周血CD4+CD25+Foxp3+占CD4+T淋巴細(xì)胞的比率為(n=51，17.626% ±8.197 7%)，比正常對照組(n=56，9.998% ±1.706 2%)高(P＜0.05)。

圖1 IL-10的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of IL-10

圖2 麻風(fēng)患者血清IL-10濃度與外周血Treg細(xì)胞水平的相關(guān)性Fig.2 Correlation between IL-10 and Treg cells in leprosy patients

2.3 麻風(fēng)患者血清IL-10濃度與外周血CD4+CD25+Foxp3+/CD4+細(xì)胞水平呈正相關(guān)線性關(guān)系(r=0.836，F(xiàn)=213.592，P ＜0.05)，見圖2。

3 討論

麻風(fēng)病是一種與機(jī)體免疫功能有關(guān)的傳染病，其很多損害并不是由麻風(fēng)桿菌直接引起，而是由該菌所誘發(fā)的宿主免疫應(yīng)答所致［6］。在麻風(fēng)患者體內(nèi)，機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫同時起作用，但以細(xì)胞免疫為主［7］。機(jī)體被麻風(fēng)桿菌感染后，是否能建立起有效的細(xì)胞免疫，涉及到抗原遞呈過程中對分枝桿菌的吞噬、抗原傳遞、T細(xì)胞活化、細(xì)胞因子產(chǎn)生、最后清除麻風(fēng)桿菌等一系列的過程［8］。巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、協(xié)同刺激分子、可溶性白細(xì)胞介素2受體及腫瘤壞死因子等數(shù)量或功能狀態(tài)的異常也與麻風(fēng)病發(fā)病密切相關(guān)［9，10］。

Treg細(xì)胞是近年來逐漸被人們所認(rèn)識的一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞群，主要功能是抑制正常機(jī)體中自身反應(yīng)性T細(xì)胞和自身反應(yīng)性B細(xì)胞的活化，具有免疫調(diào)節(jié)及抑制功能，對維持機(jī)體的免疫耐受功能發(fā)揮著重要作用。該群細(xì)胞可通過分泌免疫下調(diào)性細(xì)胞因子(如IL-8或IL-10)來發(fā)揮抑制T細(xì)胞活化、維持免疫耐受以及防止免疫性疾病發(fā)生的作用［11］。

白細(xì)胞介素10(Interleukin 10，IL-10)是一種具有生物活性的小分子多肽，主要由CD4+Th2輔助性T細(xì)胞亞群產(chǎn)生，在免疫系統(tǒng)中具有廣泛的生物學(xué)活性，不僅可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，還參與了Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用［12］。另外，IL-10還具有抑制Th1細(xì)胞分泌 IL-2、IL-3、干擾素-γ、集落刺激因子和腫瘤壞死因子α的作用［11］。

本研究發(fā)現(xiàn)，麻風(fēng)患者血清IL-10濃度和外周血Treg細(xì)胞水平比對照組高，并且兩者間呈正相關(guān)線性關(guān)系。提示機(jī)體被麻風(fēng)桿菌感染后，麻風(fēng)桿菌刺激T細(xì)胞引起Treg細(xì)胞擴(kuò)增，而Treg細(xì)胞又可分泌IL-10參與免疫反應(yīng)。兩者相互作用，使機(jī)體免疫應(yīng)答功能受到抑制，麻風(fēng)桿菌不能被有效清除，最終導(dǎo)致麻風(fēng)菌大量繁殖，機(jī)體患病。

目前關(guān)于IL-10與Treg細(xì)胞之間如何進(jìn)行精確調(diào)控的機(jī)制仍不清楚，充分了解它們在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中的作用，將為麻風(fēng)病的免疫治療提供新的思路。

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