BVDV1型和2型焦磷酸測序檢測方法的建立

劉海生，張永強，趙永剛，吳延功，王清華，任煒杰，呂 艷，劉春菊，王志亮，單 虎

（1.青島農(nóng)業(yè)大學山東省獸藥診斷試劑工程技術(shù)研究中心山東省高校預(yù)防獸醫(yī)學重點試驗室，山東 青島 266109；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東 青島 266032）

牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）屬于黃病毒科，瘟病毒屬，同屬成員還包括豬瘟病毒（CSFV）和羊邊界病毒（BDV）。根據(jù)病毒5'-UTR基因序列可將BVDV分為BVDV 1型和BVDV 2型。

牛病毒性腹瀉/黏膜病是BVDV引起的以牛發(fā)熱、黏膜糜爛潰瘍、白細胞減少、腹瀉、咳嗽及懷孕母牛流產(chǎn)或產(chǎn)出畸形胎兒為主要特征的傳染病。BVDV已被國內(nèi)外廣泛地研究報道，致病型BVDV 1常在免疫過疫苗的牛群中引起一過性發(fā)熱和下痢，BVDV 2型的強毒株常引起牛急性感染，表現(xiàn)為發(fā)燒、腹瀉、血小板減少癥、出血、呼吸失調(diào)、高流產(chǎn)率和高死亡率，另外，它還能引起懷孕后期母牛的流產(chǎn)、死胎和新生小牛的先天畸形、免疫抑制等[1-3]。持續(xù)感染牛（PI）是BVDV在牛群中持續(xù)存在和突然暴發(fā)的主要原因。PI牛除了引起奶牛腹瀉、流產(chǎn)外，與正常牛相比，還會出現(xiàn)體重增重減少、繁殖率大大降低、死亡率高、奶牛屢配不孕等情況。BVD的存在會給牧場造成極大的經(jīng)濟損失[4]，嚴重影響著畜牧業(yè)的發(fā)展。

BVDV的診斷方法主要有病毒的分離鑒定，ELISA和real-time RT-PCR等方法。病毒分離鑒定是BVDV的經(jīng)典診斷方法，但存在操作繁瑣，診斷時間較長（1周或更長時間）等不足。ELISA抗原檢測方法具有特異性強、重復(fù)性好等特點，同時具有敏感性差等缺點，不能檢測出牛的BVDV一過性感染。real-time RT-PCR是BVDV常用的病原檢測和分型方法，國外已經(jīng)建立了雙重熒光real time RT-PCR檢測方法[5]，但是存在易污染，出現(xiàn)假陽性等問題。本研究建立的BVDV 1型和2型焦磷酸測序檢測方法能直接讀取檢測樣品的基因序列，實現(xiàn)快速確診BVDV，對于BVDV的分型、流行病學調(diào)查以及凈化具有重要意義。

1 材料

1.1 病毒和樣品 BVDV-BA株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；牛冠狀病毒（BCV）、牛輪狀病毒(BRV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛病毒腹瀉病毒2型（BVDV2）和豬瘟病毒（CSFV）由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心保存，腸出血性大腸桿菌(EHEC)由青島農(nóng)業(yè)大學保存，天津某規(guī)?；膛?6份抗凝血樣品。

1.2 主要試劑和儀器 Transcriptor One-Step RTPCR Kit，High Pure Viral RNA Kit，購自 Roche 公司；IDEXX BVDV Ag Serum Plus病原檢測試劑盒，購自IDEXX公司；Pyro Gold SQA Reagents 1×96 Pyromark ID，購自Biotage AB公司；PyroMark Q96 MD儀器，購自QIAGEN公司。

2 方法

2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中BVDV 1、BVDV 2和BDV的5′-UTR基因序列，運用PSQ Assay Design軟件分析，設(shè)計一對通用擴增引物和分別針對BVDV1和2型的兩條測序引物，其中通用引物的下游引物在5端采用生物素標記。引物均從上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。本研究中所用的引物及其序列詳見表1、表2。

表1 擴增引物的序列

表2 測序引物及序列

2.2 RNA提取 采用Roche公司生產(chǎn)的High Pure Viral RNA Kit提取BVDV-BA、BVDV-2、BCV、BRV、IBRV和CSFV的RNA。使用煮沸裂解法提取腸出血性大腸桿菌(EHEC)和腸炎沙門菌的DNA。提取的核酸立即用于RT-PCR擴增或置-80℃保存。

2.3 RT-PCR擴增條件優(yōu)化和待測樣品制備 以提取的病毒RNA為模板，不同退火溫度梯度進行RT-PCR反應(yīng)，取5 μL擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

以最優(yōu)反應(yīng)條件，分別以BVDV 1型和2型核酸為模板進行RT-PCR，擴增產(chǎn)物分為2份，1份用于焦磷酸測序，另1份送交測序公司測序。

2.4 焦磷酸測序反應(yīng)

2.4.1 測序單鏈模板的制備 根據(jù)Gene Company Limited公司的焦磷酸測序反應(yīng)操作說明書制備測序單鏈模板。將45 μL RT-PCR單鏈模板分別加入到PSQ 96板的兩個孔中，其中一個孔含有45 μL 1型測序引物，另一個孔含有45 μL 2型測序引物，并在85℃的烘箱中放置2 min，取出冷卻后就可進行焦磷酸測序。

2.4.2 測序反應(yīng) 根據(jù)PSQTM 96MA System儀器的軟件說明書在試劑艙中分別加入的底物APS、dNTP和酶混合物(DNA聚合酶、熒光素酶、ATP硫酸化酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶)；然后將試劑艙和PSQ 96板放入PSQ TM 96 MD Sys tem儀器中，進行Pyrosequencing反應(yīng)。

2.5 特異性試驗 以BVDV-BA、BVDV-2、BCV、BRV、IBRV、CSFV、EHEC和Salmonella enteritidis的核酸為模板，用優(yōu)化好的RT-PCR反應(yīng)條件進行擴增，取5 μL擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

用1型和2型測序引物分別對上述RT-PCR產(chǎn)物進行焦磷酸測序反應(yīng)。

2.6 重復(fù)性試驗 將擴增的RT-PCR產(chǎn)物分別進行3次焦磷酸測序，比較每次測得的序列結(jié)果，確定試驗的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.7 焦磷酸測序檢測方法在臨床樣品上的應(yīng)用

從牛場采集86份抗凝血，使用Roche公司生產(chǎn)的High Pure Viral RNA Kit提取RNA，進行RT-PCR擴增，取5 μL進行凝膠電泳鑒定，陽性樣品進行焦磷酸測序。同時使用BVDV Ag Serum Plus檢測86份樣品，將陽性樣品提取核酸，使用文獻[6]中引物進行RTPCR擴增，將擴增結(jié)果送交公司測序。

3 結(jié)果

3.1 RT-PCR擴增條件優(yōu)化結(jié)果 優(yōu)化后的RTPCR反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94℃預(yù)變性7 min；94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 15 s，45個循環(huán)；68℃ 7 min。

3.2 RT-PCR反應(yīng) 采用擴增引物對BVDV 1和2型2株病毒進行RT-PCR擴增，結(jié)果均能擴增出與目的條帶大小相符的特異性條帶（圖1）。

3.3 焦磷酸測序反應(yīng) BVDV 1和2型的焦磷酸測序反應(yīng)每次均能測序到30個堿基以上，完全能用于BVDV的快速鑒定和分型。焦磷酸測序結(jié)果與普通測序結(jié)果完全一致，符合率為100%，序列測定結(jié)果圖略；證明該試驗具有很好的特異性（圖2）。

3.4 特異性鑒定結(jié)果 以BCV、BRV、IBRV、CSFV、EHEC和沙門菌的核酸為模板的RT-PCR電泳結(jié)果沒有條帶，以BVDV 1型和2型為模板的RTPCR電泳結(jié)果顯示有惟一目的條帶，大小符合預(yù)期（圖3）。

在焦磷酸測序儀中1型測序引物只與1型的RT-PCR產(chǎn)物結(jié)合，2型測序引物只與2型的RTPCR產(chǎn)物結(jié)合。本試驗具有良好的特意性。

3.5 重復(fù)性試驗結(jié)果 對每個RT-PCR產(chǎn)物進行3次重復(fù)性檢測，檢測的結(jié)果均一致，證明該方法有很好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

3.6 焦磷酸測序檢測方法在臨床樣品上的應(yīng)用結(jié)果 對86份樣品進行焦磷酸測序，結(jié)果顯示，有2份BVDV 1型陽性（圖4），沒有BVDV 2型。與IDEXX BVDV Ag Serum Plus檢測的陽性樣品測序結(jié)果一致。說明該奶牛場感染了BVDV 1型。

4 討論

BVDV能引起牛腹瀉、血小板減少、繁殖障礙、免疫耐受等癥狀，甚至可以引發(fā)黏膜病，給世界養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。PI牛是牛場中的主要危害，PI牛能長期帶毒、排毒，部分PI牛無典型臨床癥狀，嚴重影響了牛群中PI牛的清除工作。

陳備娟等（2010）對我國11個省市的規(guī)模奶牛場進行BVDV感染情況的調(diào)查，抽樣檢測了57個規(guī)模奶牛場的大缸奶樣，抗體陽性的場有48個，陽性率為84.2%，表明了BVDV在奶牛場具有非常高的感染率[7]。我國需要建立一種準確、快速、高通量的檢測方法，用于牛群中BVDV的檢測和凈化。

焦磷酸測序技術(shù)(Pyrosequencing)是近年發(fā)展起來的一種能夠通過對基因序列測序?qū)崿F(xiàn)檢測和確診的新型檢測技術(shù)，具有高通量、快速、敏感等特點[8]，與普通RT-PCR和real time RT-PCR等檢測技術(shù)相比，本技術(shù)無需將PCR產(chǎn)物送交公司測序以便確診，從而大大減少了病原確診時間。目前該技術(shù)在人乳頭瘤病毒和單純皰疹病毒快速分型上已得到成功應(yīng)用。

本研究比對了GenBank中絕大多數(shù)BVDV 5′UTR序列，設(shè)計的擴增引物為BVDV通用引物，能同時擴增出BVDV 1和2型的目的基因片段。針對BVDV1和2型分別設(shè)計的測序引物有12個堿基不同，不能與另外1個型發(fā)生非特異性結(jié)合，但與本型毒株則能很好的結(jié)合，具有良好的特異性。由于此方法得到的數(shù)據(jù)為基因序列圖譜，排除了結(jié)果為CSFV或BDV的假陽性。本試驗發(fā)現(xiàn)，在測序反應(yīng)中，將測序引物濃度從0.3 mol/L調(diào)至0.6 mol/L時，能得到峰值更高的圖形與結(jié)果。

焦磷酸測序方法對PCR擴增產(chǎn)物的濃度與純度有一定的要求，因此該方法的敏感性低于國外常用的熒光定量分型方法。一過性感染BVDV牛的早期和末期，由于血液中病毒含量少，該方法存在漏檢的可能性。但是PI牛長期大量的排毒，病毒含量高，該方法完全可以用于牛場持續(xù)性感染牛（PI）的凈化。

此外，使用IDEXX BVDV Ag Serum Plus對某奶牛場的86份抗凝血進行了檢測，將陽性結(jié)果的抗凝血提取核酸，RT-PCR擴增，并送到公司測序。得到的測序結(jié)果與焦磷酸測序結(jié)果一致，對序列進行進化樹分析顯示，2份陽性病料均為BVDV 1型。

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