麻風病患者外周血IL-10與調節(jié)性T細胞的相關性研究①

李彩霞 陸 林 周曉鴻 鄒子宏 徐元品 王笑彬 丁文立 張曉虹 李曉嵐

(昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院皮膚科，昆明 650051)

麻風病是一種由麻風分枝桿菌引起，可導致毀容、殘疾的慢性接觸性傳染病。該病潛伏期長，被麻風桿菌感染后一般要經過2～7年才會發(fā)病，但不是所有感染者都會發(fā)展成為麻風病。在與傳染性麻風患者同等接觸的條件下，只有少數人會發(fā)病，這是因為麻風患者存在著不同程度的細胞免疫功能缺陷［1，2］，但目前對此機制的研究仍不清楚。研究發(fā)現麻風患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞(Treg)比正常人明顯增高［3，4］，而 IL-10 在 Treg 細胞的分化及功能維持等方面起著重要作用，所以我們對麻風患者血清IL-10的濃度進行了檢測，并分析它與外周血Treg細胞的關系，以進一步探討麻風患者免疫功能缺陷的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗分組 現癥麻風患者51例［5］，來源于昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院皮膚科門診、云南昆明市晉寧縣皮膚病防治站、昆明市西山區(qū)疾病預防控制中心及昆明市官渡區(qū)疾病預防控制中心。其中男38例，女13例，病程2～20個月，平均(31±30.49)個月;治療時間:1～52個月，平均(19.56±10.16)個月。對照組:56例，為本院健康體檢人群，其中男34例，女22例。血清學及肝腎功能檢查正常，排除感染結核、麻風、HBV、HCV、腫瘤及患自身免疫系統(tǒng)疾病的人群。

1.2 儀器和試劑 IL-10檢測試劑盒、PerCP標記的抗人CD4抗體、FITC標記的抗人CD25抗體、PE標記的抗人 Foxp3抗體、同型對照 FITC-mouse IgG1、PE-mouse IgG1、Human Foxp3 Buffer Set及緩沖液Stain Buffer(FBS)購自美國Becton-Dickinson(B-D)公司。流式細胞儀為Beckman Coulter公司生產的Epics XL型。

1.3 流式細胞微球芯片捕獲技術(Cytometric bead array，簡稱CBA)檢測麻風患者和正常對照組血清IL-10的水平。

1.3.1 取被檢測者肘靜脈血4 ml于普通真空采血管中，室溫下靜置2 h，3 000 r/min離心10 min后收取上層血清，置于EP管中－20℃凍存，待標本全部收集完畢后統(tǒng)一檢測IL-10。

1.3.2 繪制標準曲線 先將試劑盒內的細胞因子標準品按照梯度法稀釋為1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256 幾種濃度，然后加入空白對照管制備標準曲線。

1.3.3 樣本制備，獲取數據 在12×75 mm FALCON上樣管中各加入50 ml捕獲微球混懸液，混勻;各管加入50 μl的IL-10 PE信號抗體;各管加入50 μl檢測樣本;室溫避光孵育3 h;各管加入1 ml洗液，1 500 r/min，離心5 min，洗滌1次;各管加入300 μl洗液，重新懸浮微球;上機前充分混勻3～5 s，用流式細胞儀分析樣本。使用CellQuest軟件獲取樣本數據，使用BD CBA軟件分析結果。

1.4 流式細胞儀檢測Treg細胞 取一流式試管，加入 FITC anti-human CD4/PE，anti-human CD25m Ab/AF647，anti-human CD127 各 2 μl，再加 100 μl新鮮肝素抗凝血，混勻，避光孵育20 min，然后加入1 ml溶血素溶血，避光放置5 min，以2 ml 1×PBS洗滌2次，上流式細胞儀進行檢測。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。經檢驗，數據滿足正態(tài)性和方差齊性條件，兩組數據比較采用獨立樣本t檢驗，數據用表示。兩組數據滿足線性、等方差性、獨立性及正態(tài)性條件，采用Pearson相關檢驗驗，P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 麻風患者血清 IL-10濃度(n=30，130.00±54.27)pg/ml比對照組(n=25，15.64 ±7.11)pg/ml高(P＜0.05)。見圖1。

2.2 麻風患者外周血CD4+CD25+Foxp3+占CD4+T淋巴細胞的比率為(n=51，17.626% ±8.197 7%)，比正常對照組(n=56，9.998% ±1.706 2%)高(P＜0.05)。

圖1 IL-10的標準曲線Fig.1 Standard curve of IL-10

圖2 麻風患者血清IL-10濃度與外周血Treg細胞水平的相關性Fig.2 Correlation between IL-10 and Treg cells in leprosy patients

2.3 麻風患者血清IL-10濃度與外周血CD4+CD25+Foxp3+/CD4+細胞水平呈正相關線性關系(r=0.836，F=213.592，P ＜0.05)，見圖2。

3 討論

麻風病是一種與機體免疫功能有關的傳染病，其很多損害并不是由麻風桿菌直接引起，而是由該菌所誘發(fā)的宿主免疫應答所致［6］。在麻風患者體內，機體的細胞免疫和體液免疫同時起作用，但以細胞免疫為主［7］。機體被麻風桿菌感染后，是否能建立起有效的細胞免疫，涉及到抗原遞呈過程中對分枝桿菌的吞噬、抗原傳遞、T細胞活化、細胞因子產生、最后清除麻風桿菌等一系列的過程［8］。巨噬細胞、T淋巴細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞、協同刺激分子、可溶性白細胞介素2受體及腫瘤壞死因子等數量或功能狀態(tài)的異常也與麻風病發(fā)病密切相關［9，10］。

Treg細胞是近年來逐漸被人們所認識的一類具有免疫調節(jié)功能的T細胞亞群，主要功能是抑制正常機體中自身反應性T細胞和自身反應性B細胞的活化，具有免疫調節(jié)及抑制功能，對維持機體的免疫耐受功能發(fā)揮著重要作用。該群細胞可通過分泌免疫下調性細胞因子(如IL-8或IL-10)來發(fā)揮抑制T細胞活化、維持免疫耐受以及防止免疫性疾病發(fā)生的作用［11］。

白細胞介素10(Interleukin 10，IL-10)是一種具有生物活性的小分子多肽，主要由CD4+Th2輔助性T細胞亞群產生，在免疫系統(tǒng)中具有廣泛的生物學活性，不僅可誘導Treg細胞的產生，還參與了Treg細胞的免疫調節(jié)作用［12］。另外，IL-10還具有抑制Th1細胞分泌 IL-2、IL-3、干擾素-γ、集落刺激因子和腫瘤壞死因子α的作用［11］。

本研究發(fā)現，麻風患者血清IL-10濃度和外周血Treg細胞水平比對照組高，并且兩者間呈正相關線性關系。提示機體被麻風桿菌感染后，麻風桿菌刺激T細胞引起Treg細胞擴增，而Treg細胞又可分泌IL-10參與免疫反應。兩者相互作用，使機體免疫應答功能受到抑制，麻風桿菌不能被有效清除，最終導致麻風菌大量繁殖，機體患病。

目前關于IL-10與Treg細胞之間如何進行精確調控的機制仍不清楚，充分了解它們在機體免疫應答過程中的作用，將為麻風病的免疫治療提供新的思路。

［1］Ribeiro-Rodrigues R，Resende Co T，Rojas R et al.A role for CD4+CD25+T cells in regulation of the immune response during human tuberculosis ［J］.Clin Exp Immunol，2006，144(1):25-34.

［2］Weiss L，Donkova Petrini V，Caccavelli L，et al.Human immunodeficiency virus-driven expansion of CD4+CD25+regulatory T cells，which suppress HIV-specific CD4 T-cell responses in HIV-infected patients［J］.Blood ，2004，104(10):3249-3256.

［3］李彩霞，徐元品，鄒子宏，等.CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性 T細胞在麻風病中的水平和意義［J］.中國免疫學雜志，2013，29(1):158-160.

［4］李彩霞，鄒子宏，徐元品，等.麻風患者治愈后外周血Th17及Treg細胞的檢測［J］.中國皮膚性病學雜志，2013，27(3):243-245.

［5］李文忠.現代麻風病學［M］.上海:上?？茖W技術出版社，2006:15.

［6］李桓英.麻風病研究進展［J］.中國麻風皮膚病雜志，2006，22(10):648-649.

［7］吳勤學，王洪生.麻風病中的免疫反應［J］.中國麻風皮膚病雜，2008，24(4):592-892.

［8］翁小滿，胡永秀.麻風病免疫中的樹突狀細胞與T細胞的相互作用及其研究進展［J］.中國麻風皮膚病雜志，2005，21(3):102-302.

［9］Monot M，Honoré N，Garnier T，et al.On the origin of leprosy［J］.Science，2005，308(5724):1040-1042.

［10］Scollard DM，AdamsLB，Gillis TP，et al.The continuing challenges of leprosy［J］.Clin Microbiol Rev，2006，19(2):338-381.

［11］Liu G，Ma H，Qiu L，et al.Phenotypic and functional switch of macrophages induced by regulatory CD4+CD25+T cells in mice［J］.Immunol Cell Biol，2011，89(1):130-142.

［12］Maloy K J，Salaunl，Cahill R，et al.CD4+CD25+T(R)cells suppress innate immune pathology through cytokine-dependent mechanisms［J］.J Exp Med，2003，197(1):111-119.