中草藥及復(fù)方制劑對3種致病菌及枯草芽孢桿菌J-4的體外抑菌研究

秦桂芳，魏 萌，韓愈杰，王榮杰，吳國江，郝慶紅，郭云霞，侯淑梅

（1.河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001；3.河北-獸藥業(yè)有限公司，河北 石家莊 052460；4.河北省阜平縣發(fā)展改革局，河北 阜平 073200）

大腸桿菌、沙門菌、痢疾桿菌為腸道常見致病菌，其中大腸埃希菌[1]發(fā)病率最高，其次為沙門菌和痢疾桿菌，臨床表現(xiàn)為胃腸炎、傷寒和中毒性休克等[2-3]?？股刂委熀螅扔邪Y狀好轉(zhuǎn)，繼而惡化，常為本病的重要特征，為此人們趨向于選用傳統(tǒng)的中草藥[4-5]對該病進(jìn)行防控。一方面可以很好控制疾病，同時(shí)也可避免抗生素對有益菌的殺滅作用[6-7]，以提高有益菌對腸道菌群平衡調(diào)節(jié)作用，抑制致病菌生長，減少腸道疾病發(fā)生[8-9]。

本研究選用二妙丸、太無神術(shù)散方劑中藥物，觀察單味藥物及方劑對大腸桿菌、沙門菌和痢疾桿菌等致病菌及枯草芽孢桿菌J-4的抑制作用，為開發(fā)安全、無殘留的微生態(tài)中藥制劑，提高食品安全和生態(tài)安全提供理論和應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種 雞源枯草芽孢桿菌J-4(Bacillus subtilis)、大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門菌（Salmonella）、痢疾桿菌（Shigella dysenteriae），均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)制藥工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 中草藥 黃柏、黃連、蒼術(shù)、藿香、穿心蓮、石菖蒲、陳皮、厚樸、生姜、大棗，均購自河北省安國中藥材市場。

1.3 培養(yǎng)基 NA：蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15-20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.2-7.4。NB：NA培養(yǎng)基去掉瓊脂即可。

1.4 中草藥提取液的制備 取中藥飲片或方劑藥物50 g，3～8倍蒸餾水浸泡1 h后煎煮，沸后文火加熱30 min，收集濾液，濾渣重煎2次，合并濾液并濃縮至50 mL（生藥含量為1g/mL），115℃下滅菌30 min，置4℃冰箱內(nèi)備用。

1.5 菌種活化 將菌種接種于NB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24 h，采用稀釋涂布法測定菌液濃度，并配制成菌含量為108CFU/mL的目標(biāo)菌液，備用。

1.6 單味中藥抑菌效果的測定 培養(yǎng)皿中倒入NB培養(yǎng)基，待凝固后，取目標(biāo)菌液0.1 mL均勻涂布于平板上，于表面等距離放置3個(gè)無菌牛津杯，分別加入中藥液50 μL，以蒸餾水為對照，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑，每種藥液做3個(gè)平行。

1.7 二妙丸、太無神術(shù)散抑菌效果的測定 取2%目標(biāo)菌液加入到溫度為58℃左右NA培養(yǎng)基中，搖勻，分別制備病原菌及J-4平板，并在各平板中等距離打孔7個(gè)，每孔加生藥液50 μL，以蒸餾水為對照，37℃培養(yǎng)18～24 h后，測量抑菌圈直徑，每種藥液做3個(gè)平行。

1.8 單味中藥及方劑對J-4增殖影響 取制備藥液加入NB培養(yǎng)基中，使其終濃度分別為2%、1%、0.5%、0.25%，按2%接種量接種J-4目標(biāo)菌液，37℃下培養(yǎng)24 h后在600 nm下測定菌液的OD值，每個(gè)濃度3個(gè)平行，以未接J-4的相應(yīng)中藥NB培養(yǎng)基調(diào)零，以不加中藥的J-4 NB培養(yǎng)基作為對照。

1.9 復(fù)配制劑抑菌效果的測定 在二妙丸和太無神術(shù)散原方比例基礎(chǔ)上，增加黃連和穿心蓮重新配伍，采用1.2.1方法制備，以蒸餾水為對照，觀察其抑菌效果。

1.10 中草藥MIC的測定 將中藥提取液用NB培養(yǎng)基2倍系列稀釋10個(gè)梯度，第11支試管作陽性對照，第12管作陰性對照，各管稀釋后的最終體積為1 mL，每管加菌懸液1 mL，置37℃培養(yǎng)18 h～24 h，觀察是否有菌生長，藥物稀釋管中清澈透明、無菌生長者為藥物對該菌的最小抑菌濃度。

2 結(jié)果和分析

2.1 單味中藥對致病菌和J-4的抑菌結(jié)果 見表1。

表1 單味中藥對致病菌和J-4抑制作用

從表1看出，對大腸桿菌，黃連、黃柏為高敏，抑菌圈直徑分別為17.00 mm、15.00 mm，穿心蓮、石菖蒲為中敏；陳皮、生姜為低敏；對沙門氏菌，石菖蒲為高敏，抑菌圈直徑為16.53 mm；黃柏、黃連為中敏外，其他均為低敏；對痢疾桿菌，均為低敏；而對J-4除黃連為中敏外，其他均為無效。

2.2 二妙丸、太無神術(shù)散對致病菌和J-4抑菌結(jié)果 見表2。從表2看出，太無神術(shù)散對三種致病菌強(qiáng)于二妙丸，對J-4為無效；二妙丸對J-4為低敏。

表2 二妙丸、太無神術(shù)散對致病菌及J-4抑菌結(jié)果

2.3 單味中藥及方劑對J-4增殖作用 見表3。由表3可知，2%太無神術(shù)散對J-4增殖效果最明顯；其他中藥對J-4增殖效果依次為石菖蒲＞藿香＞厚樸＞穿心蓮＞二妙丸＞黃柏＞大棗，而蒼術(shù)、陳皮則對J-4增殖不明顯，黃連和生姜則表現(xiàn)出抑制作用。

2.4 復(fù)配制劑抑菌效果測定結(jié)果 從表4看出，復(fù)配制劑對三種致病菌均表現(xiàn)為高敏，其中對大腸桿菌作用最強(qiáng)，可達(dá)到18.74 mm，對J-4表現(xiàn)為中敏。

表3 單味中藥與方劑對J-4的增殖作用

表4 復(fù)配制劑對致病菌及J-4抑菌結(jié)果

2.5 中藥MIC結(jié)果 見表5。由表5可知，復(fù)配制劑對3種致病菌的MIC最低，為3.9～7.8 mg/mL；對J-4，黃連的MIC最低，為125 mg/mL，而復(fù)配制劑對J-4 MIC為250 mg/mL。

表5 各中藥的MIC

3 討論

化學(xué)藥物長期使用，勢必增加細(xì)菌耐藥性，嚴(yán)重破壞機(jī)體器官各項(xiàng)機(jī)能，藥物殘留也給食品安全帶來隱患，因此人們逐漸將腸道疾病的防控轉(zhuǎn)向中藥和益生菌[10]?，F(xiàn)代研究證實(shí)，二妙丸具有解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛和促消化作用[11]，太無神術(shù)散臨床可用于治療胃腸炎、病毒感染[12]和消化機(jī)能障礙[13]等疾病，因此，對二妙丸、太無神術(shù)散進(jìn)行合并應(yīng)用，重新配伍成黃連2 g、穿心蓮9 g、黃柏、蒼術(shù)、陳皮各12 g，藿香、厚樸、石菖蒲各10 g，生姜4 g，大棗20 g，提高抗腸道疾病作用。

從試驗(yàn)結(jié)果看，蒼術(shù)、藿香、大棗對大腸桿菌、沙門菌、痢疾桿菌和J-4均無拮抗作用，石菖蒲、藿香有拮抗致病菌和促進(jìn)J-4增殖作用。太無神術(shù)散對3種致病菌抑制作用強(qiáng)于二妙丸，且對J-4生長無影響，太無神術(shù)散與二妙丸合并后，因增加黃連和穿心蓮可使其拮抗致病菌效果，尤其是對大腸桿菌的拮抗效果明顯高于單獨(dú)方劑，抑菌圈可達(dá)18.74 mm，MIC在3.9～7.8 mg/mL，復(fù)配制劑對J-4益生菌的抑菌圈為10.50 mm，為中敏，MIC為250 mg/mL，說明復(fù)配抑菌劑對致病菌抗菌作用強(qiáng)，對腸道益生菌殺滅作用微弱，這與李平蘭等[14]結(jié)果類似，表明復(fù)配制劑具有合生元的潛能，為進(jìn)一步開發(fā)中藥合生元奠定了基礎(chǔ)。

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