二甲苯對(duì)小鼠腦組織損傷的研究

張自強(qiáng)，劉玉梅，朱雪敏，位 蘭，李夢(mèng)云，司麗芳，李 健

（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng)，471003）

二甲苯屬于芳香烴類(lèi)，是一種無(wú)色透明、易揮發(fā)的液體，被廣泛應(yīng)用于樹(shù)脂及油漆等生產(chǎn)工藝中。隨著樹(shù)脂粘合劑、泡沫塑料、人造板材和油漆等的大量應(yīng)用，致使二甲苯污染日益嚴(yán)重，成為室內(nèi)空氣污染物的主要成分。研究表明，二甲苯的主要危害是影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并伴有頭痛、頭暈和惡心；還可影響造血機(jī)能，引起血液系統(tǒng)的疾病，是白血病的主要誘因，被世界衛(wèi)生組織確認(rèn)為有毒致癌物質(zhì)之一[1]。大量試驗(yàn)證實(shí)，二甲苯可損害眼角膜[2-3]、肝[4-5]、腎[4]、肺[5]、胚胎[6]等組織，但是二甲苯對(duì)腦組織的毒副作用尚缺乏詳細(xì)報(bào)道。本研究通過(guò)給小鼠注射不同濃度的二甲苯，觀察其對(duì)小鼠海馬組織形態(tài)的影響，并測(cè)定小鼠腦組織中超氧化物歧化酶（Total superoxide dismutase，T-SOD）活性和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，研究二甲苯致小鼠腦組織損傷情況，以進(jìn)一步揭示二甲苯對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒副作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明系小鼠，體重20±2 g，共96只，雌雄各半，購(gòu)自河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試驗(yàn)分組 將小鼠隨機(jī)分為4組，對(duì)照組和二甲苯低、中、高劑量組，每組24只。二甲苯低、中、高劑量組分別每天腹腔注射0.125、0.25、0.5 mL/kg二甲苯，對(duì)照組小鼠每日注射等量生理鹽水，連續(xù)注射15 d。

1.3 試驗(yàn)取材 小鼠連續(xù)注射二甲苯15 d后，禁食12 h，速眠新麻醉，打開(kāi)胸腔暴露心臟，剪開(kāi)右心耳，快速用生理鹽水灌注左心室，使小鼠體內(nèi)血液全部排出，迅速取出整個(gè)腦組織，一側(cè)大腦半球制成勻漿用于檢測(cè)T-SOD活性和MDA含量，另一側(cè)大腦半球保存于4%多聚甲醛溶液中，用于制作石蠟切片。

1.4 小鼠海馬組織切片的制作 小鼠大腦組織固定42 h后，脫水、透明、包埋于石蠟中，連續(xù)冠狀5 μm厚切片被制作，每組分別選取第310張到320張之間的切片，H.E.染色。為了觀察二甲苯對(duì)小鼠腦組織的毒性，不同組的小鼠，其同一位置切片的同一區(qū)域被拍照比較。

1.5 T-SOD活性和MDA含量的測(cè)定 將4組小鼠取出的新鮮腦組織在電子天平上稱重，加入適當(dāng)?shù)纳睇}水，研磨配成5%和10%勻漿。按照試劑盒上的說(shuō)明書(shū)配制并測(cè)定腦組織內(nèi)T-SOD活性和MDA含量，再用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定每組小鼠腦組織蛋白含量，其結(jié)果分別以U/mg prot及nmol/mL表示。

1.6 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間差異采用LSD多重比較，顯著水平為P＜0.05。試驗(yàn)結(jié)果均以X±SD表示。

2 結(jié)果

2.1 二甲苯對(duì)小鼠海馬齒狀回和CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)的影響 小鼠切片H.E.染色結(jié)果顯示，對(duì)照組海馬齒狀回和CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊，緊密，形態(tài)正常，無(wú)變性，無(wú)膠質(zhì)細(xì)胞增生，核大而圓，輪廓清晰，呈均勻淡藍(lán)色或藍(lán)色，核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富（圖1A和圖2A）；二甲苯低劑量（0.125 mL/kg）組小鼠海馬結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，細(xì)胞形態(tài)良好，無(wú)明顯變性細(xì)胞（圖1B和圖2B），與對(duì)照組差異不明顯。二甲苯中劑量組（0.25 mL/kg）小鼠海馬齒狀回細(xì)胞排列不規(guī)則，有部分細(xì)胞染色加深、出現(xiàn)核固縮，CA1區(qū)細(xì)胞間隙增大、排列松散（圖1C和圖2C）；二甲苯高劑量組（0.5 mL/kg）小鼠海馬齒狀回和CA1區(qū)細(xì)胞排列稀疏紊亂，細(xì)胞脫失明顯，甚至僅見(jiàn)少量殘存的不規(guī)則細(xì)胞，較多神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核溶解、細(xì)胞間隙擴(kuò)大，排列松散，細(xì)胞輪廓不清晰（圖1D和圖2D）。

2.2 二甲苯對(duì)小鼠腦組織T-SOD活性和MDA含量的影響 二甲苯對(duì)小鼠腦組織T-SOD活性和MDA含量的影響見(jiàn)表1。由表1可知，對(duì)照組小鼠腦組織T-SOD活性為77.61 U/mg prot，二甲苯腹腔注射后，小鼠腦組織T-SOD分別降低了4.20%、22.97%和32.16%，與對(duì)照組相比，中、高劑量的二甲苯能引起小鼠腦組織T-SOD活性顯著降低。對(duì)照組小鼠腦組織MDA含量3.61 nmol/mg prot，二甲苯腹腔注射后，小鼠腦組織MDA含量分別升高了23.27%、83.93%和94.74%，與對(duì)照組相比，中、高劑量的二甲苯能引起小鼠腦組織MDA含量顯著升高。

表1 二甲苯對(duì)小鼠腦組織T-SOD活性和MDA含量的影響 （X±SD）

3 討論

研究證實(shí)，腦組織比其他任何組織器官更容易受到毒物的攻擊，這是由于腦組織具有較高的需氧量、高水平的不飽和脂質(zhì)、極高的代謝率。大量研究表明，體內(nèi)外很多因素都易引起腦組織的損傷。Silvia等人報(bào)道，乙醇能通過(guò)激活神經(jīng)免疫系統(tǒng)和Toll樣受體，從而引起神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)不良，最終誘發(fā)腦組織損傷[7]；Kim等人證實(shí)了慢性冷刺激能誘發(fā)海馬細(xì)胞凋亡、活性氧自由基增多以及腦組織脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高[8]。文獻(xiàn)表明，二甲苯具有廣泛的生物毒性，可損害眼角膜、肝、腎、肺、卵巢等組織，且對(duì)妊娠及胚胎發(fā)育具有毒性作用。流行病學(xué)調(diào)查[1，9]顯示，經(jīng)常接觸二甲苯的生產(chǎn)工人，神經(jīng)行為明顯改變，表現(xiàn)為記憶力減退，視覺(jué)反應(yīng)時(shí)延長(zhǎng)，焦慮及嗜睡等，并隨著接觸時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，在脫離接觸二甲苯一段時(shí)間后癥狀可有所緩解。本文通過(guò)給小鼠腹腔注射不同劑量的二甲苯15 d后，觀察發(fā)現(xiàn)，中、高劑量組部分小鼠出現(xiàn)角弓反張，后肢麻痹托地，行走不穩(wěn)，不能站立，瞳孔放大，全身震顫抽搐不止，抓耳撓頭，煩躁不安，部分出現(xiàn)扎推，精神抑郁等癥狀（圖片未顯示）。可見(jiàn)，二甲苯對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有毒性作用。

大腦海馬區(qū)是大腦中與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的區(qū)域，其齒狀回、CA1區(qū)和CA3區(qū)在長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的三突觸回路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究表明，體內(nèi)外很多致病因素如衰老、自由基等很容易引發(fā)海馬區(qū)的損傷[10-11]。由此，本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔注射高劑量的二甲苯后腦組織海馬齒狀回和CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞核溶解，壞死脫失較多，結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞層數(shù)明顯減少，排列紊亂，出現(xiàn)胞漿深染、核固縮等一系列病理變化。分析其原因，可能是由于二甲苯具有揮發(fā)性強(qiáng)和脂溶性高等特征，其穿過(guò)血腦屏障后，促使細(xì)胞膜和質(zhì)膜中的脂類(lèi)物質(zhì)溶解，從而引起神經(jīng)細(xì)胞的功能損傷所致。有文獻(xiàn)報(bào)道，二甲苯能夠增加體外原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）漏出率[1]，推測(cè)二甲苯能夠引起細(xì)胞膜損傷，增加細(xì)胞膜的通透性；當(dāng)加入神經(jīng)節(jié)苷酯后，神經(jīng)細(xì)胞損傷程度有所緩解，而神經(jīng)節(jié)苷酯是神經(jīng)細(xì)胞膜的主要成分之一，可見(jiàn)二甲苯很可能穿過(guò)血腦屏障后通過(guò)損傷神經(jīng)細(xì)胞膜而誘發(fā)神經(jīng)毒性。另有資料證實(shí)，苯可通過(guò)上調(diào)Bax蛋白和下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)誘發(fā)小鼠睪丸細(xì)胞凋亡[12]，由此推測(cè)二甲苯很可能也會(huì)通過(guò)影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)而損傷腦組織。

由于腦組織內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)相對(duì)缺乏（各種抗氧化酶活力低），因此極易受到自由基的攻擊[13，14]。由此本研究進(jìn)一步從氧化應(yīng)激角度揭示二甲苯對(duì)腦組織的毒性。結(jié)果表明，二甲苯能夠引起小鼠腦組織T-SOD活性降低，MDA含量升高，且隨著劑量的增加，這種變化越明顯。SOD是機(jī)體細(xì)胞抵御氧化損傷最重要的酶類(lèi)之一，主要功能是清除體內(nèi)有氧代謝產(chǎn)生的超氧自由基，使機(jī)體免受損害[15]，說(shuō)明二甲苯致使小鼠腦組織清除超氧自由基的能力降低，從而造成了腦組織損傷，繼而會(huì)誘發(fā)形態(tài)發(fā)生病變。MDA是機(jī)體內(nèi)氧自由基攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物[16]，測(cè)試MDA含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，而脂質(zhì)過(guò)氧化是一個(gè)發(fā)生在細(xì)胞膜性組分并由自由基介導(dǎo)可導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、組織內(nèi)容物外溢、細(xì)胞死亡的過(guò)程，由此本研究進(jìn)一步推測(cè)二甲苯最終可能是通過(guò)破壞了神經(jīng)細(xì)胞的膜性成分而引起腦組織損傷。神經(jīng)細(xì)胞中膜受體是影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵成分，而二甲苯是否通過(guò)影響膜受體的功能繼而阻礙神經(jīng)細(xì)胞間的信號(hào)傳遞還需進(jìn)一步研究。

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