血細(xì)胞分析技術(shù)及其進(jìn)展研究

段 浩，陳 鋒，顧 彪，李 抄，吳太虎

0 引言

血細(xì)胞分析儀是當(dāng)前國內(nèi)外各大醫(yī)院及實(shí)驗(yàn)室所采用的一種進(jìn)行血液參數(shù)分析和實(shí)驗(yàn)的重要儀器，它為醫(yī)療工作者對被檢測者的血液基本情況提供量化認(rèn)知依據(jù)，并為后續(xù)醫(yī)療行為的開展提供參考。自20世紀(jì)40年代問世以來，經(jīng)過60多年的發(fā)展，血細(xì)胞分析儀從僅能進(jìn)行紅細(xì)胞、白細(xì)胞測量演變?yōu)榭蛇M(jìn)行白細(xì)胞五分類、七分類甚至九分類，報(bào)告參數(shù)多達(dá)幾十項(xiàng)的全面綜合型分析儀器[1]。其主要進(jìn)展表現(xiàn)在白細(xì)胞測量原理的不斷創(chuàng)新上：從原有的物理性測量發(fā)展為物理、化學(xué)、生物等多學(xué)科技術(shù)手段綜合運(yùn)用，測量方式也由半自動(dòng)化轉(zhuǎn)變?yōu)槿詣?dòng)化，尤其是電子技術(shù)和圖像分析技術(shù)的不斷突破促進(jìn)血細(xì)胞分析技術(shù)測量范圍更廣、準(zhǔn)確度更高[2]。本文從血細(xì)胞分析技術(shù)的問世開始，對其發(fā)展歷史進(jìn)行簡要介紹，重點(diǎn)闡述了濕式技術(shù)在白細(xì)胞分類和精確測量方面的原理。同時(shí)，結(jié)合作者自身的工作實(shí)踐體會(huì)，對干式測量技術(shù)及其應(yīng)用前景進(jìn)行了概述，并大膽預(yù)測了未來血液分析技術(shù)的發(fā)展趨勢。

1 血細(xì)胞分析儀的發(fā)展歷史

20世紀(jì)40年代末，血細(xì)胞分析主要采用光電法和電容法，其原理為利用細(xì)胞稀釋液對光吸收度不同而采用光敏元件進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)，或者根據(jù)血細(xì)胞通過測量電極時(shí)改變極間電容的方法進(jìn)行脈沖直方圖計(jì)數(shù)，然而儀器靈敏度低和易受干擾等缺點(diǎn)使其在推廣應(yīng)用上大大受限[3]。20世紀(jì)50年代后期，庫爾特發(fā)明了電阻抗法（亦稱電阻法），主要利用血細(xì)胞的低頻不導(dǎo)電特性對紅細(xì)胞和白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，該方法因其測量準(zhǔn)確度高至今仍廣為應(yīng)用。20世紀(jì)70年代以后，庫爾特和希森美康公司先后推出可進(jìn)行白細(xì)胞二分群（小細(xì)胞群和大細(xì)胞群）的儀器，其報(bào)告參數(shù)也從單一血細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)展到包含平均紅細(xì)胞細(xì)胞體積（MCV）、平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（MCH）等多個(gè)綜合分析表征量[4]。自此之后，許多公司相繼研制并推出了可進(jìn)行白細(xì)胞三分群（小細(xì)胞群、大細(xì)胞群和中間細(xì)胞群）的血細(xì)胞分析儀，可報(bào)告的參數(shù)增加到十幾項(xiàng)。進(jìn)入20世紀(jì)90年代，白細(xì)胞分群技術(shù)獲得長足進(jìn)步，物理、化學(xué)等手段的綜合應(yīng)用使得白細(xì)胞從三分類發(fā)展到五分類、七分類，甚至是九分類，可報(bào)告參數(shù)也增加到20多項(xiàng)。其中，除主要血細(xì)胞參數(shù)外，各細(xì)胞亞群參數(shù)也納入測量范圍并進(jìn)一步精細(xì)化，這使得血細(xì)胞分析儀報(bào)告參數(shù)在保證測量準(zhǔn)確性的前提下充分增加，從而更加客觀全面地反映出測試者的血液狀況[5]。

2 血細(xì)胞分析儀的主要測量原理（濕式分析技術(shù)）

血細(xì)胞分析儀主要是對血液有形成分（紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板及血漿等）的定量測量，并通過相關(guān)參數(shù)推導(dǎo)反映人體血液循環(huán)及機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)狀況。當(dāng)前市場上血細(xì)胞分析儀器種類繁多，但其檢測原理及參數(shù)基本相同，現(xiàn)介紹如下。

2.1 紅細(xì)胞和血小板的檢測原理

人體血液中的紅細(xì)胞和血小板在細(xì)胞體積和數(shù)量上存在明顯差異，因此，二者在同一個(gè)測量通道內(nèi)進(jìn)行區(qū)分計(jì)數(shù)。主要測量方法為電阻抗法，后期發(fā)展出現(xiàn)的光散射法則在細(xì)胞計(jì)數(shù)和體積測量的基礎(chǔ)上給出平均血紅蛋白含量、平均血紅蛋白濃度（MCHC）等更多測量及推導(dǎo)參數(shù)。

（1）電阻抗法：采用電阻抗法進(jìn)行細(xì)胞測量的檢測裝置主要由2個(gè)電極組成，極間電壓恒定。未加入血樣時(shí)鞘流液流速穩(wěn)定，從而使得極間阻值維持不變。由于血細(xì)胞是不良導(dǎo)體，稀釋后的血樣在鞘流液的引導(dǎo)下以恒定速率通過電極時(shí)，進(jìn)樣微孔附近電極間的液體被排開，阻值發(fā)生變化，產(chǎn)生計(jì)數(shù)電脈沖信號(hào)。脈沖信號(hào)的幅度表征血細(xì)胞體積，數(shù)目表征血細(xì)胞數(shù)量。紅細(xì)胞和血小板在體積上存在較大差異，因此，通過設(shè)置脈沖幅度閾值可在單測量通道內(nèi)對二者進(jìn)行有效區(qū)分：一般將2～35 fL的顆粒統(tǒng)計(jì)為血小板，大于36 fL的顆粒統(tǒng)計(jì)為紅細(xì)胞。脈沖信號(hào)經(jīng)過幅度甄別器、濾波、信號(hào)放大器及算法處理，得出相應(yīng)分類的數(shù)目[6]。

（2）光散射法：紅細(xì)胞的光散射計(jì)數(shù)主要是采用高、低2個(gè)角度測量同一個(gè)經(jīng)戊二醛固定紅細(xì)胞的散射光。根據(jù)Mie理論，當(dāng)球形化的血小板單個(gè)通過激光照射區(qū)時(shí)，在高角度測量細(xì)胞的折射指數(shù)（RI），它與細(xì)胞的密度有關(guān)，可準(zhǔn)確得出平均紅細(xì)胞體積、平均血紅蛋白含量等參數(shù)。低角度測量散射光的轉(zhuǎn)換能量大小可以獲得單個(gè)紅細(xì)胞的體積及其總數(shù)。光散射法對紅細(xì)胞和血小板的測量可將小型紅細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞碎片及電子噪音進(jìn)行區(qū)別，甚至可以計(jì)數(shù)30～60 fL的大型血小板。

然而，紅細(xì)胞和血小板的測量信號(hào)常有交叉（如大型血小板脈沖信號(hào)誤判為紅細(xì)胞，小型紅細(xì)胞脈沖信號(hào)進(jìn)入血小板計(jì)數(shù)），造成實(shí)驗(yàn)誤差。因此，對二者的精確區(qū)分測量采用了以下幾種技術(shù)。

（1）掃流技術(shù)：紅細(xì)胞體積相對血小板較大，已經(jīng)通過測量室進(jìn)行脈沖計(jì)數(shù)的紅細(xì)胞一旦回流至感應(yīng)區(qū)邊緣，則會(huì)出現(xiàn)較小渦流而產(chǎn)生類似血小板的脈沖信號(hào)，從而導(dǎo)致血小板假性計(jì)數(shù)。掃流技術(shù)在紅細(xì)胞計(jì)數(shù)小孔后設(shè)置了穩(wěn)定流路，可保證通過微孔已進(jìn)行計(jì)數(shù)的紅細(xì)胞立即被沖走，進(jìn)而防止假性計(jì)數(shù)脈沖的產(chǎn)生。

（2）防反流裝置：為了防止已進(jìn)行測量計(jì)數(shù)的紅細(xì)胞回流，在計(jì)數(shù)池小孔后方感應(yīng)區(qū)之外設(shè)置擋板，板上存在直徑略大于紅細(xì)胞直徑的小孔。進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)已通過感應(yīng)區(qū)的紅細(xì)胞在負(fù)壓作用下立即通過小孔流走，即使產(chǎn)生渦流，擋板也會(huì)阻止紅細(xì)胞回流，保證脈沖計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性[7]。

（3）鞘流技術(shù)：為了避免紅細(xì)胞從計(jì)數(shù)孔邊緣流走及渦流、回流等現(xiàn)象出現(xiàn)，采用鞘流技術(shù)。將細(xì)胞稀釋液通過一毛細(xì)管對準(zhǔn)測量孔，伴隨四周的鞘流液一起流出，這使得中間的細(xì)胞稀釋液在鞘流液作用下形成單個(gè)排列的細(xì)胞流，從而確保了在電阻抗和流式測量2種方法中紅細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確[8]。

（4）浮動(dòng)界標(biāo)技術(shù)：正常情況下，紅細(xì)胞和血小板體積差異較大，采用固定閾值很容易進(jìn)行區(qū)分（通常以35 fL作為測量閾值）。但在機(jī)體病理情況下，血小板體積可能超過35 fL，在某些貧血（如缺鐵性貧血、地中海貧血）患者中，紅細(xì)胞體積則偏小。因此，固定閾值可能造成血小板和紅細(xì)胞漏檢。針對此類情況，可在脈沖直方圖正常值范圍內(nèi)（通常為5～35 fL）選取頻數(shù)最低點(diǎn)作為二者的計(jì)數(shù)閾值，以此進(jìn)行浮動(dòng)界標(biāo)判斷計(jì)數(shù)[9]。

其他形態(tài)紅細(xì)胞的測量，如網(wǎng)織紅細(xì)胞（晚幼紅細(xì)胞脫核后到完全成熟紅細(xì)胞之間的過渡細(xì)胞）的檢測是基于其自身的特殊性質(zhì)：胞漿內(nèi)殘存的嗜堿性物質(zhì)活體狀態(tài)下可被吖啶橙、堿性槐黃等熒光染料染色，在激光照射下發(fā)出固定波長的熒光，儀器通過測試發(fā)光細(xì)胞數(shù)量和光強(qiáng)即可得到網(wǎng)織紅細(xì)胞的各項(xiàng)參數(shù)。有核紅細(xì)胞和白細(xì)胞可同時(shí)進(jìn)行測量，加入溶血?jiǎng)┤芙獬墒旒t細(xì)胞后，采用聚次甲基熒光染料進(jìn)行核染色，檢測其熒光強(qiáng)度便可明顯區(qū)分出2個(gè)細(xì)胞群。

2.2 白細(xì)胞的測量原理

白細(xì)胞的分類測量技術(shù)從最初的電阻抗法物理計(jì)數(shù)逐漸發(fā)展到生物與化學(xué)染色等技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行三分類、五分類甚至九分類計(jì)數(shù)，其測量原理的不斷創(chuàng)新是血細(xì)胞分析儀發(fā)展的主要方面。

（1）電阻抗法：早期白細(xì)胞測量計(jì)數(shù)采用電阻抗法。首先對采集到的血樣進(jìn)行一定比例稀釋并加入溶血?jiǎng)?，使得紅細(xì)胞溶解的同時(shí)白細(xì)胞皺縮、胞漿滲出，保留下來的包膜將細(xì)胞器包裹在細(xì)胞核的周圍。然后細(xì)胞懸浮液通過計(jì)數(shù)孔進(jìn)行脈沖信號(hào)采集和直方圖輸出，各分類細(xì)胞值通過計(jì)算細(xì)胞群在脈沖直方圖上的面積得出：35～90 fL為小細(xì)胞亞群（以成熟的淋巴細(xì)胞為主），90～160 fL為中間細(xì)胞群（以單核細(xì)胞為主），160～450 fL為大細(xì)胞亞群（以中性粒細(xì)胞為主）[10]。此方法可對白細(xì)胞進(jìn)行三分類，淋巴和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)準(zhǔn)確度較高。

（2）光散射與細(xì)胞化學(xué)聯(lián)合分析技術(shù)：這種方法主要利用各類白細(xì)胞的過氧化物酶（MPO）濃度不同對白細(xì)胞進(jìn)行六分群，同時(shí)對嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)測量。白細(xì)胞各分群中嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞（除早期外）內(nèi)所含過氧化物酶濃度依次降低，淋巴細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、幼稚紅細(xì)胞、巨核細(xì)胞均不含此酶。待測血樣首先加入清洗劑和甲醛混合的等滲稀釋液，然后加入過氧化氫和四氯-萘酚，細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶分解過氧化氫產(chǎn)生氧，使四氯-萘酚氧化后顯色并沉淀，定位于酶反應(yīng)部位。采用激光束低角度（0～5°）和高角度（5～14°）照射細(xì)胞，并采集其散射光強(qiáng)度信號(hào)：低角度散射光反映細(xì)胞大小，高角度散射光反映核葉數(shù)目及大?。ê巳~多、大則散射光強(qiáng)）。通過分析此測量通道分類圖可以得出以上細(xì)胞參數(shù)并分析出大型不染色細(xì)胞群（非典型淋巴細(xì)胞或MPO陰性的原幼細(xì)胞）。對于不含過氧化物酶的嗜堿性粒細(xì)胞，其測量采用時(shí)間差法與紅細(xì)胞、血小板共用一個(gè)通道，加入排他性試劑溶解其他細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞與裸核一起進(jìn)入測量通道，通過前向角和散射角的測量進(jìn)行區(qū)分計(jì)數(shù)：嗜堿性細(xì)胞呈高狹角散射，位于脈沖直方圖的上半部，裸核位于下半部。此外，還可以在細(xì)胞懸浮液中加入吖啶橙等熒光染料，經(jīng)激光照射激發(fā)，對網(wǎng)織紅細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。該項(xiàng)測量技術(shù)對白細(xì)胞區(qū)分較好，計(jì)數(shù)準(zhǔn)確度較高，但測量過程中消耗試劑種類繁多，流路和光路的精密度要求較高[11]。

（3）多角度偏振光分析技術(shù)：這種技術(shù)主要基于嗜堿性粒細(xì)胞的吸濕特性和紅細(xì)胞經(jīng)低滲鞘流液處理后不影響白細(xì)胞計(jì)數(shù)（鞘流液作用下紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白游離出細(xì)胞外，鞘流液滲入，其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)依然完整，折光指數(shù)與鞘流液基本相同，因此，不影響白細(xì)胞計(jì)數(shù)）的原理[12]。采用鞘流技術(shù)使血細(xì)胞單個(gè)通過檢測區(qū)，利用0、10、90°散射光密度測量值列表來進(jìn)行血細(xì)胞分析：0°前向散射光強(qiáng)度（1～3°）反映細(xì)胞體積及數(shù)量；10°散射光強(qiáng)度（7～11°）反映細(xì)胞結(jié)構(gòu)和核質(zhì)復(fù)雜性；90°散射光強(qiáng)度（70～110°）反映細(xì)胞內(nèi)顆粒及分葉狀況；90°D（消偏振光）散射光強(qiáng)度（70～110°）是基于嗜酸性粒細(xì)胞可將垂直角度的偏振光消偏振的特性，從而將嗜酸性粒細(xì)胞從中性粒細(xì)胞中分離出來。該技術(shù)的優(yōu)勢在于采用10°窄角和偏振加消偏振檢測法，系統(tǒng)分辨力得以提高，實(shí)現(xiàn)了白細(xì)胞五分類，同時(shí)對其他異常白細(xì)胞可進(jìn)行提示[13]。

（4）VCS探針技術(shù)：該方法是庫爾特公司繼電阻抗法后又一重要技術(shù)。V表示體積，采用低頻電流分析細(xì)胞體積，能有效區(qū)分淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。C表示電導(dǎo)，采用高頻電磁波，根據(jù)各種細(xì)胞的電導(dǎo)性不同來測定細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)、核漿比例，可用于區(qū)分體積相同的2組細(xì)胞群，如小淋巴細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞。S表示光散射，適用氦氖激光源發(fā)出的單色激光照射細(xì)胞，并收集10～70°細(xì)胞散射光，可以獲得細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)等信息，從而較好地區(qū)分細(xì)胞的顆粒構(gòu)型和質(zhì)量[14]。待測血樣中首先加入只作用于紅細(xì)胞的溶血?jiǎng)芙饧t細(xì)胞。然后加入抗溶血?jiǎng)┲泻腿苎獎(jiǎng)┳饔?，使白?xì)胞表面、胞質(zhì)及細(xì)胞大小等特點(diǎn)仍保持與體內(nèi)相同的狀態(tài)。樣本溶液在鞘流液包圍中通過測量區(qū)，同時(shí)接受VCS探針測試。在實(shí)現(xiàn)白細(xì)胞五分類的基礎(chǔ)上，該技術(shù)還可以檢測幼稚白細(xì)胞、異型淋巴細(xì)胞、有核細(xì)胞、抗溶血紅細(xì)胞等。

（5）電阻抗、射頻和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)：該技術(shù)主要是半導(dǎo)體激光流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)合核酸熒光染色技術(shù)進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類，依據(jù)3類信號(hào)來鑒別細(xì)胞類別：前向散射光（FSC）反映細(xì)胞體積大??；側(cè)向散射光（SSC）反映細(xì)胞的顆粒和細(xì)胞核等信息；側(cè)向熒光（SFL）信號(hào)用于分析DNA和RNA的含量[15]。通過在血樣中加入STROMATOLYSER-4DL試劑（以下簡稱4DL）可以溶解紅細(xì)胞和血小板，并在白細(xì)胞膜上打出10～50 nm小孔。然后細(xì)胞懸浮液中加入試劑STR0MATOLYSER-4DS，其中的聚次甲基染料通過小孔進(jìn)入白細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞器和細(xì)胞核中的核酸結(jié)合，在633 nm激光照射下激發(fā)熒光強(qiáng)度與其含量成正比。由于4DL對淋巴細(xì)胞透化作用最大，染色后其熒光較粒細(xì)胞強(qiáng)。嗜堿性粒細(xì)胞在4DL作用下脫去部分顆粒，其熒光強(qiáng)度最弱。中性粒細(xì)胞僅脫去部分胞漿，熒光強(qiáng)度介于二者之間。同時(shí)，淋巴細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器較少，因此，側(cè)向散射光和熒光較單核細(xì)胞弱。4DL與嗜酸性粒細(xì)胞的特異性結(jié)合可以通過測量側(cè)向散射光信號(hào)將其有效區(qū)分出來。針對嗜堿性粒細(xì)胞，同樣采用特異性試劑溶解其他細(xì)胞，進(jìn)行前向散射光和側(cè)向散射光測量即可進(jìn)行分離[16]。此外，電阻抗法和射頻技術(shù)也被用于測量幼稚細(xì)胞：根據(jù)幼稚細(xì)胞表面相對成熟的細(xì)胞膜脂質(zhì)較少的特點(diǎn)，在細(xì)胞稀釋液中加入硫化氨基酸，占位不同使得結(jié)合在幼稚細(xì)胞表面的氨基酸較多，具有一定抵抗溶血?jiǎng)┑淖饔?。血樣加入溶血?jiǎng)┖蟪墒旒?xì)胞破碎，則通過電阻法可檢測出幼稚細(xì)胞，而射頻技術(shù)用于測量細(xì)胞核的大小和顆粒的多少。

2.3 血紅蛋白的測量原理

由于臨床檢驗(yàn)中難以從血液中分離出血紅蛋白，因此，采用比色法進(jìn)行間接測量。首先向待測血液中加入溶血?jiǎng)?，使得紅細(xì)胞破裂、血紅蛋白溶解出來。然后加入氰化鉀將其轉(zhuǎn)化為顏色穩(wěn)定的氰化血紅蛋白，血紅蛋白含量越高，則顏色越深，吸光性越強(qiáng)。一般采用雙波長法測量血紅蛋白，其原理如圖1所示。氰化鉀的光密度曲線在540 nm處有一個(gè)吸收峰，光源發(fā)出的光經(jīng)過透鏡和狹縫透射過比色皿到達(dá)一個(gè)半透半反鏡上分成2束光：透射光經(jīng)690 nm濾光片到達(dá)光電池B轉(zhuǎn)化為參考信號(hào)，反射光經(jīng)過540 nm濾光片到達(dá)光電池A轉(zhuǎn)化為樣品信號(hào)。設(shè)λ1=540 nm，λ2=690 nm，則在 λ1時(shí)吸光度為 Aλ1=Kλ1CL+AS1。其中，Aλ1為在 λ1時(shí)的吸光系數(shù)，C 為待測物質(zhì)濃度，L為比色皿厚度，AS1為光散射和背景吸光度。同樣，對于λ2也有Aλ2=Kλ2CL+AS2。AS1與AS2近似相等，則參考信號(hào)與樣品吸光度之差為 ΔA=（Kλ2-Kλ1）CL。此式說明樣品中的待測組分濃度與兩波長的吸光度之差成正比，因此，通過求出參考和樣品信號(hào)差便可以求得相應(yīng)的血紅蛋白濃度。

圖1 雙波長法測量血紅蛋白原理圖

3 干式血細(xì)胞分析儀的測量原理

3.1 基本測量原理

干式血細(xì)胞分析儀測量主要基于細(xì)胞染色和離心分層技術(shù)。通過毛細(xì)作用將血樣灌入特制毛細(xì)管中，使血液與草酸鉀、吖啶橙及EDTA抗凝劑充分混合。其次加入特定比重的浮子，在12 000 r/min離心機(jī)中進(jìn)行高速離心5min。由于血液中各成分存在密度梯度，因此，離心后毛細(xì)管從下到上依次為紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板、血漿，如圖2所示[17]。加入浮子是為了對數(shù)量較少的白細(xì)胞分層（具體為粒細(xì)胞層、淋巴及單核細(xì)胞層）進(jìn)行層厚擴(kuò)展，以便于區(qū)分。然后采用紅色光源照射毛細(xì)管，采集透射光信號(hào)強(qiáng)度圖用于區(qū)分2層紅細(xì)胞（由于部分浮子進(jìn)入，分為被擴(kuò)展紅細(xì)胞層和未被擴(kuò)展紅細(xì)胞層）、血漿。之后采用波長為470 nm的藍(lán)光照射毛細(xì)管，激發(fā)染色劑產(chǎn)生熒光，粒細(xì)胞層、淋巴及單核細(xì)胞層、血小板層分別發(fā)出橘紅色、亮綠色、橘黃色熒光[18-19]。采集熒光信號(hào)，通過處理熒光圖像可獲得各個(gè)細(xì)胞層的厚度，與其對應(yīng)密度相乘即可得到細(xì)胞數(shù)量[14]。相較于濕式測量方法，干式測量雖然精確度略低，但無需多種試劑，不存在復(fù)雜流路和光路的諸多要求，最大限度保證了血細(xì)胞的原始狀態(tài)，并且抗震性能較好，適用于各種復(fù)雜環(huán)境下的測量。

圖2 離心后毛細(xì)管血樣分層放大視圖

3.2 血紅蛋白的測量原理

紅細(xì)胞中1/3為血紅蛋白，其余為水和低濃度鹽類，其中，僅有血紅蛋白對紅細(xì)胞比重有決定性作用，同時(shí)血紅蛋白也是待檢測者紅細(xì)胞密度差異的唯一來源。平均血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞密度存在線性關(guān)系，如表達(dá)式（1）所示：

其中，Dr為紅細(xì)胞密度，KS和KO分別為常數(shù)，通過進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合得出[20]。因此，求MCHC轉(zhuǎn)化為求Dr，需要對浮子進(jìn)行平衡態(tài)受力分析，此時(shí)毛細(xì)管中的血樣及浮子位置如圖3所示。

圖3 浮子位置示意圖

離心完成后，浮子受力分析如圖4所示。浮子在自身重力Gf、紅細(xì)胞層浮力Fr、粒細(xì)胞層浮力Fg、淋巴及單核細(xì)胞層浮力Fl、血小板層浮力Fpt及血漿層浮力Fpm共同作用下處于平衡態(tài)，則可得表達(dá)式：

其中，F(xiàn)r=DrLrSg，F(xiàn)g=DgLgSg，F(xiàn)l=DlLlSg，F(xiàn)pt=DptLptSg，F(xiàn)pm=DpmLpmSg，Gf=DfLfSg。 Dr、Dg、Dl、Dpt、Dpm、Df分別為紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴及單核細(xì)胞、血小板、血漿、浮子的密度，Lr、Lg、Ll、Lpl、Lp分別為浮子浸入紅細(xì)胞層、粒細(xì)胞層、淋巴及單核細(xì)胞層、血小板層、血漿層的深度，S為塑料浮子橫截面積，g為重力加速度。由受力分析圖可知Lf=Lr+Lg+Ll+Lpt+Lpm，則代入表達(dá)式（2）得到：

圖4 浮子受力示意圖

由上式可以求出紅細(xì)胞層的密度Dr，代入表達(dá)式（1）求出參數(shù)MCHC，最終可求得血紅蛋白含量[21]HGB=MCHC×HCT（紅細(xì)胞壓積）。

4 血細(xì)胞分析儀的發(fā)展趨勢

當(dāng)前各類血細(xì)胞分析儀的測量原理多種多樣，已全面綜合運(yùn)用物理、化學(xué)、生物、電子及光學(xué)等學(xué)科手段，測量也逐漸從血液主要細(xì)胞類逐漸擴(kuò)展到各亞群及變異細(xì)胞群，精細(xì)和自動(dòng)化程度大大提高。綜合現(xiàn)有儀器的測量原理及優(yōu)缺點(diǎn)，現(xiàn)對血細(xì)胞分析儀未來的發(fā)展趨勢進(jìn)行簡要預(yù)測：

（1）測量對象的精細(xì)化。現(xiàn)有各類型血細(xì)胞分析儀針對血樣中的主要細(xì)胞群測量的技術(shù)已經(jīng)十分成熟，準(zhǔn)確度也較高，進(jìn)一步提高其精度對于患者診斷依據(jù)的提供已無較大影響?；诖?，各大廠家逐漸將測量精細(xì)化對象擴(kuò)展到各細(xì)胞亞群，如B淋巴細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、有核紅細(xì)胞等。此類細(xì)胞的一般性特征為數(shù)量相對于其他細(xì)胞來說較少，其測量精確度有待進(jìn)一步提高，但對于機(jī)體病變的判斷及研究意義重大。因此，未來血細(xì)胞分析儀的功能差異化將主要體現(xiàn)在對亞群細(xì)胞的精確計(jì)數(shù)上。

（2）測量硬件上的精細(xì)加工。目前，濕式的測量通道大多是基于細(xì)胞體積并結(jié)合染色技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞類型判別。流路和光路是進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)的關(guān)鍵硬件，進(jìn)一步細(xì)分測量通道進(jìn)行并行測量對于提高測量結(jié)果的準(zhǔn)確性、操作的便捷性及效率至關(guān)重要，同時(shí)，細(xì)化測量通道設(shè)計(jì)也會(huì)大大降低后期軟件的處理難度。

（3）軟件分析智能化。在測量硬件條件確定的背景下，軟件分析將直接影響分析效率及結(jié)果的精確度。當(dāng)前采集的數(shù)據(jù)主要是一維、二維圖像，三維圖像較少?；诖说乃惴▽映霾桓F，如EM算法、SVM算法、Eigen算法、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法等。由于前二者處理技術(shù)相對成熟，而三維圖像攜帶的數(shù)據(jù)信息最全，對硬件要求較高，因此，未來血細(xì)胞分析軟件部分將偏向三維圖像辨識(shí)發(fā)展，以求多維度下聯(lián)合判別，提高識(shí)別的準(zhǔn)確性。出于實(shí)時(shí)性和分析難度的考慮，二維信號(hào)仍是當(dāng)前以及后續(xù)一段時(shí)期血細(xì)胞分析的主要信息載體和處理對象。

（4）血細(xì)胞分析已經(jīng)從簡單的物理性能的研究轉(zhuǎn)向?qū)?xì)胞內(nèi)部化學(xué)性質(zhì)及免疫性質(zhì)的方向發(fā)展，即從細(xì)胞學(xué)向分子生物學(xué)，從分子生物學(xué)向免疫學(xué)方向發(fā)展。

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